溫聰穎， 訾 敏， 張瑞巧， 趙令今

（1.中國(guó)石油大學(xué)（華東）理學(xué)院，山東青島266580；2.青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東青島266100）

0 引 言

化學(xué)是一門以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的科學(xué)，實(shí)驗(yàn)教學(xué)至關(guān)重要［1-2］，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系有助于培養(yǎng)學(xué)生的基本實(shí)驗(yàn)技能，但不利于提高學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰涂蒲兴仞B(yǎng)［3-5］，綜合研究型實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成為傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的有益且必要的補(bǔ)充［6-8］。近年來(lái)，基于磁性納米材料的分離技術(shù)在分離和富集領(lǐng)域展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景，分離對(duì)象可以是離子、小分子、生物大分子、病毒、細(xì)菌、細(xì)胞等［9-11］。相比于傳統(tǒng)的化學(xué)分離技術(shù)，磁分離方法具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)［12-13］。因此，作為相關(guān)專業(yè)的大學(xué)生，非常有必要了解這方面的前沿知識(shí)并熟悉相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作?；诖?，結(jié)合前期的科研工作［14-16］，本文設(shè)計(jì)了磁性納米探針的構(gòu)建及其對(duì)細(xì)菌分離應(yīng)用綜合研究型實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)將磁性納米顆粒包埋到高分子球內(nèi)部制得具有優(yōu)良超順磁性的磁性納米球，并通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)在磁球表面修飾大腸桿菌抗體，利用抗體對(duì)抗原的識(shí)別作用實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的特異高效的捕獲和分離。一方面該實(shí)驗(yàn)將材料合成、表征、修飾、應(yīng)用形成一套完整的科研訓(xùn)練過(guò)程，極大地培養(yǎng)了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能、科研素養(yǎng)和創(chuàng)新精神；另一方面該實(shí)驗(yàn)涉及磁性納米材料、細(xì)菌分離等科學(xué)研究熱點(diǎn)，有助于學(xué)生了解科學(xué)前沿進(jìn)展并體會(huì)科學(xué)研究的魅力，從而激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性以及從事科學(xué)研究的興趣。目前，該實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在我校化學(xué)專業(yè)學(xué)生中示范開(kāi)展，并取得了較好的教學(xué)效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

試劑：氯仿、正丁醇、正己烷、乙醇、氯化鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；小鼠源抗大腸桿菌抗體、cy3染料標(biāo)記的兔抗小鼠抗體、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、Hoechst 33342染色劑等購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；細(xì)菌培養(yǎng)基購(gòu)自O(shè)xoid公司；大腸桿菌、芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌由中國(guó)石油大學(xué)（華東）生物中心提供；油溶性磁性納米顆粒、表面帶羧基的多孔高分子球由本課題組合成［14］。

儀器：恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱，生物超凈工作臺(tái)，超聲波清洗器，熒光倒置顯微鏡，磁力架，透射電子顯微鏡，分析天平，細(xì)菌比濁儀等。

1.2 磁性納米球的制備

取1.8 mL多孔高分子球于離心管中，16 000 r/min離心30 min，去掉上清，晾置5 min得到高分子球沉淀；與此同時(shí)，取500μL油溶性磁性納米顆粒，加入1.5 mL乙醇，12 000 r/min離心5 min，去掉上清，晾置5 min得到磁性納米顆粒沉淀；用600μL溶脹劑（570 μL正丁醇＋30μL氯仿配制而成）超聲分散磁性納米顆粒，然后加入到高分子球沉淀中，繼續(xù)用超聲波清洗器超聲30 min；用正己烷離心洗滌1次，乙醇離心洗滌2次；將所得沉淀分散到1 mL超純水中，超聲1 h，靜置過(guò)夜取上清即得磁性納米球。

1.3 磁性納米球的生物功能化

取250μL磁性納米球，用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 6.8）通過(guò)磁分選洗滌2次，分散到500μL磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 6.8）中，超聲分散均勻；同時(shí)用500μL磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 6.8）溶解10 mg EDC和5 mg NHS后迅速加入到磁性納米球中；混勻后置于搖床上150 r/min室溫反應(yīng)30 min；將上述磁性納米球用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）洗滌2次，分散到1 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）中，加入50μg大腸桿菌抗體，置于搖床上150 r/min室溫反應(yīng)4 h；將產(chǎn)物用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）洗滌5次，即得抗大腸桿菌免疫磁球，將其分散到250μL生理鹽水中，存于4°C冰箱待用。

1.4 細(xì)菌的培養(yǎng)、計(jì)數(shù)與染色

將大腸桿菌、芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌以劃線法分別接種到麥康凱（MacConKey）瓊脂培養(yǎng)基上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落分散到生理鹽水中制得細(xì)菌懸液，通過(guò)麥?zhǔn)媳葷岱刂萍?xì)菌懸液濃度約為108CFU/mL（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?。?xì)菌懸液準(zhǔn)確濃度的測(cè)量通過(guò)定量接種進(jìn)行，具體操作為：將細(xì)菌懸液稀釋105倍，取100μL稀釋液定量接種到MH瓊脂培養(yǎng)基上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)即換算為細(xì)菌原液的濃度。需要注意的是，細(xì)菌培養(yǎng)要保證無(wú)菌操作，以避免其他雜菌的污染。利用Hoechst 33342對(duì)細(xì)菌的DNA進(jìn)行染色，具體操作為：在細(xì)菌懸液中加入Hoechst 33342，使Hoechst 33342的終濃度為30 μg/mL，置于37°C恒溫?fù)u床上，避光反應(yīng)30 min。

1.5 磁性納米球?qū)?xì)菌的捕獲和分離

將抗大腸桿菌免疫磁球加入到大腸桿菌懸液中，置于恒溫?fù)u床上37°C下孵育30 min，利用磁力架進(jìn)行磁分選，并用生理鹽水洗滌3遍，收集捕獲產(chǎn)物進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。①將捕獲產(chǎn)物分散到超純水中，取10μL滴到碳支持膜上，放置過(guò)夜晾干，用透射電鏡進(jìn)行觀察；②將捕獲產(chǎn)物用Hoechst 33342進(jìn)行染色，置于熒光顯微鏡下通過(guò)紫外光激發(fā)進(jìn)行觀察；③對(duì)加入的細(xì)菌的數(shù)量（N0）和捕獲后清液中剩余的細(xì)菌的數(shù)量Ns進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，通過(guò)下式計(jì)算捕獲率：

為了考察捕獲的特異性，同時(shí)將抗大腸桿菌免疫磁球加入到芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的懸液中，在搖床上孵育30 min后進(jìn)行磁分選，收集捕獲產(chǎn)物染色后通過(guò)顯微鏡進(jìn)行觀察，并計(jì)算捕獲效率。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性納米球的表征

本文所使用的高分子聚合物納米球表面親水，富含羧基，內(nèi)部為疏水結(jié)構(gòu)，在溶脹劑的作用下可以產(chǎn)生疏水空腔，通過(guò)超聲作用，油溶性的磁性納米粒子進(jìn)入疏水空腔中，將納米球轉(zhuǎn)移到水相后，納米球迅速縮小，從而將磁性納米粒子禁錮在高分子球內(nèi)部，制得磁性納米球。從磁性納米球的透射電鏡圖（圖1（a））可以看出，納米球的尺寸在250 nm左右，表面較為光滑平整，內(nèi)部含有襯度更大的小顆粒，從而直觀地證明了磁性納米粒子進(jìn)入了高分子球內(nèi)部。進(jìn)一步對(duì)磁性納米球的磁性能進(jìn)行表征：磁性納米球的磁滯回線（圖1（b））表明磁性納米球具有優(yōu)良的超順磁性，其矯頑力幾乎為零，飽和磁化強(qiáng)度達(dá)到19.3 A·m2/kg；且其磁響應(yīng)迅速，將磁性納米球懸液用磁鐵吸引2 min，幾乎所有的磁性納米球均被吸引到靠近磁鐵的管壁上（圖1（c）），因此可以通過(guò)磁鐵方便地操縱磁性納米球。

圖1 （a）磁性納米球的透射電鏡圖；（b）磁性納米球的磁滯回線圖；（c）磁性納米球在磁力架（磁鐵）吸引不同時(shí)間下的照片

由于磁性納米粒子包埋到高分子球內(nèi)部，因此高分子球表面的羧基幾乎不受影響，通過(guò)活化可以實(shí)現(xiàn)與抗體表面氨基的共價(jià)偶聯(lián)。利用免疫熒光的方法驗(yàn)證了抗體是否成功偶聯(lián)到磁性納米球上：通過(guò)將未修飾的磁球和偶聯(lián)了小鼠源抗大腸桿菌抗體的免疫磁球分別與cy3染料標(biāo)記的兔抗小鼠抗體孵育，磁分離并洗滌后，利用熒光顯微鏡觀察磁球表面是否存在cy3的紅色熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，未修飾的磁球沒(méi)有熒光，而免疫磁球表面呈現(xiàn)出cy3的紅色熒光。這表明cy3標(biāo)記的兔抗小鼠抗體（二抗）沒(méi)有和未修飾磁球發(fā)生反應(yīng)，而與偶聯(lián)了小鼠源抗大腸桿菌抗體（一抗）的免疫磁球發(fā)生了免疫親和反應(yīng)，從而證明了小鼠源抗大腸桿菌抗體被成功地修飾到磁球表面。

圖2 （A-B）未修飾的磁性納米球和cy3標(biāo)記的兔抗小鼠抗體作用后的顯微鏡明場(chǎng)圖片和對(duì)應(yīng)的熒光場(chǎng)圖片；（C-D）偶聯(lián)了抗體的免疫磁球和cy3標(biāo)記的兔抗小鼠抗體作用后的顯微鏡明場(chǎng)圖片和對(duì)應(yīng)的熒光場(chǎng)圖片

2.2 磁性納米球?qū)?xì)菌捕獲和分離效果

將免疫磁球分別加入到大腸桿菌懸液、芽孢桿菌懸液和金黃色葡萄球菌懸液中，反應(yīng)后將捕獲產(chǎn)物用DNA染料Hoechst 33342進(jìn)行染色，置于熒光顯微鏡下觀察，如圖3（A～F）所示，只有大腸桿菌組出現(xiàn)藍(lán)色熒光點(diǎn)，即為Hoechst 33342與大腸桿菌的DNA作用后在紫外光照射下發(fā)出的熒光，且與明場(chǎng)中磁球的團(tuán)聚有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，而芽孢桿菌組和金黃色葡萄球菌組都沒(méi)有出現(xiàn)藍(lán)色熒光且磁性納米球分散良好，從而證明免疫磁球成功地捕獲到大腸桿菌，而沒(méi)有捕獲芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌。進(jìn)一步對(duì)免疫磁球?qū)?xì)菌的捕獲率進(jìn)行了定量計(jì)算（見(jiàn)圖4），免疫磁球?qū)Υ竽c桿菌的捕獲率達(dá)到了96%以上，而對(duì)芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的捕獲率不足3%。以上實(shí)驗(yàn)表明免疫磁球具有良好的選擇性，可以通過(guò)抗原與抗體的結(jié)合特異性地識(shí)別和捕獲大腸桿菌。同時(shí)，采用透射電鏡對(duì)捕獲的大腸桿菌進(jìn)行表征，結(jié)果如圖5（A-B）所示，圖片中的球狀物體即為免疫磁球，桿狀物體即為被捕獲到的大腸桿菌，大腸桿菌表面分布有免疫磁球，透射電鏡圖更為直觀地展示了免疫磁球和大腸桿菌的成功結(jié)合，說(shuō)明免疫磁球能夠很好地識(shí)別目標(biāo)細(xì)菌。

圖3 （A-B）免疫磁球捕獲大腸桿菌后的顯微鏡明場(chǎng)圖片和對(duì)應(yīng)的熒光場(chǎng)圖片；（C-D）免疫磁球捕獲芽孢桿菌后的顯微鏡明場(chǎng)圖片和對(duì)應(yīng)的熒光場(chǎng)圖片；（E-F）免疫磁球捕獲金黃色葡萄球菌后的顯微鏡明場(chǎng)圖片和對(duì)應(yīng)的熒光場(chǎng)圖片

圖5 免疫磁球捕獲大腸桿菌的透射電鏡圖

3 結(jié) 語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)合成了具有優(yōu)良超順磁性的納米球，進(jìn)一步在其表面偶聯(lián)大腸桿菌抗體，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的特異高效的捕獲和分離。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容豐富，從材料制備修飾到表征應(yīng)用形成一套完整的科研訓(xùn)練過(guò)程，涉及到生物偶聯(lián)、熒光標(biāo)記、平板計(jì)數(shù)、免疫反應(yīng)、捕獲分離等常規(guī)的化學(xué)及生物操作技術(shù)，以及透射電鏡表征、熒光顯微鏡表征、磁性表征等常規(guī)的表征方法。本實(shí)驗(yàn)具有較強(qiáng)的綜合性、可操作性、前瞻性和新穎性，非常適合作為化學(xué)、生物、材料等相關(guān)專業(yè)的綜合實(shí)驗(yàn)。通過(guò)在本?；瘜W(xué)專業(yè)學(xué)生中示范開(kāi)展，學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目表現(xiàn)出極大的興趣和專注力，能夠積極主動(dòng)地完成課題，并準(zhǔn)確地分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果。經(jīng)過(guò)這一套完整的科研訓(xùn)練，不僅極大地培養(yǎng)了學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰头治鰡?wèn)題解決問(wèn)題的能力，而且有助于學(xué)生了解科學(xué)前沿并體會(huì)科學(xué)研究的魅力，從而激發(fā)其科研興趣并培育其科研素養(yǎng)。