陳 嵐，江圣圭，史鵬杰，蔡舒心，董志穎，孫連娜 （. 空軍杭州特勤療養(yǎng)中心療養(yǎng)三區(qū)藥械科，浙江 杭州3000；. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 003）

趕黃草（Penthori Chinensis Herba）在民間又名水澤蘭、水楊柳等，以其為原料制成的單味成方制劑肝蘇顆?，F(xiàn)收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑十三冊(cè)》附錄[1]。趕黃草是苗族的傳統(tǒng)藥物，主產(chǎn)于四川古藺，具有清熱、利濕、解毒、活血、平肝、健脾等功效[2]，可用于酒精性、非酒精性脂肪肝，淤積性、酒精性及其他誘導(dǎo)因素引起的肝損傷的保護(hù)和治療[3-13]。趕黃草中化學(xué)成分類型眾多，以黃酮類、萜類、酚酸類為其主要活性成分[14]。其中，具有以黃酮苷連接沒食子?；Y(jié)構(gòu)的大環(huán)多酚類化合物（圖1）喬松素-7-O-[4'', 6''-(S)-六羥基二苯甲?；鵠-β-D-葡萄糖苷（pinocembrin-7-O-[4'',6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose，PHG）、喬松素-7-O-[3''-O-沒食子?；?4'', 6''-(S)-六羥基二苯甲?；鵠-β-D-葡萄糖苷（pinocembrin-7-O-[3''-O-galloyl-4",6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-Dglucose，PGHG）、喬松素二氫查耳酮-7-O-[3''-O-沒食子?；?4'', 6''-(S)-六羥基二苯甲?；鵠-β-D-葡萄糖苷（pinocembrin dihydrochalcone-7-O-[3''-O-galloyl-4'',6''-(S)-hexahydroxydiphenoyl]-β-D-glucose or thonningianin A，THA）的肝保護(hù)及抗肝纖維化活性較強(qiáng)[15-17]，同時(shí)也具有較好的降糖活性[18]，有較高的開發(fā)價(jià)值，故本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定該3 種化合物的含量，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)選其提取工藝，為該類成分的進(jìn)一步開發(fā)研究提供前期基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 藥材來源

從四川收集3 批趕黃草藥材（表1），藥材經(jīng)課題組孫連娜副教授鑒定為虎耳草科植物扯根菜（Penthorum chinensePursh）的干燥地上部分。各批次藥材均留樣于上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與生物技術(shù)研究中心。

1.2 儀器與試劑

XS105DU 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；XS104 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；HDM-10000B 數(shù)顯電熱套（上海利聞科學(xué)儀器有限公司）；N-1 300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）；Milli-Q 純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）；1 200 型高效液相色譜儀（美國(guó) Agilent 公司）；Centrifuge 5810R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）。

PHG 對(duì)照品（批號(hào)：20 181 117）、PGHG 對(duì)照品（批號(hào)：20 181 103）、THA 對(duì)照品（批號(hào)：20 181 103）均由本實(shí)驗(yàn)室制備，且經(jīng)HPLC 歸一化法檢測(cè)表明純度均在98%以上；水為超純水；甲酸（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；乙醇、甲醇（分析純，上海泰坦科技股份有限公司 ）。

2 方法與結(jié)果

2.1 大環(huán)多酚類成分的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱定PHG、PGHG、THA 對(duì)照品，加80%甲醇分別制成對(duì)照品儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度分別為0.610 4、0.604 4、0.485 2 mg/ml。

2.1.2 供試品溶液的制備

取趕黃草藥材粉末（過3 號(hào)篩）1 g，精密稱定后轉(zhuǎn)移至250 ml 錐形瓶中，精密移取并加入80%甲醇水溶液100 ml，稱重確定初始重量，回流提取1 h，放至常溫，加溶劑補(bǔ)至初始重量，搖勻，取樣，過膜，取續(xù)濾液作供試品溶液。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）；洗脫條件：梯度洗脫（0～20 min，32%→50%A，20～25 min，50%→90% A，25～30 min：90%→32% A）；其他參數(shù)：流速為1 ml/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量為10 μl。在此色譜條件下，供試品溶液（圖2）中PHG、PGHG、THA 與其他成分均達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)以PHG 計(jì)不低于20 000。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（A-C）與藥材提取液（D）HPLC 圖

2.1.4 線性關(guān)系考察

取“2.1.1”項(xiàng)方法制備的混合對(duì)照品溶液，依次稀釋2、4、10、50、100 倍，分別按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以3 種成分的進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，分別進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，線性擬合得回歸方程。PHG、PGHG、THA 的回歸方程分別為：Y=18 575.798X+5.091 9（r=0.999 9），Y=21 923.382X+29.293 3（r=0.999 9），Y=21 544.589X?13.093 6（r=0.999 9），線性范圍依次是6.10～610.40、6.04～604.40、4.85～485.20 μg/ml，以上表明3 種化合物線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度考察

取對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣分析6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示PHG 峰面積的RSD 為1.15%，PGHG 峰面積的RSD 為0.18%，THA 峰面積的RSD 為0.12%，表明所用儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性考察

取趕黃草藥材（S3，過3 號(hào)篩）6 份，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，再分別按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果顯示樣品中PHG 的平均含量為5.83 mg/g，RSD為1.03%；PGHG 平均含量為9.99 mg/g，RSD 為0.91%；THA 平均含量為1.31 mg/g，RSD 為0.50%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察

取趕黃草藥材（S3，過3 號(hào)篩）1 份，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別放置0、4、8、12、24 h后取樣，按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示樣品中PHG、PGHG、THA 峰面積的RSD 分別為1.72%、2.44%和4.06%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率考察

取同一批趕黃草藥材（S3，過3 號(hào)篩）6 份，每份約0.5 g，精密稱定，按照藥材含有量1∶1 的比例，分別精密加入PHG、PGHG、THA 對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)條件進(jìn)行HPLC 分析，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示PHG、PGHG、THA 加樣回收率分別為102.04%、100.90%、101.55%，對(duì)應(yīng)的RSD 值分別為0.88%、0.82%、1.43%，表明該方法可靠。

2.1.9 趕黃草藥材的含量測(cè)定

取各批次趕黃草藥材（S1～S3，過3 號(hào)篩）各3 份，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液后按“2.1.3”項(xiàng)條件進(jìn)行HPLC 分析，記錄峰面積并計(jì)算含量（表2）。

表2 趕黃草中3 種化合物的含量（n=3）

2.2 提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 提取方法考察

取趕黃草藥材（S2）切成3～5 cm 小段，稱取50 g，加入60%乙醇溶液500 ml，分別采用浸漬法（浸漬24 h）、滲漉法（浸泡24 h 后以5 ml/min 的流速收集滲漉液）、回流法（加熱回流1 h）提取。結(jié)果表明，浸漬法平均總提取率為36.67%，滲漉法平均總提取率為36.82%，回流法平均總提取率為71.99%?？疾旖Y(jié)果為回流法提取效果最佳，因此選擇回流法作為提取方法。

2.2.2 正交試驗(yàn)[19-21]

在確定提取方法為回流法的基礎(chǔ)上，取趕黃草藥材（S2），選擇常規(guī)回流提取中對(duì)提取效果影響較大的因素：溶媒濃度（A）、提取時(shí)間（B）、溶媒用量（C）、提取次數(shù)（D）作為影響因素，每個(gè)因素各取3 個(gè)水平，在平行操作條件下，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)（表3）。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表

以PHG、PGHG、THA 的總提取率作為考察指標(biāo)得正交試驗(yàn)結(jié)果（表4），根據(jù)極差大小可以看出各因素對(duì)趕黃草中大環(huán)多酚類成分的影響大小為A>B>D>C；進(jìn)一步方差分析（表5）結(jié)果表明，溶媒濃度（A）對(duì)提取效果有顯著影響（P<0.05），而其他3 個(gè)因素?zé)o顯著影響（P>0.05）。因此，根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳組合為A3B1C3D2。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果表

表 5 方差分析表

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)比較并優(yōu)化了供試品溶液制備方法，并考察了不同型號(hào)色譜柱、不同檢測(cè)波長(zhǎng)、不同流動(dòng)相組成，在此基礎(chǔ)上建立了趕黃草中PHG、PGHG、THA 的HPLC 檢測(cè)方法，該法能使樣品中測(cè)定成分與其他成分達(dá)到有效分離，峰型好，可簡(jiǎn)便快速分析樣品，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

在建立含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行提取工藝優(yōu)化。從毒性大小、常用性角度選擇乙醇為溶媒，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示回流法提取效果最佳，因此選擇乙醇熱回流法作為提取方法，對(duì)常規(guī)熱回流法影響較大的4 個(gè)因素進(jìn)行3 個(gè)水平設(shè)置，建立L9（34）正交試驗(yàn)組，以便考察不同參數(shù)設(shè)定值對(duì)趕黃草中大環(huán)多酚成分提取率的影響。通過極差及方差分析發(fā)現(xiàn)溶媒濃度（A）即乙醇濃度對(duì)提取率有顯著性影響，而其他3 個(gè)因素（B、C、D）均無顯著性影響。經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)選后的最佳提取工藝為A3B1C3D2，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，從節(jié)約原料降低成本的角度，對(duì)無明顯影響的3 個(gè)因素進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，調(diào)整后的提取工藝為A3B2C1D2，即取趕黃草干藥材，切3～5cm小段，加入10 倍體積、濃度為80%的乙醇溶液，回流2 次，每次2 h。按照該工藝，取3 批藥材各5 kg，進(jìn)行3 次放大驗(yàn)證試驗(yàn)，提取率均在90%以上，且RSD 值為3.73%，說明該工藝穩(wěn)定可行，可為趕黃草中該類成分的進(jìn)一步開發(fā)研究打下基礎(chǔ)。