沈 越，張靜靜，杜 晶，曹 奇，劉 沖，錢(qián) 皎 （1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)：a. 長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部, b. 藥學(xué)院，上海，00433; . 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 濟(jì)寧，7686）

小膠質(zhì)細(xì)胞是一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的炎癥免疫相關(guān)細(xì)胞，相當(dāng)于中樞神經(jīng)器官（腦和脊髓）中的巨噬細(xì)胞[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞的生理作用是清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中受損的神經(jīng)組織、通過(guò)血腦屏障入侵中樞的感染源及異物等。在病理狀態(tài)下，已有多項(xiàng)研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，包括缺血性腦梗、多發(fā)性硬化、神經(jīng)退行性疾病等[2-3]。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎反應(yīng)對(duì)多種疾病的治療具有重要意義。

α7 n 型乙酰膽堿能受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR）是一種n 型乙酰膽堿能受體亞型，從屬于配體門(mén)控的離子通道受體家族[4]。從傳統(tǒng)意義上來(lái)說(shuō)，α7 n 型乙酰膽堿能受體位于神經(jīng)肌肉接頭后膜，接受傳出神經(jīng)末梢突觸釋放的化學(xué)遞質(zhì)（Ach）的作用，使得電信號(hào)繼續(xù)傳播。然而，近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，激動(dòng) α7 n型乙酰膽堿能受體可以參與膽堿能抗炎通路的激活，進(jìn)而在多種病理狀態(tài)下發(fā)揮抗炎作用[5]。目前研究已表明，α7 n 型乙酰膽堿能受體介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑制作用[6]。

與其他巨噬細(xì)胞一樣，小膠質(zhì)細(xì)胞也分為經(jīng)典活化的M1 型巨噬細(xì)胞和選擇性活化的M2 型巨噬細(xì)胞[7]。一般來(lái)講，M1 型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-18 等；而M2 型巨噬細(xì)胞主要分泌抗炎因子，如IL-4、IL-10、IL-13 等[8]。因此，在炎癥免疫相關(guān)疾病中，降低M1/M2 細(xì)胞的比例成為重要的治療手段。

自噬是生物體的一種重要的代謝機(jī)制，利用溶酶體降解自身受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的進(jìn)化上高度保守的過(guò)程[9]。自噬通常分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，由于大自噬的研究相對(duì)較多，在疾病中的作用也較為突出，因此，本研究主要討論大自噬的作用（后續(xù)將描述為“自噬”）。在自噬過(guò)程中，自噬小體形成，包裹細(xì)胞組分或入侵的病原體，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后自噬溶酶體將包裹的底物降解并釋放入胞漿供細(xì)胞重新利用[10]。已有報(bào)道，自噬具有抗炎的作用[11]。

由此，本課題組探究在小膠質(zhì)細(xì)胞中，α7 n 型乙酰膽堿能受體是否具有抗炎的作用，并且探究這一過(guò)程是否有調(diào)節(jié)M1 型與M2 型巨噬細(xì)胞的比例與誘導(dǎo)自噬過(guò)程的參與。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑與儀器

75%乙醇、異丙醇、甲醇、吐溫-80、20×PBS、BSA、Tris 堿、多聚甲醛、引物、LPS、DMEM 高糖培養(yǎng)基、抗LC3 抗體、抗Beclin-1 抗體、抗p62/SQSTM1 抗體、熒光二抗、DAPI 染料、氯仿、細(xì)胞/組織蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑（三聯(lián)裝）、甘氨酸、30%聚丙烯酰胺溶液、過(guò)硫酸銨、TEMED、1.5 mol/L Tris（pH 8.8）、1.5 mol/L Tris（pH 6.8）。JA2003 電子天平（上海天平儀器廠）；電熱恒溫水浴槽DK-8D（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；STS-8A 轉(zhuǎn)移脫色搖床（上海琪特分析儀器有限公司）；離心管（Corning 公司）；移液槍?zhuān)‥ppendorf 公司）；7500RT-PCR 儀器（Applied Biosystems 公司）；超純水儀（Millipore 公司）；熒光顯微鏡IX71（日本Olympus 公司）；錐形瓶；激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）；酶標(biāo)儀（瑞士Tacan 公司）；細(xì)胞操作超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；Odyssey 掃膜儀（LI-COR 公司）。

1.2 主要方法

1.2.1 BV2 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞系（美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)）。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)加入10% FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中。在實(shí)驗(yàn)中，我們提前10 min 加入PNU282987 孵育，后加入LPS（1 000 ng/ml）刺激BV2 細(xì)胞12 h。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR

提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用cDNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)，引物由上海生工生物合成，序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 引物序列

按規(guī)范程序設(shè)置PCR 儀，所得CT 值按照2–ΔΔCT公式計(jì)算。

1.2.3 Western blot

提取細(xì)胞/組織蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)加樣、跑膠、轉(zhuǎn)膜等步驟后，PVDF 膜孵育牛奶封閉3 h，后分別孵育一抗（4 ℃過(guò)夜）、二抗（35 min，避光），用PBST 液進(jìn)行漂洗后，置于Odyssey 掃膜儀中獲取Western blot 圖像。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光

取出經(jīng)過(guò)處理后的BV2 細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)基，加入PBS 液潤(rùn)洗，用4%多聚甲醛室溫孵育固定10 min，用PBS 液洗滌5 min×3 次，后用0.1% Triton X-100 室溫孵育5 min，用PBS 洗滌5 min×3 次；用山羊血清封閉室溫10 min，后孵育一抗（室溫1 h）、二抗（37 ℃，30 min，避光），加入DAPI 染核3 min，后用PBS 洗滌5 min×3 次，加入抗熒光淬滅劑后于激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 炎癥環(huán)境中激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體具有抗炎作用

首先，我們探究在小膠質(zhì)細(xì)胞中，α7 n 型乙酰膽堿能受體對(duì)炎癥反應(yīng)水平的影響。提前10 min加入PNU282987（10 μmol/L）孵育，后加入LPS（1 000 ng/ml）刺激BV2 細(xì)胞，刺激12 h 后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)檢測(cè)BV2 細(xì)胞的促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（圖1）。

從圖1 中可以看出，在LPS 的刺激下，小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 水平顯著增加，而應(yīng)用PNU282987 激動(dòng)α7nAChR 極大地降低了促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA水平。由此可以看出，炎癥環(huán)境中激動(dòng)α7nAChR在小膠質(zhì)細(xì)胞中的抗炎作用。

圖1 激動(dòng) α7 n 型乙酰膽堿能受體抑制BV2 細(xì)胞的促炎因子表達(dá) (n=3～5)

2.2 炎癥環(huán)境中激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1 型與M2 型比例

炎癥環(huán)境中激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體在小膠質(zhì)細(xì)胞中的抗炎機(jī)制。提前10 min 加入PNU282987（10 μmol/L）孵育，后加入LPS（1 000 ng/ml）刺激BV2 細(xì)胞，刺激12 h 后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)BV2 細(xì)胞的M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68、CD86 與M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206、Arg1 的mRNA 水平（圖2）。

從圖2 可以看出，在LPS 的刺激下，小膠質(zhì)細(xì)胞中M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68、CD86 的mRNA 水平顯著增加，而應(yīng)用PNU282987 激動(dòng)α7 n型乙酰膽堿能受體極大地降低了巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68、CD86 的mRNA 水平并增加了M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206、Arg1 的mRNA 水平。

圖2 激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體對(duì)BV2 細(xì)胞M1 型與M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的mRNA 水平影響 (n=3～5)

對(duì)BV2 細(xì)胞進(jìn)行同樣的處理，而后通過(guò)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)M1 型巨噬細(xì)胞比例（CD45+、CD68+細(xì)胞，圖3）與M2 型巨噬細(xì)胞比例（CD45+、CD206+細(xì)胞，圖4）。

從圖3 和圖4 可以看出，在LPS 的刺激下，小膠質(zhì)細(xì)胞中M1 型巨噬細(xì)胞比例顯著增加，而應(yīng)用PNU282987 激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體極大地降低了M1 型巨噬細(xì)胞的比例并增加了M2 型巨噬細(xì)胞的比例。

圖3 激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體對(duì)M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞比例的影響

圖4 激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體對(duì)M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞比例的影響

綜合圖2～4 的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，炎癥環(huán)境中激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1 型與M2 型比例，增加M2 型巨噬細(xì)胞的比例并降低M1 型巨噬細(xì)胞的比例。

2.3 炎癥環(huán)境中激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬水平

最后，我們探究炎癥環(huán)境中激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體的抗炎作用是否有自噬過(guò)程的參與。選用不同劑量的PNU282987，提前10 min 加入PNU282987（0.1、1、10 μmol/L）孵育，后加入LPS（1 000 ng/ml）刺激BV2 細(xì)胞，刺激12 h 后，通過(guò)Western blot 技術(shù)檢測(cè)BV2 細(xì)胞中的自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3-II/I 比例、p62/SQSTM1 表達(dá)水平（圖5）。

圖5 激動(dòng)α7nAChR 上調(diào)BV2 細(xì)胞自噬水平 (n=3)

從圖5 中可以看出，在LPS 的刺激下，小膠質(zhì)細(xì)胞中自噬水平顯著增加，而應(yīng)用PNU282987 激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體進(jìn)一步增加了自噬水平。由此可以看出，炎癥環(huán)境中激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體可以上調(diào)BV2 細(xì)胞的自噬水平。

3 討論

α7 n 型乙酰膽堿能受體介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路在多種炎癥免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠多發(fā)性硬化模型中，激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體可以發(fā)揮重要的抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的作用[12]。本研究在細(xì)胞水平應(yīng)用小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2 細(xì)胞，再次證明了α7 n 型乙酰膽堿能受體的抗小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的作用。

對(duì)于在小膠質(zhì)細(xì)胞中α7 n 型乙酰膽堿能受體抗炎作用的機(jī)制，本研究首次表明，其抗炎作用的實(shí)現(xiàn)有調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞比例的參與，即激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體可以上調(diào)具有抗炎作用的M2 型巨噬細(xì)胞并且下調(diào)M1型巨噬細(xì)胞的比例。這一結(jié)論為利用α7 n 型乙酰膽堿能受體激動(dòng)劑作用治療相關(guān)疾病的藥物提供了重要的理論依據(jù)。此外，我們也探討了自噬這一重要的抗炎機(jī)制是否參與了這一過(guò)程。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)得到了肯定的答案，與以往研究相一致，我們證明了上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬水平發(fā)揮抗炎作用。

由此我們得出，激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體可以發(fā)揮抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用，其作用的實(shí)現(xiàn)依賴(lài)于調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞比例和上調(diào)自噬水平。下一步，我們將通過(guò)單核巨噬細(xì)胞特異性敲除α7 n 型乙酰膽堿能受體的小鼠進(jìn)行研究，進(jìn)一步驗(yàn)證激動(dòng)α7 n 型乙酰膽堿能受體是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞比例和自噬水平，進(jìn)而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥發(fā)揮作用，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具說(shuō)服力。我們相信，這一研究將為開(kāi)發(fā)利用新的膽堿能抗炎藥物提供新的思路。