顧鑫慧 俞 超 王 碧 吳憶蘭 陳 煜 王金霓 汪財生

(浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江寧波 315100)

植物清蛋白是植物種子中的重要蛋白質，其沉降系數(shù)(s20.w)為2，分子量范圍為10～20 kDa。植物種子清蛋白可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，加熱產(chǎn)生凝固。植物種子清蛋白含有大量含硫氨基酸[1]，結構呈球狀并具有α－螺旋[2]。國內學者已采用連續(xù)分級提取法分離出一些植物種子中的清蛋白，如紫蘇籽[3]、文冠果種子[4]、花生[5]等，提取率約為10%～20%。植物種子清蛋白除為種子發(fā)芽和幼苗生長提供營養(yǎng)外，還具有多種功能活性，如辣木(Moringa oleifera)種子清蛋白是一種幾丁質結合蛋白，可抑制植物致病真菌的發(fā)芽和菌絲體生長[6]；靛木(Wrightia tinctoria)種子清蛋白是一種異二聚體蛋白，表現(xiàn)出抑菌和DNA 酶的活性[7]；蓖麻(Ricinus communis)種子清蛋白除可抑制胰蛋白酶活性，還對枯草芽孢桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌等人類致病菌具有較高的體外抗菌活性[8]。積聚在儲存液泡中的種子清蛋白，具有抗菌、抑制胰蛋白酶等功能，可以有效提高植物防御能力，保護種子免受病原體侵害[9]。

胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor，TI)泛指具有抑制胰蛋白酶活性的一類物質，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，其不僅在抵抗植物病蟲害方面發(fā)揮重要作用，也被用于治療腫瘤、病毒感染等疾病[10]。因此，尋找高效的新型TI 已成為近幾年的研究熱點。目前，關于TI 的研究主要為植物源TI，如豆科、喬本科、十字花科等[11]，而TI 在豆科植物種子中含量最為豐富，通常有Kunitz 和Bowman-Birk 兩種類型，這兩種TI 在分子量以及結構上具有較大差異[12]。TI 能與胰蛋白酶的必需基團發(fā)生不可逆反應，形成穩(wěn)定的復合物，進而抑制胰蛋白酶與底物結合，使靶酶活性喪失。TI 是一種高效參與調控機體生理活動的小分子多肽或蛋白[13]，與常規(guī)酶促反應相比，其米氏常數(shù)較低。除了豆類，其他植物種子蛋白來源的新型TI 在國內少有發(fā)現(xiàn)。

火龍果(Hylocereus polyrhizus) 是仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereus)植物，具有較高的營養(yǎng)及藥用價值[14]?；瘕埞ぶ泻蓄慄S酮，果肉富含維生素、水溶性膳食纖維、植物多糖和花色苷，種子含有大量不飽和脂肪酸和蛋白質。有關火龍果理化性質的研究大多限于抗氧化性，如果皮[15－16]及種子蛋白[17]的抗氧化性，但鮮見火龍果種子清蛋白理化性質及功能的相關報道。本研究從紅心火龍果獲得種子清蛋白(Hylocereus polyrhizusalbumin，HPA)，并測定其理化性質和胰蛋白酶的抑制活性，旨在豐富胰蛋白酶抑制劑的種類，拓寬火龍果開發(fā)領域，為進一步挖掘火龍果種子功能提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

8月底，取開花后30 d 已自然成熟的紅心火龍果作為試驗材料。新鮮的火龍果于－20℃冷凍48 h，之后用蒸餾水解凍，將果肉置于紗布中搓洗分離種子，取出種子清洗后60℃烘干并粉碎。種子粉用乙醚脫脂后晾干，－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

大豆胰蛋白酶抑制劑－瓊脂糖凝膠柱(STIBerpharose FF)購于北京博爾西科技有限公司；標準蛋白、Na－苯甲酰-DL－精氨酸－對硝基酰胺鹽酸(Nɑbenzoyl-DL-arginine4-nitroanilidehydrochloride，BAPNA)購于北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為分析純，購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器與設備

DEAE－52 陰離子交換柱，生工生物工程(上海)股份有限公司；?KTATMpure 蛋白質分離純化系統(tǒng)、SE250 垂直電泳槽，美國GE 公司；TU－1810 紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；DK－8D 三孔電熱恒溫水槽，上海一恒科學儀器有限公司；ALPHA 1－2 冷凍干燥機，德國Christ 公司；5804R 離心機，德國Eppendorf 公司；LA8080 氨基酸分析儀，北京日立高新技術公司；NanoLC-UltraTM2D，美國Eksigent 公司；TripleTOFTM5600 質譜系統(tǒng)，美國AB SCIEX 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 HPA 的提取和純化 將5 g 紅心火龍果種子粉加到150 mL 檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液(pH 值7.08)中?；旌弦涸?4℃浸提3 h，10 000 r·min－1離心10 min，取上清即為粗蛋白提取物，脫鹽、冷凍干燥后保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

將粗蛋白用DEAE－52 陰離子交換柱純化，用含0～1 mol·L－1NaCl 的50 mmol·L－1Tris-HCl(pH 值7.50) 緩沖液梯度洗脫。上樣量 2 mL，流速1 mL·min－1，280 nm 波長檢測，見峰收集。

取胰蛋白酶活力高的蛋白組分再經(jīng)大豆胰蛋白酶抑制劑－瓊脂糖凝膠柱純化，上樣量0.5 mL，用含0.5 mol·L－1NaCl 的0.1 mol·L－1Gly-HCl(pH 值3.00)緩沖液洗脫，流速0.6 mL·min－1，280 nm 波長檢測，見峰收集。

1.3.2 蛋白分子量測定 采用十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳 ( sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)測定兩次純化后HPA 各蛋白組分的分子量[18]。

1.3.3 氨基酸成分分析 采用氨基酸分析儀測定HPA 氨基酸組分及含量[19]。

1.3.4 液相色譜－串聯(lián)質譜(liquid chromatographmass spectrometer/mass spectrometer，LC-MS/MS)分析

將陰離子交換柱純化后的HPA 還原烷基化并酶解成肽段，多肽溶液以2 μL·min－1的流速上樣到C18 預柱上(100 μm × 3 cm，3 μm，150?)，并保持2 μL·min－1流速沖洗脫鹽10 min。分析柱是C18 反相色譜柱(75 μm ×15 cm C18－ 3 μm，120 ?)，試驗所用梯度為90 min 內流動相B 由5%升高至35%。質譜分析所采用系統(tǒng)為TripleTOF5600，并結合納升噴霧Ⅲ離子源，其中噴霧電壓為2.5 kV，氣簾氣壓為30 PSI，霧化氣壓為5 PSI，加熱器溫度為150℃。采用Mascot 2.3 軟件處理數(shù)據(jù)。

1.3.5 胰蛋白酶抑制活力的測定 測定方法參照文獻[18]。取0.1 mg·mL－1胰蛋白酶抑制劑溶液100 μL(含50 mmol·L－1Tris-HCl、20 mmol·L－1CaCl2，pH 值8.20)，與100 μL 0.36 mg·mL－1胰蛋白酶溶液混勻，37℃保溫30 min 后加入800 μL BAPNA 溶液，37℃、410 nm 波長處監(jiān)測 1 min。一個酶抑制單位(inhibitory activity unit，IU)定義為每分鐘反應減少0.001 單位吸光度。

1.3.6 胰蛋白酶抑制特性和動力學分析 測定方法參照文獻[19]。胰蛋白酶抑制特性檢測實驗中，制備胰蛋白酶抑制劑和胰蛋白酶摩爾比為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 的混合液，并測定剩余酶活。為確定胰蛋白酶抑制劑的抑制類型，采用Eadie-Hofstee 作圖法，測定最大反應速率Vmax。采用Dixon 作圖法確定抑制常數(shù)(Ki)的動力學參數(shù)，將0、0.1、0.2、0.5、1 nmol·L－1胰蛋白酶抑制劑添加到1.2 nmol·L－1豬胰蛋白酶溶液中，分別測定其與1 和3 mmol·L－1BAPNA 底物反應后的剩余酶活力。

1.3.7 胰蛋白酶抑制活性的穩(wěn)定性分析 測定方法參照文獻[19]。將1 mg·mL－1胰蛋白酶抑制劑溶液(含50 mmol·L－1Tris-HCl 緩沖液，pH 值8.20)，在不同溫度(4、13、23、30、40、50、60、70、80、90、100℃)下孵育30 min，檢測其胰蛋白酶抑制活性。pH 值穩(wěn)定性試驗中，分別添加胰蛋白酶抑制劑溶液到等體積不同pH 值緩沖液(Gly－HCl pH 值2.12，醋酸鈉pH 值4.43，磷酸鈉pH 值6.54，Tris－HCl pH 值8.16 和Gly－NaOH pH 值10.3)，檢測其對胰蛋白酶的抑制活性。化學穩(wěn)定性試驗，以二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)為還原劑，將胰蛋白酶抑制劑溶液分別與3 種濃度(1、10、100 mmol·L－1)的DTT 在37℃保溫15、30、60、120 min，以大豆胰蛋白酶抑制劑為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 HPA 純化及胰蛋白酶抑制活性測定

DEAE－52 陰離子交換柱純化后，圖1顯示了分別用0.1 和0.4 mol·L－1NaCl 洗脫的HPA 兩個餾分(HPA－1，HPA－2)。根據(jù)SDS 蛋白電泳圖中的條帶遷移率，計算得到HPA－1、HPA－2 分子量分別為12.6、13.2 kDa(圖1)。在純化效果和胰蛋白酶抑制活性的測定中，HPA－2 表現(xiàn)出較高的胰蛋白酶抑制性，比活力為9.19×103TIU·mg－1，純化倍數(shù)為1.86(表1)；HPA－1 的抑制活性相對較弱(比活力為2.16×103TIU·mg－1)，純化倍數(shù)為0.44。由圖2可知，HPA－2 再經(jīng)大豆胰蛋白酶抑制劑－瓊脂糖凝膠柱純化，得到單一組分HPA－2－1，比活力為12.08×103TIU·mg－1，純化倍數(shù)為2.45(表1)。后續(xù)試驗將分析HPA－2－1 胰蛋白酶抑制活性的動力學特性及抑制活性的穩(wěn)定性。

表1 火龍果種子清蛋白的純化效果及胰蛋白酶抑制活力Table 1 Purification and trypsin inhibition activity of HPA

圖1 DEAE－52 純化色譜圖和電泳圖Fig.1 Chromatogram and electrophoresis of HPA purification by DEAE－52 column

圖2 大豆胰蛋白酶抑制劑－瓊脂糖凝膠純化色譜圖和電泳圖Fig.2 Chromatogram and electrophoresisof HPA－2 purification by STI-Berpharose column

2.2 HPA 氨基酸成分測定

由表2可知，HPA 由17 個氨基酸組成，富含谷氨酸( 6.297%)、精氨酸( 3.992%) 和天冬氨酸(2.694%)。

表2 HPA 氨基酸分析Table 2 Amino acid composition of HPA

2.3 LC-MS/MS 分析

由表3可知，HPA 與甜菜(Beta vulgarissubsp.vulgaris)和菠菜(Spinacia oleracea)具有較高的同源性。其中2 種匹配的蛋白(XP _019108075，XP _021856448)被定義為2S 種子存儲蛋白。1 種匹配的蛋白(XP_010677003)預測是一種具有存儲功能、14 kDa富含脯氨酸的蛋白質。LC-MS/MS 分析結果證實HPA屬于2S 存儲蛋白家族。

表3 HPA 的LC-MS/MS 分析Table 3 LC-MS/MS analysis of HPA

2.4 HPA－2－1 抑制特性和動力學分析

以BAPNA 為底物測定HPA－2－1 對胰蛋白酶的抑制活性。由圖3-A 可知，剩余胰蛋白酶活性在0～1摩爾比范圍內線性降低；當摩爾比增加到1.2 或更高時，胰蛋白酶活性幾乎完全被抑制。圖3-B 中的數(shù)據(jù)點顯示，兩條線性回歸線以相同Vmax(2.6)在Y 軸上方相交，表明HPA－2－1 是胰蛋白酶競爭性抑制劑。Dixon 圖顯示胰蛋白酶抑制劑Ki 為0.62 nmol·L－1(圖3-C)。

圖3 HPA－2－1 抑制特性和動力學分析Fig.3 Inhibitory properties and kinetic analyses of HPA

2.5 HPA－2－1 抑制活力的穩(wěn)定性分析

由圖4可知，溫度和pH 值對胰蛋白酶剩余活力的影響較弱，這表明HPA－2－1 具有較優(yōu)的胰蛋白酶抑制穩(wěn)定性。當孵育溫度介于30～70℃時，HPA－2－1剩余活力保持約90%(圖4-A)；而溫度升至80℃時剩余活力迅速降至60%；100℃高溫孵育30 min 后，HPA－2－1 剩余活力仍有52.47%。由圖4-B 可知，當pH 值在2～ 10 之間時，HPA－ 2 － 1 剩余活力高于80%；pH 值為6.54 時，HPA－2－1 抑制活性達到峰值，為94.24%。

化學穩(wěn)定性測試中，提高DTT 濃度和保溫時間不會導致HPA－2－1 抑制活力明顯降低(圖4－C)。HPA－2－1 與100 mmol·L－1DTT 保溫2 h 后，剩余活力保持約80%。表明DTT 對HPA－2－1 胰蛋白酶的抑制活性無明顯影響。

圖4 HPA－2－1 抑制活性的穩(wěn)定性分析Fig.4 Stability analyses of HPA－2－1

3 討論

除蕎麥清蛋白結構由一條多肽鏈組成，大多數(shù)植物清蛋白均由兩條多肽鏈組成，并通過四對二硫鍵相連，由于分子量不同，兩條多肽鏈被稱為重鏈和輕鏈[20]。紅心火龍果種子中純化的HPA，分別由12.6和13.2 kDa 兩條多肽鏈組成，根據(jù)多肽鏈的摩爾質量，HPA 可能屬于Kunitz 抑制劑家族[21－22]。測定HPA 氨基酸成分后，發(fā)現(xiàn)其富含谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸?？咕耐ǔ＞哂刑囟ǖ陌被峤M成[23]，花生種子2S 清蛋白中3 種含量最高的氨基酸組成與HPA相同[24]，且花生種子2S 清蛋白能抑制白曲霉，這表明HPA 也可能具有抗菌特性。進一步對HPA 進行LCMS/MS 分析發(fā)現(xiàn)，其與甜菜和菠菜的3 種種子存儲蛋白具有高度同源性，匹配的肽段均位于3 種存儲蛋白的保守結構域AAI_SS 中。AAI_SS 是高等植物特有的蛋白質家族，包括谷物型α－淀粉酶抑制劑、脂質轉移蛋白、種子貯藏蛋白等。已知該家族蛋白質在保護植物免受昆蟲和病原體侵害、細胞內膜之間的脂質轉運以及營養(yǎng)物質存儲方面起著重要作用。該家族的許多蛋白質已被鑒定為人類過敏原[25－26]。據(jù)此，HPA 中肽段是否具有抗蟲、抗菌、過敏原等功能有待進一步研究。

經(jīng)大豆胰蛋白酶抑制劑－瓊脂糖凝膠純化HPA后獲得高胰蛋白酶抑制活力的HPA－2－1，抑制特性和動力學結果表明，其摩爾比抑制曲線與其他Kunitz 型抑制劑一致[27]；HPA－2－1 的Ki 值為0.62 nmol·L－1，小于其他植物種子Kunitz 型抑制劑[28－30]，表明HPA－2－1 是一種更強的Kunitz 型抑制劑，在生物醫(yī)學領域具有潛在的應用前景。抑制活力的pH 值、溫度穩(wěn)定性試驗顯示，HPA－2－1 抑制活力在較廣范圍的pH 值(2～10)和溫度(30～70℃)內穩(wěn)定。通常認為Kunitz型抑制劑具有較寬pH 值和溫度范圍內的穩(wěn)定性[31]，可見HPA－2－1 也具備Kunitz 型抑制劑該特征。抑制活力的化學穩(wěn)定性結果顯示，HPA－2－1 的抑制活力幾乎不受還原劑DTT 的影響，與印加樹屬(Inga vera)[27]相同。植物Kunitz 型蛋白酶抑制劑大多含有4 個半胱氨酸殘基，通過二硫鍵共價連接，對蛋白質的結構與功能穩(wěn)定性至關重要[32]，還原二硫鍵將直接影響生物活性。DTT 不影響HPA－2－1 的抑制活力，表明其二硫鍵離酶抑制的反應位點較遠。

4 結論

本研究從紅心火龍果中純化獲得其種子清蛋白HPA，發(fā)現(xiàn)HPA 由兩條多肽鏈(HPA－1，HPA－2)組成。HPA 富含谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸，與來自甜菜和菠菜的2S 種子存儲蛋白具有高度相似性。HPA－2具有較高的胰蛋白酶抑制活性，其純化組分HPA－2－1是Kunitz 型胰蛋白酶競爭性抑制劑。在一定pH 值、溫度范圍內，HPA－2－1 胰蛋白酶抑制活力穩(wěn)定性均較好?；瘕埞N子清蛋白是一種潛在的新型胰蛋白酶抑制劑，鑒于大多胰蛋白酶抑制劑具有抗菌、抗蟲、抗病毒、抗腫瘤等功能，后續(xù)將深入研究該種子清蛋白的其他生物活性。