耿夢(mèng)瑤 程文聰 陳麗紅 李亞君 陳曉紅

(1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

膽堿氨基酸/膽堿脂肪酸離子液體是一類以膽堿作為陽離子，氨基酸/脂肪酸作為陰離子合成的新型離子液體，這類離子液體除了具有較高的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性、較強(qiáng)溶解能力、不易揮發(fā)以及可設(shè)計(jì)性等優(yōu)點(diǎn)外，還具有低毒性和生物可降解性[1]。目前，膽堿類離子液體主要應(yīng)用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理領(lǐng)域，在秸稈預(yù)處理方面具有良好的應(yīng)用前景[2－3]。Liu等[4]通過簡單、綠色的途徑合成一系列膽堿氨基酸離子液體，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)膽堿氨基酸離子液體能有效溶解木質(zhì)素；此外，用膽堿類離子液體處理小麥、水稻秸稈時(shí)能有效提高酶解效率，且離子液體可重復(fù)利用，但隨著回收次數(shù)的增多，其回收率降低，對(duì)木質(zhì)素的萃取效果變差，從而不得不將之廢棄。因此，要實(shí)現(xiàn)秸稈預(yù)處理過程中離子液體綠色高效循環(huán)利用，殘液的合理處理和利用十分重要。

遲曉麗[5]將秸稈預(yù)處理后的殘液用于盆栽番茄，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽堿脯氨酸處理殘液對(duì)番茄的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用，能有效提高番茄植株的抗病能力，這為殘液的重復(fù)利用提供了綠色有效的新途徑，同時(shí)拓展了膽堿類離子液體在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面的利用。膽堿類離子液體中的陽離子膽堿是一種廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，用于合成細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)的季胺類物質(zhì)，具有維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，促進(jìn)質(zhì)膜流動(dòng)及提高生物膜選擇透性等生理功能[6]，同時(shí)膽堿也是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)——甘氨酸甜菜堿合成的初始底物。研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下玉米幼苗中的膽堿含量大幅度增加，并誘導(dǎo)甘氨酸甜菜堿的大量積累，調(diào)節(jié)干旱引起的滲透脅迫[7]。另外，膽堿類離子液體中的陰離子氨基酸和短鏈脂肪酸在作物生長和抗逆方面也發(fā)揮著重要作用。氨基酸可以緩解非生物脅迫造成的損傷，同時(shí)也可作為植物激素的前體物質(zhì)調(diào)節(jié)作物的生長[8－9]。外源天冬氨酸、谷氨酸能顯著降低滲透脅迫下蕎麥葉片質(zhì)膜透性和MDA 含量，顯著提高抗氧化酶活性[10]。同時(shí)，Wu 等[11]研究了膽堿氨基酸離子液體對(duì)水稻種子萌發(fā)和根長的影響，結(jié)果表明，膽堿天冬氨酸能促進(jìn)水稻種子萌發(fā)和根長的生長，有望用作水稻的生長促進(jìn)劑。此外，膽堿類離子液體作為一種新型的離子液體，與傳統(tǒng)的離子液體相比表現(xiàn)為更低的毒性，傳統(tǒng)的離子液體如咪唑類離子液體在作物生長方面已有較多的研究，其能通過改變植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，降低光合作用、抗氧化酶活性，改變激素代謝水平，如促進(jìn)衰老相關(guān)激素(乙烯和脫落酸)的生物合成，以及生長促進(jìn)激素(赤霉素)的失活等來影響作物幼苗的生長發(fā)育，且離子液體的毒性隨烷烴鏈的增加而增加[12－17]。而目前關(guān)于膽堿類離子液體對(duì)作物生長影響的研究較少，且關(guān)注點(diǎn)尚且停留在離子液體對(duì)作物正常生長的影響方面。

本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上分別挑選2 種膽堿脂肪酸和4 種膽堿氨基酸離子液體，研究聚乙二醇－6000(polyethylene glycol－6000，PEG)模擬干旱脅迫下膽堿類離子液體浸種處理對(duì)玉米種子萌發(fā)與根芽生長的影響，旨在為探究膽堿類離子液體影響作物生長以及對(duì)作物抗旱性方面的生理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，拓展膽堿類離子液體在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試玉米種子品種為鄭單958，購自北京德農(nóng)種業(yè)。氫氧化膽堿(46%)購自美國Sigma 公司；氨基酸和脂肪酸購自北京百靈威科技有限公司。

1.2 離子液體的合成

在前人合成離子液體的方法上稍加改進(jìn)[2，18]。在常溫下，按照2 ∶1 摩爾比，將氫氧化膽堿水溶液(46%)逐滴加入己二酸、辛二酸水溶液中；氫氧化膽堿與蘇氨酸、纈氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺按1 ∶1摩爾比的劑量滴加。整個(gè)過程在磁力攪拌器上進(jìn)行，每次滴加少量，確保充分混勻。滴加完成后，在搖床反應(yīng)48 h(18℃，200 r·min－1)，反應(yīng)完成后溶液pH 值在7.0～9.0 之間，在55℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去水分，然后將所得液體于55℃真空干燥48 h，即得膽堿脂肪酸/氨基酸離子液體，室溫下為淺黃色至黃色液體。以氘代水為溶劑，采用AVANCEⅢ400 MHz 核磁共振光譜儀(德國Bruker 公司)測(cè)定離子液體的氫譜，并進(jìn)行譜圖分析，表征所合成離子液體的結(jié)構(gòu)，確認(rèn)所合成離子液體的正確性。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)過前期篩選，選用4 種膽堿氨基酸(膽堿纈氨酸、膽堿蘇氨酸、膽堿天冬氨酸、膽堿天冬酰胺)和2種膽堿脂肪酸(膽堿己二酸、膽堿辛二酸)進(jìn)行浸種處理。選取大小均勻，健康飽滿的玉米種子，用75%乙醇消毒5 min，然后用蒸餾水沖洗干凈。分別用200 mg·L－1膽堿氨基酸、膽堿脂肪酸和蒸餾水浸種12 h，以蒸餾水浸種作為對(duì)照。之后，將浸種后的種子在發(fā)芽盒中萌發(fā)，并使用PEG－6000 模擬干旱脅迫，具體方法如下:在發(fā)芽盒(長×寬×高:19 cm×13 cm×12 cm)底部鋪有雙層濾紙，PEG 模擬干旱脅迫處理使用30 mL 13% PEG 溶液(13% PEG 濃度根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)確定，屬于中等程度脅迫)浸濕濾紙，將不同膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種后的種子整齊放置于濾紙上萌發(fā)。同時(shí)，將蒸餾水浸種處理的對(duì)照種子分為2 組，一組為蒸餾水對(duì)照(CK－蒸餾水)，另一組為PEG 對(duì)照(CKPEG)(干旱脅迫處理方法同上)。每個(gè)發(fā)芽盒中放置25 粒種子，每處理3 次重復(fù)，進(jìn)行2 次重復(fù)試驗(yàn)。種子萌發(fā)于28℃恒溫培養(yǎng)箱(黑暗)內(nèi)進(jìn)行。每隔24 h記錄一次發(fā)芽數(shù)，連續(xù)記錄5 d，計(jì)算玉米種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)以及發(fā)芽指數(shù)。5 d 后，每盒取6 顆幼苗測(cè)定根長、芽長；并剝?nèi)⊥暾姆N胚進(jìn)行后續(xù)幼胚可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、過氧化氫(H2O2)含量等生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4.1 萌發(fā)參數(shù) 根據(jù)公式計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù):

發(fā)芽率＝供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽勢(shì)＝3 d 內(nèi)供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)＝ΣGt/Dt

式中，Gt 為第t 天的發(fā)芽數(shù)，Dt 為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.4.2 玉米種胚生理指標(biāo) 本研究所測(cè)定的酶活性用比活力表示，即每毫克可溶性蛋白所含的酶活力單位。可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250 染色法[19]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(nitroblue terazolium，NBT)光還原法[19]；過氧化物酶(peroxidase，POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[20]；過氧化氫酶(catalase，CAT)活性、MDA 含量測(cè)定參照高俊鳳[21]的方法；H2O2含量測(cè)定采用硫酸鈦法[21]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析LSD 法進(jìn)行。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用R 軟件(版本:3.6.1)“agricolae”程序包完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種對(duì)PEG 模擬干旱脅迫下玉米種子萌發(fā)的影響

由圖1和表1可知，PEG 模擬干旱脅迫顯著降低了玉米種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，而部分膽堿類離子液體浸種有利于緩解干旱脅迫對(duì)玉米種子萌發(fā)的抑制作用。膽堿己二酸、膽堿辛二酸浸種處理后，干旱脅迫下玉米種子的發(fā)芽指數(shù)相比CK-PEG 處理分別提高了42.6%、40.2%，差異顯著，而種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率提高不顯著。4 種膽堿氨基酸浸種處理后，玉米種子的3 個(gè)萌發(fā)參數(shù)均高于CK-PEG 處理，其中，膽堿天冬氨酸、膽堿天冬酰胺浸種處理后種子的發(fā)芽勢(shì)均顯著提高至75.0%。

表1 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸離子液體對(duì)PEG 模擬干旱脅迫下玉米種子萌發(fā)參數(shù)的影響Table 1 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acid ILs on seed germination parameters of maize under PEG simulated drought stress

圖1 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸浸種對(duì)PEG 模擬干旱脅迫下玉米種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acids ILs soaking on seed germination of maize under PEG simulated drought stress

2.2 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸浸種對(duì)PEG 模擬干旱脅迫下玉米萌發(fā)后根芽生長的影響

由表2可知，PEG 模擬干旱脅迫嚴(yán)重抑制了玉米種子萌發(fā)后根芽的生長，膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種處理能緩解PEG 模擬干旱脅迫對(duì)玉米根芽生長的抑制作用。相比CK-PEG 而言，PEG 模擬干旱脅迫下膽堿己二酸、膽堿辛二酸離子液體浸種處理的玉米芽長分別增加24.9%、22.9%，根長分別增加4.2%、11.7%；膽堿天冬氨酸、膽堿天冬酰胺浸種處理后玉米根芽生長均顯著增加，芽長分別增加46.1%、40.3%，根長分別增加26.7%、13.8%。

表2 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸離子液體對(duì)PEG 模擬干旱脅迫下玉米萌發(fā)后根芽生長的影響Table 2 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acids ILs on the growth of maize root and shoot under PEG simulated drought stress

2.3 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸浸種對(duì)PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，與CK－蒸餾水相比，PEG 模擬干旱脅迫顯著降低了玉米種胚中抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性。PEG 模擬干旱脅迫下，膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸離子液體浸種處理有利于提高玉米種胚的抗氧化酶系活性。與CK-PEG 相比，膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種有利于提高SOD 活性，其中膽堿天冬酰胺處理的SOD 活性顯著提高了41.2%。膽堿類離子液體浸種總體顯著提高PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚POD 和CAT 活性；在2 種膽堿脂肪酸離子液體中，膽堿辛二酸浸種處理的POD 活性較CK-PEG 提高了108.5%；4 種膽堿氨基酸離子液體浸種處理中膽堿纈氨酸、膽堿蘇氨酸處理的POD 活性較CK-PEG 分別提高了108.7%、120.3%；活性膽堿纈氨酸、膽堿天冬氨酸浸種處理的CAT 活性較CK－PEG 分別提高了121.9%、117.2%。

圖2 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸浸種對(duì)PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚抗氧化酶活力的影響Fig.2 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acids ILs soaking on antioxidant enzyme activities of maize embryo

2.4 膽堿脂肪酸和氨基酸浸種對(duì)PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚M(jìn)DA、H2O2 含量的影響

由圖3可知，PEG 模擬干旱脅迫導(dǎo)致玉米種胚中MDA 和H2O2含量顯著增加。與CK-PEG 相比，膽堿類離子液體浸種處理后玉米種胚中MDA、H2O2含量均顯著下降。其中，膽堿己二酸、膽堿辛二酸浸種處理后，玉米種胚中MDA 含量分別降低了42.8%、47.3%；膽堿纈氨酸、膽堿天冬酰胺浸種處理后，種胚中MDA含量分別降低了45.6%、51.3%；膽堿纈氨酸、膽堿天冬酰胺浸種處理后，種胚中H2O2含量分別降低了42.5%、29.8%。

圖3 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸浸種對(duì)PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚M(jìn)DA 和H2O2 含量的影響Fig.3 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acids ILs soaking on MDA and H2O2content of maize embryo

3 討論

發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)是衡量植物種子萌發(fā)表現(xiàn)的重要指標(biāo)，干旱脅迫下種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率等顯著降低，使種子萌發(fā)受到明顯的抑制，而外源生長調(diào)節(jié)劑或激素浸種能有效緩解干旱脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用[22－23]。同時(shí)，前人關(guān)于離子液體對(duì)作物生長的研究也提出，低濃度的離子液體可促進(jìn)作物的生長，其作用類似于植物生長調(diào)節(jié)劑[24－25]。在本研究中，膽堿己二酸、膽堿辛二酸、膽堿天冬氨酸和膽堿天冬酰胺浸種處理能顯著提高PEG 模擬干旱脅迫下玉米種子的部分萌發(fā)參數(shù)，緩解PEG 模擬干旱脅迫對(duì)玉米種子萌發(fā)的抑制作用，并有效促進(jìn)PEG 模擬干旱脅迫下玉米種子萌發(fā)后玉米根芽的生長，這與外源生長調(diào)節(jié)劑的作用存在相似性；另外，在本研究PEG 模擬干旱脅迫下，膽堿類離子液體浸種處理后種子的發(fā)芽率增加不顯著的原因可能是試驗(yàn)所用種子活力較高，所以導(dǎo)致浸種處理后種子發(fā)芽率與CK-PEG 處理相比差異不顯著。

植物在遭受生物或非生物脅迫后，可造成活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量積累，導(dǎo)致氧化脅迫的產(chǎn)生。植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)(如SOD、POD、CAT 等)在清除活性氧方面發(fā)揮著重要作用，且這些酶的作用是高度專一的[26－27]。SOD 將轉(zhuǎn)化為O2和H2O2[28]，而POD、CAT 將H2O2分解為O2和H2O，這些酶的相互關(guān)聯(lián)依次將植物體內(nèi)的ROS 轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)。本研究中，PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚中抗氧化酶活性顯著降低，模擬干旱脅迫下，與CKPEG 相比，膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種處理的玉米種胚中抗氧化酶活性的總體趨勢(shì)為部分處理下SOD活性顯著提高，所有膽堿類離子液體浸種處理POD 活性均顯著增加，且除膽堿蘇氨酸外，所有膽堿類離子液體浸種處理CAT 活力均顯著增加，可見，本研究考察的膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種有利于提高模擬干旱脅迫下抗氧化酶活性。本研究還發(fā)現(xiàn)，與CK-PEG 相比，所有膽堿類離子液體浸種處理均顯著降低了干旱脅迫下種胚中的H2O2含量，這與不同膽堿類離子液體浸種下較高的POD、CAT 活力是相符的。MDA 含量在一定程度上反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平和細(xì)胞損傷程度。與CK-PEG 相比，膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種處理能顯著降低PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚的MDA 含量，緩解了PEG 模擬干旱脅迫對(duì)玉米種子的氧化損傷。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，利用膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸浸種有利于緩解PEG 模擬干旱脅迫對(duì)玉米種子萌發(fā)的抑制作用，這可能與不同膽堿浸種處理下玉米種胚抗氧化酶活性提高，MDA、H2O2含量降低有關(guān)。使用本研究中考察的不同膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種有助于提高PEG 模擬干旱脅迫下玉米種子的萌發(fā)指標(biāo)及萌發(fā)后種子根、芽的生長狀況。