趙正偉， 馬 青， 馬麗娜， 王 錦， 王曉薇， 李穎康

(寧夏農(nóng)林科學院 動物科學研究所，寧夏 銀川 750001)

成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)由Jansen R等命名[1]，其中,CRISPR-associated(Cas)基因總是位于CRISPR基因座附近，表明兩者可能具有相互作用關系.2007年，Rodolphe Barrangou等證實,CRISPR-Cas廣泛存在于細菌和古細菌中的一套抵御病毒和噬菌體入侵的獲得性免疫系統(tǒng)[2].CRISPR系統(tǒng)極具多樣性，目前可分成2大類,即干擾效應物由多亞基蛋白復合物組成;干擾效應物依賴單個蛋白質[3].根據(jù)特征基因的不同，CRISPR系統(tǒng)又可細分(圖1a)：Ⅰ型系統(tǒng)的特征蛋白是Cas3，它是一種具有核酸酶和解旋酶結構域的蛋白質；在Ⅱ型系統(tǒng)中，特征Cas9基因編碼干擾所必需的唯一蛋白質；Ⅲ型系統(tǒng)以Cas10為特征蛋白，且Cas10組裝成類似Cascade的干擾復合體；Ⅳ型系統(tǒng)具有Csf1蛋白質，它是一種未被鑒定的蛋白質，被認為是Cascade復合物的一部分[4]；Ⅴ型系統(tǒng)的特征蛋白為Cas9單核酸酶,即Cpf1，C2c1或C2c3[5]；Ⅵ型系統(tǒng)的特征蛋白為C2c2，它是含有2個HEPN結構域的RNase蛋白[5].Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型系統(tǒng)基于其多亞基效應復合物發(fā)揮功能，而Ⅱ，Ⅴ，Ⅵ型系統(tǒng)基于單個效應蛋白發(fā)揮功能.圖1a展示了以上6種類型的代表性Cas基因座[6].

圖1 CRISPR系統(tǒng)的基本分類和應用情況

圖1中僅存在于某些細菌亞型中的Cas蛋白以虛線輪廓顯示，參與干擾的模塊為白色，參與crRNA生物發(fā)生的模塊為黑色，參與適應性的模塊為灰色.TypeⅠ中的Cas6同時參與干擾和crRNA生物發(fā)生.Ⅳ型系統(tǒng)在沒有CRISPR基因座的情況下頻繁發(fā)生.

由于CRISPR-Cas9系統(tǒng)結構簡單，目前它的研究和應用最為廣泛.首次發(fā)現(xiàn)Cas蛋白可以通過短的RNA引導切割特定的DNA序列后不久[7]，Doudna和張鋒證實CRISPR介導的基因組修飾可應用于哺乳動物細胞[8—9].目前，CRISPR技術作為新興的基因編輯工具，與ZFN(鋅指核酸酶)和TALEN(轉錄激活因子樣效應物核酸酶)技術一同引領基因工程的新時代[10—12].CRISPR技術在基因編輯上的應用大致可分為基因插入[13]、基因敲除[14]、基因定點突變[15]、靶向定位[16]、基因表達調(diào)控[17]、基因表觀修飾[18]、基因融合[19]等(圖1b).在最近的研究中，CRISPR還被應用于選擇性消除單條染色體[20]和產(chǎn)生誘導性多能干細胞[21].CRISPR技術不但在實驗室基因編輯過程中發(fā)揮了重要作用，更在日常飲食、醫(yī)療等方面中扮演了越來越重要的角色.筆者綜述CRISPR技術在醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、畜牧及高通量篩選等領域的最新進展和應用情況，并對其發(fā)展前景進行展望.

1 CRISPR技術在醫(yī)學領域的應用

基因治療是從基因水平上治療某些疾病的技術.基于DNA或RNA的遺傳操縱原理，可將外源正常基因導入靶細胞治療和預防人類疾病.與傳統(tǒng)治療相比，基因治療有針對性強、效果顯著、患者無痛苦等優(yōu)勢.但也存在安全隱患，面臨著穩(wěn)定性差、效率低、操作復雜的缺陷.CRISPR作為高效、簡便、靶向性強的新興基因編輯工具，對于解決基因治療的缺陷問題將發(fā)揮重要的作用.目前，CRISPR技術在基因治療領域已經(jīng)有了廣泛的應用，并在病毒性疾病、基因突變性疾病、建立疾病模型、疾病新療法開發(fā)和疾病檢測等方面取得了重大進展(表1).

表1 CRISPR技術在醫(yī)學領域的應用

1.1 治療病毒性疾病

CRISPR作為細菌抵御病毒和噬菌體入侵的免疫系統(tǒng)，可以特異性切割外源基因，目前用于病毒感染類疾病治療的研究,具體可從靶向切割病毒基因和編輯人體基因組2方面入手：靶向切割病毒基因是在確定病毒的保守序列后，針對其設計gRNA，從而達到清除病毒的目的；編輯人體基因組,則是基于人體細胞自身特性，賦予被編輯的細胞特定性狀，或者用于激活免疫系統(tǒng)，以此作為治療手段.雖然CRISPR技術治療病毒性疾病應用于臨床還有一定的距離，但是其潛力不容忽視.

2017年， Xu L等通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)在造血干細胞移植中靶向切割人CCR5基因[22].將CCR5敲除處理的人HSPC(hematopoietic stem/progenitor cells)重建人免疫系統(tǒng)移植到高度免疫缺陷小鼠后，賦予了小鼠抗1型人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus-1, HIV-1)感染的能力.2018年， Ophinni Y等通過CRISPR-Cas9設計6種gRNA[23]，其中3種靶向切割HIV-1調(diào)節(jié)基因Tat,Rev，通過抑制Tat,Rev蛋白的表達，成功減少持續(xù)和潛伏感染的CD4+T細胞系中HIV病毒衣殼的產(chǎn)生，可為艾滋病的治療提供新方法.

高風險人乳頭瘤病毒致癌基因(E6，E7)的失調(diào)表達是宮頸癌發(fā)病和惡化的關鍵因素.2014年，Zhen S等通過CRISPR-Cas9靶向E6，E7基因的啟動子和編碼區(qū)[24]，導致P53，P21蛋白的積累，從而顯著降低宮頸癌細胞的體外增殖能力，證明CRISPR技術可以作為宮頸癌和其他HPV相關癌癥治療的新策略.

1.2 治療基因突變遺傳病

作為一種多用途的基因組編輯工具，CRISPR技術的應用領域十分廣泛，如可通過基因定點突變、異?；虬邢蚯贸确绞綉糜诨蛲蛔冞z傳病的治療[25].其中,單基因突變疾病的治療研究最為成熟，相信很快可應用于臨床.

鐮刀型貧血癥是一種基因單位點突變疾病，很多科學家已經(jīng)嘗試應用CRISPR技術對其進行治療[26—28].2017年12月，CRISPR Therapeutics公司請求歐洲監(jiān)管部門允許其開展針對鐮狀細胞病和β地中海貧血患者的研究性CRISPR治療方法(CTX001)的臨床試驗.

Tmc1基因顯性突變會引起人和小鼠漸進性聽力喪失.2018年，Gao X等通過CRISPR-Cas9基因編輯技術使產(chǎn)生突變的Tmc1基因失活[29]，從而改善了小鼠模型中的聽力喪失情況.

肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一種成人發(fā)病的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，患者全身進行性肌肉無力和萎縮，一般發(fā)病3～5 a內(nèi)癱瘓并死亡，目前還沒有治愈的方法.SOD1基因的突變常被用于模擬ALS神經(jīng)變性疾病.2017年， Gaj T等通過CRISPR-Cas9破壞患有肌萎縮側索硬化癥的G93A-SOD1小鼠模型中SOD1的表達[30]，與對照動物相比，疾病發(fā)作延遲37%，存活率增加25%.

1.3 建立疾病模型

構建疾病模型對致病機理和治療方法的研究有重要意義.疾病狀態(tài)常由單個或多個基因突變導致，在確定導致疾病性狀的具體基因和基因突變類型后，研究者可依照所需性狀對特定基因進行編輯，以此模擬疾病性狀.CRISPR技術具有簡便、可遺傳和高度穩(wěn)定等優(yōu)勢，是疾病模型構建領域的有效工具.

杜氏肌營養(yǎng)不良癥(duchenne muscular dystrophy, DMD)是由編碼抗肌萎縮蛋白的Dmd基因突變引起的X連鎖致死性肌肉疾病.2014年，Nakamura K等通過CRISPR-Cas9同時靶向敲除大鼠Dmd基因中的2個外顯子[31]，結果表明,F0代大鼠中出現(xiàn)抗肌萎縮蛋白表達缺失的性狀;Dmd突變的大鼠表現(xiàn)出肌肉力量下降，骨骼肌、心臟和膈肌中退行性/再生性的表型;F1代雄性大鼠的骨骼肌具有相似的表型,證明這些突變可被下一代遺傳.從而成功構建了杜氏肌營養(yǎng)不良癥的疾病模型.

2017年，Jarno Drost等通過CRISPR-Cas9探索癌癥相關突變信號的來源[32]，發(fā)現(xiàn)錯配修復基因MLH1缺陷的類器官中突變積累是由復制錯誤驅動的，并通過敲除離體器官中的NTHL1基因模擬了在錯配修復缺陷的結腸直腸癌中觀察到的突變譜.

1.4 開發(fā)疾病新療法

隨著技術的不斷改進和融合，CRISPR技術已經(jīng)被應用于多種新型治療方法的研究，如與免疫治療相結合、改變基因表觀修飾、尋找藥物新靶點等.大量的研究成果讓我們感受到CRISPR技術在藥物研發(fā)和疾病治療中無限潛能，更讓我們對攻克長期危害人類健康的疑難雜癥充滿信心.

2018年，Kim M Y等在《Cell》上發(fā)表了一種能結合CRISPR技術和CAR-T細胞療法(chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy)治療急性髓性白血病的新方法[33]，即通過CRISPR技術敲除CD33基因，產(chǎn)生白血病特異性抗原，從而賦予CAR-T細胞靶向治療急性髓性白血病的能力.

2018年，Liu X S等首次通過自主研發(fā)的一種移除甲基化的改進型CRISPR-Cas9系統(tǒng)[18]，恢復受脆性X染色體綜合征影響的神經(jīng)元中FMR1基因的活性，表明該方法可用于治療由異常甲基化引起的疾病.

2018年，Barbieri I等構建了多種小鼠白血病細胞模型[34]，用于系統(tǒng)性地測試每個可能相關的基因，從而發(fā)現(xiàn)哪些基因是AML細胞存活所必需的，最終通過CRISPR-Cas9鑒定出AML白血病的藥物新靶標METTL3.

1.5 檢測病毒性疾病

CRISPR家族中的一些成員(Cas12，Cas13)可以靶向切割單鏈DNA或RNA，研究人員應用這種特性開發(fā)出一系列核酸檢測新方法.這些核酸檢測方法可應用于病毒檢測等領域，也為醫(yī)學檢驗提供更多選擇.

2017年，張鋒等開發(fā)一種基于CRISPR-Cas13的快速、廉價且高度靈敏的診斷工具SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter UnLOCKing)[35—36]，可用于檢測RNA或DNA的單分子.出于增強實用性目的，他們又開發(fā)出一種微型試紙條測試方法，該方法使肉眼觀察測試結果成為可能，且無需使用昂貴的設備.

2018年，Doudna使用被稱作DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter)的DNA檢測方法實現(xiàn)了靈敏且準確的病毒DNA檢測[37]，該方法通過在人類樣品中檢測2種致癌性的人類乳頭狀瘤病毒得到驗證.

2 CRISPR在農(nóng)業(yè)、畜牧領域的應用

在國家政策的扶持、巨大的市場需求以及相關研究不斷取得進展的背景下，CRISPR技術在農(nóng)業(yè)應用方向迎來了新的機遇.與傳統(tǒng)技術相比，CRISPR擴展了農(nóng)業(yè)育種工具庫，可以更快、更精準地培育出農(nóng)作物新性狀，并極大地縮短育種的時間.同時，使用CRISPR-Cas9技術對農(nóng)作物基因進行編輯，不涉及外源DNA引入,且經(jīng)USDA(united states department of agriculture)認定不在轉基因監(jiān)管范圍之內(nèi)，沒有食品安全方面的風險.因此，未來CRISPR技術在農(nóng)業(yè)領域更多的突破和發(fā)展值得期待.

2.1 農(nóng)作物的遺傳改良

隨著人口的增長，糧食危機成為不得不面對的問題.CRISPR基因編輯技術已經(jīng)在優(yōu)化農(nóng)作物產(chǎn)量、抗病性、口味等性狀上取得了一定突破，已成為未來農(nóng)業(yè)育種領域的一大助力.

2.1.1提高作物產(chǎn)量 2017年， Zachary B L等通過CRISPR編輯番茄開花抑制因子基因SELFPRUNING5G，促進番茄的日長敏感性[38]，使番茄快速、集中開花，提高了產(chǎn)量.他們還通過CRISPR基因編輯技術成功改良西紅柿苗的分枝、花的數(shù)量以及果實的大小等性狀[39].

氨基酸轉運子(amino acid transporters, AATS)在植物發(fā)育階段的營養(yǎng)分配過程中起到不可或缺的作用.2018年, Lu K等通過CRISPR技術抑制氨基酸轉運蛋白OsAAP3的表達[40]，提高了作物的氨基酸含量，并通過促進水稻的芽生長和分蘗數(shù)的增加提高了谷物產(chǎn)量.

2.1.2增強抗病性 植物病毒感染不僅影響作物的產(chǎn)量，更對糧食安全構成嚴重威脅.CRISPR技術應用于作物抗病性研究已有很多實例:2015年,Zahir A等證實CRISPR-Cas9系統(tǒng)可用于植物中以賦予其對DNA病毒的分子免疫[41]；2016年,Zhao K等設計的針對水稻OsERF922基因的CRISPR-Cas9 SSN(C-ERF922)[42]，改善了稻瘟病抗性；2017年，Peng A等通過CRISPR-Cas9靶向編輯柑橘關鍵抗性基因CsLOB1啟動子[43]，大大改善了柑橘的潰瘍病抗性.

除此之外，CRISPR系統(tǒng)還可實現(xiàn)對作物抗蟲害基因的編輯和篩選，如2018年Khanal C等通過該技術編輯棉花中的腎臟線蟲抗性基因[44].

2.1.3保障育種安全性 對于食品安全問題，轉基因作物備受爭議，而CRISPR編輯的作物經(jīng)USDA認定不在轉基因監(jiān)管范圍之內(nèi).2016年，Mickael M將純化的CRISPR-Cas9 核酸酶蛋白直接遞送至葡萄和蘋果的原生質體內(nèi)[45]，實現(xiàn)非轉基因的靶向基因編輯.還有研究者使用農(nóng)桿菌介導的瞬時CRISPR-Cas9基因表達系統(tǒng)創(chuàng)建非轉基因的突變植物[46].這些非轉基因的育種方法為育種篩選提供了便利，同時提高了公眾的接受度，這對于商業(yè)化和大規(guī)模生產(chǎn)十分重要.

2.2 動物育種

自2013年CRISPR-Cas9技術成功應用于哺乳動物細胞研究以來，該技術已經(jīng)廣泛應用于動物育種.

2.2.1畜禽遺傳育種 健康生活的需求使人們選擇食用更多瘦肉，因此提高家畜的瘦肉率是有意義的工作.2017年，趙建國等通過CRISPR向豬細胞內(nèi)插入UCP1基因[47]，該基因負責棕色脂肪組織介導的產(chǎn)熱，并在防止感冒和調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用.UCP1基因的插入可減少脂肪沉積、增加瘦肉率，培育出的豬比正常豬的脂肪少24%，同時抗寒性更好.2018年， Zou Y等通過CRISPR-Cas9進行FBXO40基因的敲除[48]，培育出的豬肌肉肥大，且沒有可檢測的病理效應.

除了改良家畜的肉質品質，CRISPR技術還用于提高家畜的抗病性.禽白血病病毒亞群J(avian leukosis virus subgroup J, ALV-J)已給家禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失.2017年，Lee H J等通過CRISPR精確編輯雞細胞中ChNHE1受體基因的關鍵位點[49]，賦予了雞對ALV-J的抗性，表明該技術可以用于開發(fā)抗病品系.

2.2.2其他高價值動物遺傳育種 CRISPR技術的應用可實現(xiàn)寵物基因靶向編輯[50]，滿足客戶的個性化需求，同時也有助于寵物疾病的治療.

基因編輯技術還可與克隆技術相結合，通過基因編輯敲除或敲入動物的某個基因,培育出有優(yōu)良性狀的品種，再通過克隆技術大量繁殖.世界首只基因編輯克隆犬“龍龍”在中國誕生，它不僅是一只克隆犬，且其供體細胞來自于世界首例基因編輯疾病模型犬“蘋果”.因此，對于有較高價值的動物，通過克隆技術可以擴展基因編輯技術的應用范圍.

3 基于CRISPR技術的高通量篩選

明確產(chǎn)生相應性狀的基因是基因編輯技術應用的前提.研究人員通常使用高通量篩選技術確認基因與性狀的聯(lián)系.結合CRIPSR-Cas9和二代測序技術的大規(guī)?；蚯贸Y選方法，能夠極大地推動特異細胞類型及處理條件下篩選相關基因、藥物反應及抗藥發(fā)生等工作，還可快速、準確地找到與某種表型相關的基因，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標[51].相對于傳統(tǒng)的小干擾RNA敲降篩選、常規(guī)的突變篩選，CRISPR篩選實驗具有通量大、效率高及花費低廉的特點，這些優(yōu)勢使該方法具有巨大的應用潛力.

CRISPR-Cas9文庫高通量篩選可以分為陽性篩選與陰性篩選2種模式[52]:陽性篩選對細胞文庫施加篩選壓力，只有少數(shù)目的表型細胞能夠存活；陰性篩選中存活的細胞并不是目的表型細胞，因此需要比較不同時間點sgRNA的豐度，找出差異sgRNA確定關鍵基因(圖2).2種篩選方式都常需要與高通量測序技術結合應用[53].

圖2 CRISPR-Cas9高通量篩選流程

CRIPSR技術應用于高通量篩選已有許多實例，證明其具有實用性和廣泛的適用性.2014年，張鋒等利用基因組規(guī)模的CRISPR-Cas9敲除(GeCKO)文庫[54]，鑒定癌癥和多能干細胞中細胞存活所必需的基因，并在一個黑色素瘤模型中，篩選與vemurafenib耐藥性有關的基因，觀察到獨立的引導RNA對同一基因的高度一致性和高命中率，證明了使用CRISPR-Cas9進行基因尺度篩選的前景.2014年， Zhou Y等通過基因敲除文庫篩選[55]，成功鑒定炭疽和白喉毒素是細胞中毒所需的宿主基因.

2018年，Pandolfi等開發(fā)了一種CRISPR激活lncRNA的篩選策略[56]，可靶向14 701種lncRNA基因.他們著重關注控制阿糖胞苷(cytarabine, Ara-C)耐藥性的遺傳學特征，通過基于CRISPR的高通量篩選方法評估哪些基因可能決定阿糖胞苷的耐藥性.CRISPR技術允許研究人員一次分析成千上萬個編碼基因和lncRNA，并可激活任意感興趣的基因.2018年，Kurata J S和Lin R J構建了靶向1 594個(85%)已知的人類miRNA莖環(huán)的sgRNA庫[57]，并利用這個sgRNA庫篩選影響HeLa或NCI-N87細胞適應度的miRNA.

4 展望

近年來，CRISPR技術飛速發(fā)展，在取得顯著成績的同時也不免引人擔憂.最新的研究表明，CRISPR-Cas9基因療法中發(fā)揮作用的細胞通常不攜帶功能性p53基因，如將這種基因療法改造過的細胞轉移到患者體內(nèi)，或許會誘發(fā)癌癥[58].CRISPR技術的脫靶現(xiàn)象也是重要的安全問題，近期《Nature Biotechnology》上的一篇研究報告對CRISPR技術的安全性提出質疑[59]，并指出需要進行全面的基因組分析，以便在對患者給藥前鑒定具有正?；蚪M的細胞.以上是CRISPR技術發(fā)展中不得不面臨的問題，可從提高CRISPR技術安全性和技術性創(chuàng)新兩方面著手進行改善.相信經(jīng)過科學家的不懈努力，CRISPR技術將會給我們帶來更多驚喜.

在提高CRISPR技術安全性方面，研究者開發(fā)新型Cas9核酸酶提高基因編輯安全性[60].Roth T L等利用電穿孔成功對人T細胞進行CRISPR基因編輯且無需病毒載體[61].Carlson-Stevermer J等利用RNA aptamer分子膠組裝出一種CRISPR修復工具包并將其運送到DNA切割位點上[62]，大大提高了修復精準度.與傳統(tǒng)CRISPR技術相比，該方法的準確率提高了10倍.

在技術創(chuàng)新方面，研究人員也在努力發(fā)現(xiàn)新的CRISPR系統(tǒng)，并通過與其他技術結合擴展其應用范圍.Silvana Konermann等發(fā)現(xiàn)歸類為VI-D型的靶向RNA的CRISPR系統(tǒng)[63].受CRISPR系統(tǒng)參與細菌免疫調(diào)節(jié)機制的啟發(fā)，Doron S等通過測試抗噬菌體活性[64]，發(fā)現(xiàn)9個新的抗噬防御系統(tǒng)家族和1個在微生物中廣泛存在的抗質粒系統(tǒng)，并顯示出強烈的抗外來DNA入侵的能力.一旦它們的機制被破譯，將來可能會被改造成有用的分子工具.Hansen-Bruhn M等開發(fā)一種使用超聲推進的方法將CRISPR-Cas9輸送進癌細胞的納米馬達[65]，通過可逆的二硫鍵將Cas9-sgRNA復合物加載到納米馬達表面上，隨后超聲處理5 min使其穿透細胞質膜，這對臨床治療應用有很大價值.

毫無疑問，未來將會出現(xiàn)更多以新方式應用CRISPR技術來提高人類生存質量的例子.除了利用CRISPR技術獨特的優(yōu)勢和能力，研究人員還應該專注于將新的基因編輯工具與其他成熟技術相結合，以提供更靈活、強大的技術手段，從而更好地造福人類.