王 耀

曹金博2,3

李鐵梅4

龐杏豪1

胡驍飛2

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；3. 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西 咸陽 712100；4. 中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176)

鹽酸可樂定(clonidine hydrochloride，CLO)屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腎上腺素α2受體激動劑，分子式為C9H10Cl3N3，分子量為266，分子結(jié)構(gòu)式如圖1(a)所示。臨床上CLO在治療高血壓、心律失常等方面有較好的療效，同時與中樞神經(jīng)抑制藥、降壓藥合用具有協(xié)同促進作用[1-3]。CLO屬于咪唑啉的衍生物，臨床上可顯著促進激素水平升高，將其添加在動物飼料中可促進禽畜垂體分泌生長激素，進而促進生長，提高瘦肉率[4-6]，是一種新型的瘦肉精類藥物。CLO的毒副作用較大，食用一定量含CLO殘留的動物源性食品后，將會出現(xiàn)口干、嗜睡、頭痛、惡心、嘔吐、便秘、心悸等中毒癥狀，嚴重者危及生命[7-8]。農(nóng)業(yè)部1519號公告中已經(jīng)嚴令禁止在動物飼料及飲水中添加CLO，但仍有不法分子被經(jīng)濟利益驅(qū)動，在禽畜養(yǎng)殖中為提高動物生長速度和瘦肉率違法使用CLO，甚至在休藥期為掩蓋動物病情而繼續(xù)用藥，導致了CLO在動物體內(nèi)大量殘留，對人身健康產(chǎn)生極大威脅。

目前，高效液相色譜法[9]、氣相色譜法[10]、高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]等儀器檢測方法已被應用于CLO藥物殘留檢測，此類檢測方法雖然在靈敏度、準確度和假陰陽性率方面具有很大的優(yōu)勢，但樣品檢測需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員，且樣品前處理操作較為復雜，不適合運輸中易破壞的樣品和現(xiàn)場高通量樣品的快速篩查。而近年來免疫分析檢測技術(shù)發(fā)展迅速，尤其是基于抗原抗體特異性結(jié)合的經(jīng)典酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，不僅操作簡單、快速，而且靈敏度高，特異性強，可解決儀器檢測方法的局限，實現(xiàn)現(xiàn)場樣品的高通量快速篩查[13-14]。而基于免疫分析技術(shù)和膠體金示蹤技術(shù)發(fā)展而來的膠體金免疫層析檢測試紙(Colloidal gold immunochromatographic strip，ICS)可在5～10 min內(nèi)實現(xiàn)樣品肉眼可見的快速檢測，目前，ICS檢測方法已被廣泛用于各種農(nóng)獸藥、過敏原等殘留檢測。ELISA和ICS檢測方法的關(guān)鍵在于高親和力單克隆抗體(Monoclonal antibody，mAb)的制備，而高親和力mAb制備的關(guān)鍵在于高免疫原性人工抗原的合成。目前關(guān)于CLO的殘留檢測研究多為色譜檢測方法，而免疫學檢測方法研究較少，李丹妮等[15]基于兔抗CLO多克隆抗體建立了檢測CLO的ELISA檢測方法，但該方法在CLO人工抗原合成過程中，采用琥珀酸酣法對CLO半抗原改造溫度較高，條件不易控制，過程較為復雜。目前，關(guān)于CLO-mAb的制備以及基于CLO-mAb建立的用于檢測CLO殘留的ELISA和ICS檢測方法的研究較少。CLO分子結(jié)構(gòu)上無可用于偶連載體蛋白的活潑基團，試驗擬基于結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應性原理，以CLO的衍生物鹽酸阿可樂定(Apraclonidine hydrochloride，ACLO)[結(jié)構(gòu)式如圖1(b)所示]為半抗原，建立一種新的人工抗原偶聯(lián)方法(戊二醛法)一步合成CLO人工抗原，以期為高親和力CLO-mAb的制備奠定良好的基礎(chǔ)。

圖1 CLO和ACLO分子結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

CLO、苯乙醇胺A(PA)、巴氯芬(BA)、沙丁胺醇(SAL)、萊克多巴胺(RAC)：純度≥99%，美國Sigma公司；

弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、牛血清蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA)：純度≥99%，美國Sigma公司；

戊二醛(GA)：純度50%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

羊抗鼠酶標二抗(GaMIgG-HRP)；美國Jackson Immuno Research公司；

稀釋液(PBS)、包被液(CBS)、洗滌液(含0.5%吐溫-20 的PBS溶液，PBST)、封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST溶液)、顯色液(TMB)、終止液(2 mol/L的稀硫酸)等：河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室自制。

1.1.2 儀器與設(shè)備

在商業(yè)銀行理財產(chǎn)品的司法實踐中，投資者權(quán)益遭受損害的案例屢見不鮮，商業(yè)銀行忽視甚至侵犯投資者權(quán)益的問題主要體現(xiàn)在以下幾個方面：

電子天平：BSA224S型，德國Sartorius公司；

酶標儀：Multiskan FC型，美國Thermo Scientific公司；

振蕩器：Vortex2型，艾卡儀器設(shè)備有限公司；

高速均質(zhì)乳化機：T8.10型，艾卡儀器設(shè)備有限公司；

控溫磁力攪拌器：SZCL-2型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

恒溫培養(yǎng)箱：HPX-9052MBE型，上海博迅實業(yè)有限公司；

紫外—可見分光光度計：UV-5100H型，美國Thermo Fisher公司；

電泳儀：DYY-6C型，大連捷邁科貿(mào)有限公司；

凝膠成像儀：ChemiDocTMXRS+型，美國Bio-Rad公司。

1.1.3 試驗動物

BALB/c小鼠：6～8周齡SPF級，河南省實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原合成 采用GA一步法合成CLO人工抗原[16]，其中免疫抗原(CLO-BSA)合成路線圖如圖2所示。稱取3 mg ACLO溶于0.5 mL 0.1 mol/mL的稀HCl溶液(A液)，2.5 mg BSA溶于1 mL CBS緩沖液(B液)，將A液逐滴滴加到B液中，攪拌均勻。然后向混合液中滴加25%的GA溶液2.6 μL，室溫條件避光偶聯(lián)4 h。反應結(jié)束后，將反應液轉(zhuǎn)移到透析袋中，4 ℃條件下用PBS透析3 d，透析結(jié)束后，離心去除沉淀，上清保存于-20 ℃?zhèn)溆?。包被抗?CLO-OVA)合成方法同上。

圖2 CLO-BSA人工抗原合成路線

1.2.2 人工抗原鑒定

(1) 紫外掃描鑒定：采用紫外掃描法鑒定CLO人工抗原偶聯(lián)效果，具體操作為：用PBS緩沖液配置濃度一致的CLO-BSA、CLO標準品和BSA稀釋液，然后在220～350 nm波長范圍內(nèi)，利用紫外—可見分光光度計分別掃描各稀釋液，通過分析紫外吸收光譜中人工抗原特征吸收峰特征及相對CLO標品和BSA載體變化，判斷偶聯(lián)效果。

(2) SDS-PAGE鑒定：參照文獻[17]配置電泳所需5%的濃縮膠和12%的分離膠，選擇濃縮膠和分離膠電壓分別為60，90 V，上樣量為10 μL(含人工抗原5 μg)。跑膠結(jié)束后用考馬斯亮藍染液染色3～4 h，脫色液脫色6 h，最后用凝膠成像儀掃描拍照，根據(jù)電泳條帶位置差異判斷偶聯(lián)效果。

1.2.3 鼠源多抗血清的制備與鑒定 選擇4只6周齡雌性BALB/c小鼠，采用背部皮下注射方法進行免疫。首免為基礎(chǔ)免疫，將免疫抗原用無菌PBS稀釋后與等體積FCA混合，乳化器充分乳化至乳白色且在水中無明顯擴散現(xiàn)象時進行免疫，免疫劑量為200 μL/只(含30 μg CLO-BSA)。首免3周后，進行加強免疫，其中免疫佐劑FCA用FIA代替，在第4次加強免疫10 d后斷尾采血，用CLO-OVA包被ELISA板鑒定多抗血清效價、敏感性和特異性。

(1) 鼠源多抗血清效價測定：采用間接ELISA(i-ELISA)方法[18]測定CLO多抗血清效價。具體操作為：用CBS包被緩沖液將CLO-OVA稀釋成1 mg/mL的稀釋液，每孔100 μL加入ELISA板中，4 ℃進行過夜包被，然后用PBST洗滌液洗板4次，甩干孔內(nèi)液體后每孔加入250 μL封閉液，37 ℃孵育1 h，PBST洗板甩干后于4 ℃保存?zhèn)溆?。檢測時取CLO-OVA包被好的ELISA板，每孔加入100 μL PBS鋪底，首孔加入100 μL小鼠多抗血清，倍比稀釋至倒數(shù)第二孔(陽性孔)，最后一孔不加血清設(shè)為空白對照(共12個孔)，37 ℃孵育15 min后用PBST洗板。甩干孔內(nèi)液體后，每孔加入100 μL的GaMIgG-HRP稀釋液(封閉液稀釋1 000倍)，37 ℃孵育30 min后用PBST洗板、甩干。然后每孔加入100 μL TMB顯色液，室溫條件下避光顯色10 min，最后每孔加入100 μL終止液，馬上在酶標儀中讀取OD450 nm值。陽性判定標準為：待測孔OD450 nm值大于空白孔OD450 nm值的2.1倍。以陽性孔最小OD450 nm值所對應的多抗血清稀釋倍數(shù)作為血清效價。

(2) 鼠源多抗血清敏感性鑒定：采用間接競爭ELISA(ic-ELISA)方法[19]鑒定CLO多抗血清敏感性。具體操作為：取CLO-OVA包被的ELISA板，將CLO標準品用PBS倍比稀釋至不同的質(zhì)量濃度(500.000，250.000，125.000，62.500，31.250，15.625，7.813，3.906，1.953，0.977，0.000 ng/mL)，每孔100 μL加入ELISA板中，最后一孔加入100 μL PBS(空白對照)，然后每孔加入100 μL一定稀釋度的CLO多抗血清(效價測定時OD450 nm為1.2左右)至倒數(shù)第二孔，37 ℃孵育15 min。其他操作步驟與效價測定相同。繪制多抗血清對CLO的標準抑制曲線時，以B/B0為縱坐標(B和B0分別為CLO陽性孔和CLO質(zhì)量濃度為0時的OD450 nm值)，以CLO質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標。最后由標準曲線回歸方程計算多抗血清對CLO的半數(shù)抑制濃度(IC50)，并以此來評價多抗血清的敏感性。

(3) 鼠源多抗血清特異性鑒定：選擇幾種常見的瘦肉精類藥物(PA、BA、SAL、RAC)作為競爭物，利用ic-ELISA鑒定多抗血清的特異性，以交叉反應率(CR)來評價多抗血清特異性，CR越低說明特異性越強[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對所得的數(shù)據(jù)利用Graphpad Prism 8.0進行處理，對分子結(jié)構(gòu)式及合成路線圖用ChemDraw Pro 18.0進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原鑒定

2.1.1 UV鑒定 CLO為小分子半抗原，單獨不具備免疫原性，無法直接刺激機體產(chǎn)生免疫應答反應，而通過與大分子載體蛋白(BSA、OVA等)偶聯(lián)合成的人工抗原后則可獲得免疫原性。CLO分子上無可直接用于偶聯(lián)的活性基團，試驗以苯環(huán)4位上引入胺基的CLO的衍生物ACLO為半抗原，采用GA一步法將ACLO與載體蛋白偶聯(lián)合成新的CLO人工抗原，反應條件溫和，操作簡單。同時為最大程度地避免自連反應的發(fā)生，嚴格控制各反應物摩爾比(nACLO∶nBSA∶nGA=1∶1∶1)。然后利用UV法對合成的人工抗原進行初步鑒定，結(jié)果如圖3所示，BSA、OVA的特征吸收峰均出現(xiàn)在280 nm處左右，CLO在270 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，CLO-BSA在270 nm處左右出現(xiàn)特征吸收峰，相比載體蛋白發(fā)生明顯偏移，相比CLO略發(fā)生偏移。CLO-OVA在260 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，相比載體蛋白和CLO均發(fā)生明顯偏移。特征吸收峰的變化是由于分子內(nèi)特征基團變化引起的，即ACLO與載體蛋白偶聯(lián)導致原有基團發(fā)生變化，也間接證明人工抗原偶聯(lián)成功。

2.1.2 SDS-PAGE鑒定 如圖4所示，BSA在63 kDa處出現(xiàn)電泳條帶，而CLO-BSA的電泳條相比BSA略微向上，說明其遷移距離小于BSA，這是由于合成的人工抗原CLO-BSA的分子量大于BSA的緣故，同樣也間接證明CLO成功偶聯(lián)到載體蛋白上。

2.2 多抗血清鑒定

2.2.1 效價 如表1所示，免疫的4只BALB/c小鼠，其多抗血清效價均在1∶12 800以上，3號小鼠血清效價最高，可達1∶25 600以上，說明免疫抗原在小鼠體內(nèi)成功刺激機體免疫應答，產(chǎn)生相應抗體。但CLO為小分子半抗原，還需通過敏感性試驗進一步驗證多抗血清是否能夠識別并結(jié)合CLO。

圖3 BSA、OVA、CLO-BSA、CLO-OVA、CLO紫外掃描圖

圖4 CLO-BSA的SDS-PAGE鑒定結(jié)果

表1 CLO多抗血清效價測定結(jié)果

2.2.2 敏感性 如表2所示，免疫的4只小鼠所獲得的多抗血清均可特異性識別并結(jié)合CLO，對其具有顯著的抑制作用，其抑制曲線如圖5所示，4只小鼠多抗血清對CLO的IC50分別為153.90，94.58，82.75，139.05 ng/mL，其中多抗血清敏感性最好的是3號小鼠，多抗血清對CLO的標準抑制曲線線性回歸方程為y=-0.273 6x+1.024 7，R2=0.979 2，可選擇3號小鼠作為細胞融合小鼠，后期可通過細胞融合和單克隆抗體篩選技術(shù)制備CLO-mAb。

敏感性鑒定結(jié)果最終確證ACLO成功偶聯(lián)到載體蛋白上，獲得了較好的免疫原性，暴露的抗原位點成功刺激機體免疫應答，產(chǎn)生了敏感性較好的CLO多克隆抗體。

表2 CLO多抗血清間接競爭ELISA測定結(jié)果

圖5 多抗血清對CLO的間接競爭ELISA抑制曲線

2.2.3 特異性 選擇敏感性最好的3號小鼠多抗血清與其他競爭物進行交叉反應試驗，試驗結(jié)果表明(表3)，多抗血清僅能特異性識別CLO，與PA、BA、SAL、RAC不存在交叉反應，具有較高的特異性。同時也表明，基于此后期所制備的CLO-mAb，在實際應用于ELISA、ICA檢測方法時，也將能專一性檢測CLO殘留，有效排除其他瘦肉精類藥物的干擾。

表3 CLO多抗血清特異性鑒定結(jié)果

3 結(jié)論

鹽酸可樂定作為在禽畜養(yǎng)殖中嚴令禁止添加的一種新型瘦肉精類藥物，其免疫學快速檢測方法(酶聯(lián)免疫吸附試驗、膠體金免疫層析試紙檢測)在實際樣品現(xiàn)場高通量快速篩查中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，酶聯(lián)免疫吸附試驗和膠體金免疫層析試紙檢測方法建立的關(guān)鍵在于高免疫原性人工抗原的合成和高親和力單克隆抗體的制備。試驗采用戊二醛一步法成功合成高免疫原性的鹽酸可樂定人工抗原，相比前人研究，合成方法更加簡單，免疫小鼠后獲得的多抗血清效價高達1∶25 600以上，并能特異性識別鹽酸可樂定(半數(shù)抑制質(zhì)量濃度為82.75 ng/mL)，與其他幾種常見的瘦肉精類藥物無交叉反應，具有較高的特異性?；谥苽涞柠}酸可樂定高親和力單克隆抗體可建立快速檢測鹽酸可樂定殘留的酶聯(lián)免疫吸附試驗和膠體金免疫層析試紙檢測方法，為鹽酸可樂定殘留監(jiān)控提供有力的技術(shù)手段。