朱釗雯，賈衛(wèi)娟，劉潔瓊

胞膜蛋白（plasma membrane proteins，PMPs）癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸等過程有關(guān)，隨著這些基因表達(dá)水平的改變，細(xì)胞無(wú)限增殖、粘附細(xì)胞外基質(zhì)、侵入血管或淋巴管、于靶器官定植的能力也發(fā)生了相應(yīng)的變化［1-3］。乳腺癌現(xiàn)已成為危害女性健康最常見的癌癥［4］，而luminal型乳腺癌占所有乳腺癌的70%以上［5］。

由于PMPs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中經(jīng)過受體配體結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生物效應(yīng)，成為許多抗癌藥物研發(fā)的目標(biāo)靶點(diǎn)［6］，如多種細(xì)胞表面受體和離子通道［7-9］。然而，近來除了CDK4/6抑制劑外，應(yīng)用于Luminal型乳腺癌的新型PMPs相關(guān)治療靶向有限［10］。同時(shí)，鑒于PMPs表達(dá)于細(xì)胞膜上，便于臨床上的定性定量檢測(cè)，更能快速有效地獲取每一位患者的相應(yīng)腫瘤表達(dá)特點(diǎn)，進(jìn)而運(yùn)用于臨床工作。本研究旨在獲得一種有效的Luminal型乳腺癌PMPs相關(guān)預(yù)后預(yù)測(cè)模型，同時(shí)盡可能為L(zhǎng)uminal型乳腺癌患者篩選出潛在的PMPs相關(guān)治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本及數(shù)據(jù)采集

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載Luminal型乳腺癌轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和這些患者的臨床信息作為訓(xùn)練集，包括769例Luminal型乳腺癌和111例正常組織樣本。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：患者①無(wú)乳腺癌分子分型信息；②不具備完整的臨床數(shù)據(jù)：包括總生存期（overall survival，OS）、生存狀態(tài)、診斷年齡、腫瘤大小（T）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（N）。另外，我們從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載了兩個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集GSE20685和GSE37751中的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)及臨床信息作為外部驗(yàn)證集。最終，246例Luminal型乳腺癌患者被納入驗(yàn)證集。同時(shí)我們從人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了相應(yīng)的PMPs基因列表。

1.2 訓(xùn)練集差異表達(dá)基因分析

利用R軟件中Limma包將腫瘤組織與正常組織進(jìn)行比較，得到所有差異表達(dá)基因（deferentially expressed genes，DEGs）和差異表達(dá)PMPs（DEPMPs）。篩選條件為logFC＞0.5，P＜0.05。

1.3 PMPs預(yù)后模型

首先，將DEPMPs的基因表達(dá)量與相應(yīng)患者的OS和生存狀態(tài)相結(jié)合，篩選出影響預(yù)后的DEPMPs，進(jìn)一步運(yùn)用多因素Cox回歸分析建立PMPs相關(guān)預(yù)后預(yù)測(cè)模型。將構(gòu)建模型中相關(guān)基因表達(dá)水平與各自的Cox回歸系數(shù)相乘，得到每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（RiskScore）根據(jù)RiskScore中位數(shù)將訓(xùn)練集中的患者劃分為高危組和低危組。兩組生存差異采用Kaplan-Meier生存分析及l(fā)og-rank檢驗(yàn)，并計(jì)算ROC曲線下面積，驗(yàn)證RiskScore的有效性和預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。

1.4 多基因預(yù)后模型驗(yàn)證

利用驗(yàn)證集中246例Luminal型乳腺癌患者的數(shù)據(jù)驗(yàn)證上述模型的臨床有效性。計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，構(gòu)建K-M生存分析和ROC曲線驗(yàn)證預(yù)后預(yù)測(cè)模型的有效性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用R軟件通過Survival ROC包計(jì)算ROC曲線的AUC以檢驗(yàn)預(yù)后模型的有效性。對(duì)于K-M曲線，通過log-rank和單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析得到95%置信區(qū)間的P值和風(fēng)險(xiǎn)比（HR）。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)都是雙向的。P＜0.05被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)基因DEGs

首先，從訓(xùn)練集中得到所有的DEGs（圖1A），進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Luminal型乳腺癌的DEPMPs基因中有59個(gè)上調(diào)基因和85個(gè)下調(diào)基因（圖1B）。

2.2 預(yù)后模型的建立

通過單因素Cox回歸分析，從DEPMPs中篩選出30個(gè)預(yù)后相關(guān)基因（圖2），進(jìn)一步通過多變量Cox回歸分析，構(gòu)建出一個(gè)包含11個(gè)基因的預(yù)后預(yù)測(cè)模型，模型計(jì)算公式如下：［ADRA1B的基因表達(dá)量*（0.164496）］+［CD99L的基因表達(dá)量*（0.35221）］+［EZR的基因表達(dá)量*（0.33013）］+［IYD的基因表達(dá)量*（0.119785）］+［RGS9BP的基因表達(dá)量*（0.125277）］+［SLC16A2的基因表達(dá)量*（0.165859）］+［DUS1L的基因表達(dá)量*（-0.57798）］+［KIT的基因表達(dá)量*（-0.07974）］+［MS4A1的基因表達(dá)量*（-0.06685）］+［PI3的基因表達(dá)量*（-0.0783）］+［SUSD2的基因表達(dá)量*（-0.07928）］。由圖2可知，ADRA1B、CD99L2、EZR、IYD、RGS9BP及SLC16A2高表達(dá)和DUS1L、KIT、MS4A1、PI3及SUSD2的低表達(dá)均與患者預(yù)后不良有關(guān)。據(jù)此計(jì)算所有患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)將患者分為高危組和低危組（圖3A）。同時(shí)我們繪制得到了患者的生存狀態(tài)圖（圖3B）和11個(gè)預(yù)后基因的生存熱圖（圖3C）。單因素Cox回歸分析顯示，包括診斷年齡、分期、T、N在內(nèi)的臨床特征和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分都不同程度地影響患者的預(yù)后（圖4A）。多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析表明診斷年齡、分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的P值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B）。為了預(yù)測(cè)患者的OS，我們得到了高危組和低危組之間的K-M生存曲線，發(fā)現(xiàn)高危組的總生存期明顯低于低危組（圖4C）。此外，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC為0.825，表明該模型可能具有較好的預(yù)后預(yù)測(cè)潛力（圖4D）。

圖1 DEGs基因（圖1A）與DEPMPs基因（圖1B）

圖2 預(yù)后相關(guān)DEPMPs基因紅色為HR＞1，綠色為HR＜1

2.3 多基因預(yù)后模型的驗(yàn)證

利用驗(yàn)證集的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)預(yù)后預(yù)測(cè)模型進(jìn)行驗(yàn)證，計(jì)算驗(yàn)證集中所有患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分并將患者分為高危組和低危組。結(jié)果提示高危組患者預(yù)后較低危組差（圖5A），且風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分ROC曲線下面積為0.861（圖5B），進(jìn)一步證明該模型具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3 討論

本研究中，我們建立并驗(yàn)證了可行的Luminal型乳腺癌PMPs預(yù)后預(yù)測(cè)模型。通過分析Luminal型乳腺癌PMPs預(yù)后相關(guān)基因，我們構(gòu)建了一個(gè)包含高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)基因ADRA1B、CD99L2、EZR、IYD、RGS9BP和SLC16A2，以及低風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)基因DUS1L、KIT、MS4A1、PI3和SUSD2的預(yù)后預(yù)測(cè)模型。

圖3 預(yù)后模型的特征患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（圖3A）、生存狀態(tài)圖（圖3B）和模型中預(yù)后基因的生存熱圖（圖3C）

據(jù)報(bào)道，ADRAIB（腎上腺素受體α1B）增加細(xì)胞增殖的同時(shí)減少細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致較長(zhǎng)的腫瘤生存時(shí)間和腫瘤復(fù)發(fā)［11］。CD99L2可以幫助中性粒細(xì)胞突破內(nèi)皮基膜并遷移到炎癥組織中［12］。EZR已被證實(shí)在多種癌癥的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用［13，14］。Ezrin由EZR編碼，交聯(lián)胞膜和構(gòu)建細(xì)胞骨架，Ezrin的磷酸化依賴于TGF-β和MAPK通路的激活，參與癌癥的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致疾病進(jìn)展和低生存率［15，16］。有研究報(bào)道IYD能夠抑制肝癌細(xì)胞糖酵解，進(jìn)而通過增加有氧糖酵解支持癌細(xì)胞的存活和增殖，并導(dǎo)致癌癥患者預(yù)后較差［17］。RGS9BP在趨化因子誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞遷移中發(fā)揮作用，負(fù)調(diào)控naive和調(diào)節(jié)T細(xì)胞遷移的能力，從而影響T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答［18］。作為SLC16基因家族中與生存相關(guān)的代謝基因，編碼MCT8的SLC16A2的表達(dá)減少與部分頭頸部癌癥患者生存的改善相關(guān)［19］。

在乳腺癌中，KIT編碼的CD117+造血祖細(xì)胞，可在腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之前，便被富集至肺部誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，進(jìn)而為腫瘤的肺部轉(zhuǎn)移與定植提供條件［20］。而在血液系統(tǒng)疾病中，抗人CD117嵌合抗原受體T細(xì)胞可有效治療骨髓增生異常綜合征與急性髓系白血病，這也為乳腺癌肺轉(zhuǎn)移患者的靶向治療提供了啟示［21］。SUSD2編碼含822個(gè)氨基酸的蛋白，與半凝集素-1相互作用，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的免疫逃逸與轉(zhuǎn)移、腫瘤血管新生，并顯著減少CD4腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，這表明SUSD2可能是乳腺癌甚至其他癌癥的新靶點(diǎn)［22，23］。

圖4 模型的預(yù)后價(jià)值單因素Cox回歸分析（圖4A）；多因素Cox回歸分析（圖4B）；高低風(fēng)險(xiǎn)組患者生存曲線（圖4C）和ROC曲線（圖4D）

圖5 預(yù)后模型效能的驗(yàn)證：高低風(fēng)險(xiǎn)組患者生存曲線（圖5A）和ROC曲線（圖5B）

無(wú)論在訓(xùn)練集還是驗(yàn)證集中，高危患者的預(yù)后都明顯較差。進(jìn)一步采用多因素Cox回歸分析，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC均大于0.8。在類似的研究中，腫瘤突變負(fù)荷、自噬、不同表達(dá)的mRNA或免疫相關(guān)預(yù)后信號(hào)的AUC分別為0705、0.742、0.785、0.83［24，25］。因此，我們的基于11個(gè)基因的預(yù)后預(yù)測(cè)模型可能有更好的臨床應(yīng)用潛力，而其中一些基因甚至可能成為有效的治療靶點(diǎn)。基于11個(gè)預(yù)后模型相關(guān)基因，我們認(rèn)為可以為深入的實(shí)驗(yàn)研究提供一些新的研究思路。

同時(shí)，本研究也存在一些局限性。首先，我們還需要更多的功能性實(shí)驗(yàn)來探索和驗(yàn)證我們的PMPs預(yù)后預(yù)測(cè)模型的有效性，以及它們是否有可能成為精準(zhǔn)治療的治療靶點(diǎn)。其次，基于研究現(xiàn)狀，我們暫且僅能關(guān)注于已被發(fā)現(xiàn)及驗(yàn)證的在PM上表達(dá)的蛋白質(zhì)，而不是所有的PMPs。