陳小珠，黃鳳榮，劉運洪，劉淑軍，譚鋼文

（1.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院超聲科，廣東深圳 518109；2.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東深圳 518109；3.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518109）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者因發(fā)生急性冠狀動脈阻塞導(dǎo)致心肌缺血壞死，可引起相對應(yīng)心肌的運動及功能受損。心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTn）等標(biāo)志物是確診AMI 的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而這些標(biāo)志物僅在AMI 急性發(fā)病前3～6 h 會升高，預(yù)警時效性不足，臨床上多半不能在患者急性發(fā)病前通過這些指標(biāo)進(jìn)行及時的判斷和做出干預(yù)。因此，尋找預(yù)警時效更早的診斷方法很有必要。實時三維斑點追蹤超聲心動圖（real-time three dimensional speckle tracking echocardiography，RT3D-STE）評估非透壁梗死和透壁梗死的左心室應(yīng)變有差異［1-2］。在心肌損傷釋放出cTn 之前，三維（3D）左心室應(yīng)變就開始下降，隨疾病進(jìn)展，可出現(xiàn)左心室不良重構(gòu)［3-4］。大量研究表明，微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）在心肌梗死后的細(xì)胞凋亡、血管生成以及梗死后的心肌修復(fù)中起到關(guān)鍵作用［5］。由于miRNA 是調(diào)控性RNA，在疾病早期即有顯著變化，現(xiàn)有研究證實，miRNA 的不同亞型在AMI 出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)或下調(diào)，是極具診斷潛能的生物標(biāo)志物［6］。因此，本研究應(yīng)用RT3D-STE 檢查和外泌體miRNA 檢測，研究其在評估早期AMI 危險程度中的價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2019 年3 月至2021 年7 月入住深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院并行冠狀動脈造影（coronary angiography，CAG）的40 例AMI 患者為研究對象，其中男34例，女6例，年齡（52.9±10.63）歲。所有入組的AMI 患者均為首次發(fā)作。本研究經(jīng)深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，已取得所有入選者的知情同意，并簽署知情同意書。AMI 診斷符合2018 年“心肌梗死全球統(tǒng)一定義”的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，排除了患有心房顫動、外傷、腦卒中、急性感染、合并自身免疫病、嚴(yán)重肝及腎功能障礙、惡性腫瘤等疾病的患者。另選同期于深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院參加體檢的20 名健康者為對照組（正常組），其中男17 例，女3 例，年齡（50.05±4.80）歲。收集所有研究對象的臨床基礎(chǔ)資料，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、原發(fā)性高血壓（高血壓）病史、糖尿病病史、高脂血癥病史、胸痛史、Killip 分級；生化指標(biāo)檢查：血脂、血糖、腎功能、心肌酶及心肌二項［肌紅蛋白（myohemoglobin，MYOG）、cTnI］。

1.2 實時三維斑點追蹤超聲心動圖檢查

所有AMI 患者均在行CAG 后24 h 內(nèi)，由一名專職醫(yī)生進(jìn)行RT3D-STE 檢查。采用GE Vivid E9彩色多普勒超聲診斷儀，4V 矩陣探頭，頻率1.5～4.0 MHz，4DAutoLVQ 分析軟件。所有受檢者均取左側(cè)臥位，同步記錄心電圖，先進(jìn)行常規(guī)二維超聲檢查，然后在標(biāo)準(zhǔn)心尖四腔觀采集單一心動周期左心室三維容積動態(tài)圖像。啟動4DAutoLVQ 分析軟件并按步點擊，軟件自動計算出左心室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收縮末期容積（left ventricular end systolic volume，LVESV）、左心室每搏輸出量（left ventricular stroke volume，LVSV）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、心排血量（cardiac output，CO）、球形指數(shù)（spherical index，SpI）及左心室質(zhì)量（left ventricular mass，LVMass），并獲取三維左心室整體長軸應(yīng)變（three-dimensional global long axis strain，3D-GLS）、環(huán)周應(yīng)變（threedimensional global circumferential strain，3D-GCS）、徑向應(yīng)變（three-dimensional global radial strain，3DGRS）及面積應(yīng)變（three-dimensional global area strain，3D-GAS）和17 節(jié)段縱向應(yīng)變（segmental longitudinal strain，SLS）、環(huán)周應(yīng)變（segmental circumferential strain，SCS）、徑向應(yīng)變（segmental radial strain，SRS）、面積應(yīng)變（segmental area strain，SAS）的彩色編碼牛眼圖，見圖1（A-D）。

圖1 同一AMI 患者（男，53 歲）的RT3D-STE 圖像（A：LVEF 為62.64%、SpI 為0.31，心內(nèi)、外膜心肌質(zhì)量為141 g、143 g；B：長軸應(yīng)變，顯示3D-GLS 及17節(jié)段LS；C：面積應(yīng)變，顯示3D-GAS 及17節(jié)段AS；D：徑向應(yīng)變，顯示3D-GRS 及17節(jié)段RS）

1.3 分組及miRNA 檢測方法

由心血管內(nèi)科醫(yī)師依據(jù)所有AMI 患者的CAG結(jié)果在SYNTAX 自有網(wǎng)在線計分，將SYNTAX 評分≥23 分且“罪犯血管”為近端閉塞者分為高危組，將SYNTAX 評分＜23 分且“罪犯血管”為中遠(yuǎn)端閉塞者分為低危組，每組各20 例。所有AMI 患者在CAG 前采集外周血血清存儲，為了防止誤差，在所有樣本收集完畢后，選取20 例集中進(jìn)行外泌體miRNA 測序（由深圳市承啟生物科技有限公司根據(jù)合同承擔(dān)）。高質(zhì)量的reads 去接頭后，使用FANSe3 序列比對算法［8］向人類成熟miRNA 參考序列上比對，以每百萬讀數(shù)的轉(zhuǎn)錄本（transcripts in million，TPM）對miRNA 進(jìn)行定量標(biāo)準(zhǔn)化。使用edgeR［9］算法進(jìn)行差異表達(dá)分析。上調(diào)或下調(diào)超過2 倍的miRNA，且錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.01 被定義為顯著差異表達(dá)的miRNA。分別與CAG 分組結(jié)果、三維左心室應(yīng)變參數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料以（）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，3 組間比較用單因素方差分析。偏態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)［M（Q1～Q3）］表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗。分類變量采用［n（%）］表示，組間比較用卡方（χ2）檢驗。兩組間相關(guān)性分析采用Pearson 檢驗。繪制受試者工作特征（receptor operating characteristic，ROC）曲線分析應(yīng)變指標(biāo)對冠狀動脈閉塞病變的評估價值。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高危組、低危組和正常組研究對象的臨床資料和生化指標(biāo)比較

3 組研究對象的一般臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；生化指標(biāo)中高危組和低危組患者的心肌酶及心肌二項均顯著高于正常組，且高危組高于低危組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；3 組研究對象其余生化指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 3 組研究對象的臨床資料、生化指標(biāo)及冠狀動脈病變比較 ［n=20，n（%），M（Q1～Q3），］

表1 3 組研究對象的臨床資料、生化指標(biāo)及冠狀動脈病變比較 ［n=20，n（%），M（Q1～Q3），］

注：與正常組比較，**P＜0.01；與低危組比較，1）*P＜0.05

2.2 3 組研究對象RT3D 左心室一般參數(shù)比較

高危組患者RT3D 左心室一般參數(shù)與低危組、正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且LVEF低于50%；低危組患者的CO 及LVEF 比正常組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），其他參數(shù)與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 3 組研究對象RT3D 左心室一般參數(shù)比較 ［n=20，］

表2 3 組研究對象RT3D 左心室一般參數(shù)比較 ［n=20，］

注：與正常組比較，*P＜0.05；與低危組比較，1）*P＜0.05

2.3 3 組研究對象RT3D 左心室應(yīng)變參數(shù)比較

高危組患者的左心室應(yīng)變參數(shù)（3D-GLS、3D-GCS、3D-GAS及3D-GRS）與低危組、正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；3組研究對象的RT3D左心室應(yīng)變參數(shù)差異變化程度為高危組＞低危組＞正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），詳見表3。

表3 3 組研究對象RT3D 左心室應(yīng)變參數(shù)比較 ［n（%），n=20，］

表3 3 組研究對象RT3D 左心室應(yīng)變參數(shù)比較 ［n（%），n=20，］

注：與正常組比較，**P＜0.01；與低危組比較，1）**P＜0.05

2.4 受試者工作特征曲線分析結(jié)果

RT3D 左心室應(yīng)變參數(shù)（3D-GLS、3D-GCS、3D-GAS 及3D-GRS）鑒別高危組與低危組的ROC曲線詳見圖2，診斷效能詳見表4，曲線下面積（area under the curve，AUC）由大到小依次為3D-GLS（0.908）、3D-GAS（0.894）、3D-GRS（0.874）及3DGCS（0.803）。以3D-GLS＝-9.31%為臨界值，其診斷敏感度為80%，特異度為90%。

圖2 整體應(yīng)變參數(shù)高危組與低危組的ROC 曲線圖

表4 RT3D 應(yīng)變參數(shù)診斷高危組的ROC 曲線分析結(jié)果 ［n=40］

2.5 RT3D 左心室應(yīng)變參數(shù)區(qū)分高危組、低危組和正常組的效果分析

精細(xì)分析RT3D 左心室應(yīng)變參數(shù)的GLS、GAS、GRS、GCS 4 個指標(biāo)，每個指標(biāo)都能顯著區(qū)分高危組、低危組和正常組，詳見圖3A；Mann-Whitney Utest 的P值，除了GAS 在高危組和低危組中為0.0011，其余均在10-5～10-8，詳見圖3B。將4 個指標(biāo)做主成分分析，第一個主成分（PC1）占了91.73%的貢獻(xiàn)率，也能極顯著地區(qū)分開3 組，詳見圖3C（Mann-Whitney U-test，P＜10-5）。

圖3 左心室應(yīng)變指標(biāo)對高危組、低危組、正常組的區(qū)分效果（A：4 項指標(biāo)對3 組的區(qū)分；B：對（A）中各組之間兩兩比較的Mann-Whitney U-test 結(jié)果；C 將4 個指標(biāo)進(jìn)行PCA 分析，取PC1 進(jìn)行繪圖）

2.6 從外泌體miRNA 中尋找區(qū)分高危組、低危組和正常組的分子標(biāo)志物

為了區(qū)分高危組和低危組，我們選取了以下的外泌體miRNA 篩選標(biāo)準(zhǔn)：（a）按差異程度排序在前200 名；（b）高危、低危組和正常組均差異有統(tǒng)計學(xué)意義；（c）Kendall correlation 絕對值＞0.5；（d）該miRNA 的量與RT3D 左心室應(yīng)變指標(biāo)的Pearson 相關(guān)系數(shù)均＞0.6。經(jīng)此4 項條件的篩選，最終篩選出2 個外泌體miRNA：miR-3681-5p 和miR-152-5p，其與3D-GLS、3D-GAS、3D-GCS 呈負(fù)相關(guān)，與3D-GRS 呈正相關(guān)，Pearson 相關(guān)系數(shù)為0.69～0.83，詳見圖4。

圖4 左心室應(yīng)變參數(shù)與miRNA 的相關(guān)性分析圖

2.7 miR-3681-5p 和miR-152-5p 是高效區(qū)分高危組、低危組和正常組的miRNA 標(biāo)志物

使用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）對miR-3681-5p 和miR-152-5p 進(jìn)行驗證，以U6 為內(nèi)參。高危組、低危組和正常組3 組各6 個樣本的qRTPCR 結(jié)果顯示，單個miR-3681-5p 即可完全區(qū)分3 組（P=0.0013，Kolmogorov-Smirnovtest）。miR-152-5p 不能有效區(qū)分低危組和正常組（P=0.32，Kolmogorov-Smirnovtest），但可以區(qū)分高危組和低危組（P=0.0013，Kolmogorov-Smirnovtest），詳見圖5。因此，miR-3681-5p 和miR-152-5p 很可能是高效區(qū)分3 組的miRNA 標(biāo)志物。

圖5 miR-3681-5p 和miR-152-5p 的qRT-PCR 驗證圖

3 討論

隨著國家胸痛中心規(guī)范性的建設(shè)，及時對AMI 患者施行CAG 并開通閉塞的冠狀動脈血管，挽救缺血瀕死的心肌，已經(jīng)大大提高了AMI患者的臨床救治效率。但是，對三支主要冠狀動脈病變伴近端閉塞的AMI 患者而言，往往因嚴(yán)重的心肌缺血壞死對心功能損傷嚴(yán)重，預(yù)后不良，即使進(jìn)行了經(jīng)皮冠狀動脈介入（percutaneous coronary stent implantation，PCI）治療，其后出現(xiàn)主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE）的危險性仍然很大，盡早識別判斷、盡早干預(yù)救治是減少MACE的關(guān)鍵［10-11］。本研究AMI患者分為高危組和低危組，能夠突出AMI 患者冠狀動脈病變的不同危險程度［12］。

RT3D-STE 可通過心臟全容積圖像獲取多個應(yīng)變參數(shù)，克服了2D-STE 的平面依賴，有利于準(zhǔn)確評價左心室心肌整體及局部功能，而三維應(yīng)變?yōu)樾募≡谌S方向上應(yīng)變的綜合，能更敏感地評估心肌功能。本研究應(yīng)用RT3D-STE 評價AMI高?；颊?，結(jié)果顯示隨著冠狀動脈病變復(fù)雜程度的加重，高?；颊叩腟pI、CO、LVEF 顯著降低，三維應(yīng)變參數(shù)異常嚴(yán)重，雖然3D-GLS、3D-GAS、3D-GCS 及3D-GRS 這4 個指標(biāo)均能夠鑒別高?；颊?，但以3D-GLS 和3D-GAS 檢測高?；颊叩拿舾行宰顝?qiáng)，以3D-GLS＝-9.31%為臨界值，敏感度為80%，特異度為90%。有研究顯示，AMI 患者如果在PCI 治療后持續(xù)存在明顯的心肌應(yīng)變參數(shù)異常，特別是長軸方向運動異常，往往預(yù)后不良，容易出現(xiàn)PCI 治療后再發(fā)心肌梗死、再發(fā)心力衰竭、惡性心律失?；蛩劳龅萂ACE 事件［13］。因此，對超聲參數(shù)——SpI、CO、LVEF、3D-GLS 和3D-GAS顯著異常的的高?；颊哌M(jìn)行長期（2.5 年）的隨訪，動態(tài)監(jiān)測上述指標(biāo)，可以觀察其對MACE 或者生存率是否具有相關(guān)指導(dǎo)意義。

外泌體miRNA 是內(nèi)源基因編碼的、長度約為18～22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA［14］，是調(diào)控特定基因翻譯的調(diào)控性RNA，其變化通常早于蛋白質(zhì)的變化，而蛋白質(zhì)的變化又早于病理損害的發(fā)生，因此，外泌體miRNA 理論上可以在病理損害尚未發(fā)生時即發(fā)生變化，從而進(jìn)行極早期的預(yù)警。研究發(fā)現(xiàn)，在AMI 梗死邊緣和梗死區(qū)域的早期階段（6 h）存在多種miRNA 的異常表達(dá)，因此，miRNA可能作為潛在的心肌梗死診斷標(biāo)志物［15-17］。本研究應(yīng)用RPM 定量篩選出兩個miRNA，即miRNA-3681-5p 和miRNA-152-5p，相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)miRNA-3681-5p 和miRNA-152-5p 與3D-GLS、3D-GAS 及3D-GCS 呈負(fù)相關(guān)，與3D-GRS 呈正相關(guān)；使用qRT-PCR 對miRNA-3681-5p 和miRNA-152-5p 進(jìn)行驗證顯示，單個miRNA-3681-5p 即可高效完全區(qū)分高危組、低危組和正常組，miRNA-152-5p 可高效區(qū)分高危組和低危組。因此，miRNA-3681-5p 和miRNA-152-5p 很可能是高效區(qū)分高危組、低危組和正常組的miRNA 標(biāo)志物。這些在國內(nèi)目前尚未見到相關(guān)的研究報道。

綜上所述，本研究應(yīng)用RT3D-STE 和miRNA評估AMI 的結(jié)果，可能對AMI 早期危險分層有一定指導(dǎo)作用，但還需進(jìn)一步前瞻性實驗證實應(yīng)用。高?；颊弋惓５某晠?shù)（SpI、CO、LVEF、3D-GLS 和3D-GAS）有望成為AMI 患者PCI 治療后隨訪MACE 或者生存率相關(guān)的評估指標(biāo)。

利益沖突聲明：在此次研究過程中或得到的研究結(jié)果均未受到任何機(jī)構(gòu)或生產(chǎn)商的影響。