劉師文，熊英，李健雄，張艷妮，徐剛，肖芳，劉曉慶，龔甜

（江西省疾病預(yù)防控制中心疾病檢測所，江西 南昌 330029）

人腺病毒55型（Human adenovirus type 55，HAdV-55）是2006年中國首次在呼吸道感染疫情中分離鑒定的一個(gè)新基因型人腺病毒[1]。該病毒是由腺病毒B組HAdV-14和HAdV-11重組進(jìn)化而來，其基因骨架來自引起呼吸道感染的HAdV-14，部分六鄰體（Hexon）基因來自引起泌尿道感染的HAdV-11[2]。HAdV-55感染主要導(dǎo)致急性呼吸道感染以發(fā)熱、咳嗽、咽痛和咳痰為主要臨床表現(xiàn)，易并發(fā)肺炎[3]。與親本HAdV-14及呼吸道腺病毒HAdV-3、HAdV-7相比，HAdV-55的傳播能力更強(qiáng)，發(fā)熱和肺炎的比例更高，暴發(fā)流行的規(guī)模更大[3,4]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示HAdV-55暴發(fā)以成人為主[5-7]，未見引起兒童暴發(fā)疫情的報(bào)道。

2020年8月江西某地出現(xiàn)一起兒童發(fā)熱暴發(fā)疫情，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)史，采集了3例患兒咽拭標(biāo)本，采用TaqMan微流體芯片、病毒分離及全基因組測序技術(shù)對這起疫情的病原體進(jìn)行鑒定，報(bào)告如下。

1.1 標(biāo)本采集2020年8月21-8月24日江西省宜某縣29名兒童先后出現(xiàn)發(fā)熱，不同程度咽痛癥狀，所有兒童均于8月9日-8月23日在同一游泳館學(xué)游泳。采集3例具有發(fā)熱（38.5℃～40℃）、咽痛癥狀的患兒（7～9歲）咽拭子標(biāo)本，冷藏運(yùn)輸條件下運(yùn)送至本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2 核酸提取 采用Qiagen公司的QIAamp MinElute Virus Spin Kit試劑提取咽拭子樣本和病毒分離物的核酸，具體操作參照試劑說明書。

1.3 病原種類確定 采用TaqMan Gene Expression Custom Array Card（Cat No：4342253，美國Applied Biosystems公司）微流體芯片技術(shù)對樣本進(jìn)核酸檢測，病原包括腺病毒、流感病毒、冠狀病毒、肺炎衣原體、肺炎鏈球菌等42種呼吸道病原體。根據(jù)TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix（Cat No：4444 432,美國Applied Biosystems公司）說明書要求配置預(yù)混液。每個(gè)樣本取30μl的核酸模板加入到70μl的預(yù)混液中，混均，加入到檢測板，離心后上機(jī)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。采用ABI ViiA 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件：50℃20 min；95℃2 min；95℃3s，60℃30s（收集熒光信號(hào)），45個(gè)循環(huán)。

1.4 人腺病毒Hexon基因片段擴(kuò)增和序列測定采用巢式PCR對腺病毒陽性標(biāo)本核酸Hexon基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列及擴(kuò)增方法參照文獻(xiàn)[8],目的片段大小688bp-821bp(不同型別腺病毒目的片段大小有差異)。

擴(kuò)增出Hexon基因產(chǎn)物瓊脂糖電泳后切膠回收，回收產(chǎn)物采用美國ABI SeqStudio Genetic Analyzer一代測序儀進(jìn)行基因序列測定。測序結(jié)果經(jīng)Blast同源比對，確定與之同源性最高的基因序列。從Genbank下載腺病毒基因參考序列,采用MEGA7.0軟件以最大似然法（Maximum Likelihood method,ML）構(gòu)建Hexon基因片段序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定腺病毒的基因型別。

1.5 病毒分離 采用Hep-2細(xì)胞對腺病毒陽性咽拭子標(biāo)本進(jìn)行病毒分離，方法參照文獻(xiàn)[9]。

1.6 腺病毒分離株基因組序列測定 采用78對引物分段擴(kuò)增腺病毒分離株的全基因組序列,引物序列和擴(kuò)增方法參照文獻(xiàn)[10]，擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程有限責(zé)任公司進(jìn)行序列測定，運(yùn)用CLC Genomics Workbench生物學(xué)軟件對序列進(jìn)行拼接，采用MEGA7.0軟件以最大似然法構(gòu)建腺病毒基因全序系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病原種類確定 共采集3名患兒咽拭子標(biāo)本3份（樣本編號(hào)：2020YQ522-524）。對3份樣本進(jìn)行42種病原的檢測，其中有兩種檢測腺病毒引物，結(jié)果顯示3份樣本均為腺病毒陽性，見圖1，流感病毒等其他41種病原均為陰性。

圖1 微流體芯片檢測擴(kuò)增圖

2.2 腺病毒Hexon基因擴(kuò)增和測序 對3份人腺病毒核酸陽性標(biāo)本Hexon基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳圖，見圖2，三個(gè)樣本均出現(xiàn)了目的條帶。

圖2 Hexon基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

3個(gè)PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后一代測序均獲得長708bp的基因序列。測序結(jié)果經(jīng)Blast同源比對,確定該3個(gè)序列與HAdV-55型同源性最高，其次為腺病毒B組HAdV-11。通過與HAdV-7、HAdV-3、HAdV-11、HAdV-14型 以及7株HAdV-55型參考株基因序列進(jìn)行比對,并構(gòu)建基因親緣性關(guān)系樹，見圖3發(fā)現(xiàn),2020YQ522、2020YQ523、2020YQ5 24均分布在B組HAdV-55一個(gè)分支上，和其他參考腺病毒型別相比，與HAdV-11親緣關(guān)系最近。同源性分析發(fā)現(xiàn)2020YQ522、2020YQ523、2020YQ 524之間核苷酸序列同源性100%，與HAdV-55原型株（DS-DLL）的Hexon基因核苷酸序列同源性為100%。

圖3 人腺病毒Hexon部分基因親緣性關(guān)系樹(409-1086bP)

2.3 腺病毒病毒分離 采用Hep-2細(xì)胞對咽拭子樣本進(jìn)行分離，其中2020YQ523、2020YQ524在接種后第二天開始出現(xiàn)細(xì)胞變圓,聚集如葡萄串狀等典型腺病毒CPE病變特征,接種后第3d和第5d完全病變,最終成功分離到兩株腺病毒（2020YQ 523、2020YQ524），2020YQ522未分離成功。

2.4 腺病毒分離株基因組序列與分析 選取病毒分離株2020YQ523核酸進(jìn)行分段擴(kuò)增測序，經(jīng)序列拼接獲得長34 443bp的基因序列。應(yīng)用MEGA7.0軟件比對分析顯示獲得的腺病毒基因組序列與HAdV-55原型株QS-DLL同源性最高，為99.99%，僅存在4個(gè)核苷酸差異，分別為核苷酸第1 721位（A-T）、8 394位（A-T）、22 904位（G-A）、28 827位（G-T），其中第1 721、22 904位核苷酸變異分別導(dǎo)致氨基酸發(fā)生了I-L、P-L的變異，第8 394、28827位核苷酸變異未導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變異。

基于腺病毒全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖4，由圖可見2020YQ523分布在B組HAdV-55型分支，和其他參考腺病毒型別相比，該病毒與HAdV-14親緣關(guān)系最近。

圖4 基于腺病毒全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

腺病毒可通過不同基因型之前發(fā)生重組而產(chǎn)生新的基因型,HAdV-55就是由HAdV-14和HAdV-11在Hexon基因發(fā)生重組產(chǎn)生。張艷妮等[9]對江西省2010年至2014年2645份兒童呼吸道感染樣本腺病毒基因型別進(jìn)行研究未發(fā)現(xiàn)HAdV-55。本研究通過微流體芯片、病毒分離、基因組測序分析技術(shù)確定本次疫情病原體為HAdV-55。序列分析結(jié)果顯示，與參考的其他型別腺病毒相比，2020YQ523毒株Hexon基因片段序列與HAdV-11親緣關(guān)系最近，而全基因序列分析顯示與HAdV-14親緣關(guān)系最近，研究結(jié)果與朱小娟等一致[11]，進(jìn)一步證實(shí)該病毒是由HAdV-14和HAdV-11重組病毒而來，對HAdV-55病原鑒定時(shí)應(yīng)結(jié)合全基因序列分析的方法。這是江西省內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)由HAdV-55引起暴發(fā)疫情的報(bào)道，事件原因可能是因?yàn)橛斡攫^集中培訓(xùn)造成的人員交叉感染。

目前報(bào)道的HAdV-55的暴發(fā)疫情主要為成人[5-7]，尤其是在軍營中[6,12]，其次是青少年（中學(xué)）[1,13]，尚未見兒童暴發(fā)疫情的報(bào)道?？赡苁腔诂F(xiàn)有研究報(bào)道，有研究提到了HAdV-55暴發(fā)流行感染人群的特殊性[14]，然而本次疫情涉及至少29名兒童，采集到樣本的3名患兒分別為7、8、9歲，確定為一起兒童發(fā)熱暴發(fā)疫情。結(jié)合HAdV-55在人群散發(fā)感染中的報(bào)道，如Xu等[15]通過對急性呼吸道感染兒童進(jìn)行了5年的腺病毒監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)8例HAdV-55感染，患兒平均年齡0.73±0.78歲；本實(shí)驗(yàn)室曾在散發(fā)兒童急性眼結(jié)膜炎兒童中發(fā)現(xiàn)6例HAdV-55感染，患兒年齡4月～10歲[16]；Cao等[3]發(fā)現(xiàn)21例HAdV-55感染社區(qū)獲得性肺炎病例均大于10歲，我們認(rèn)為HAdV-55暴發(fā)流行感染不具有人群的特殊性，可能在各年齡人群暴發(fā)，而且可能不僅存在發(fā)熱呼吸道疾病暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，也存在急性結(jié)膜炎等暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

為了更好的應(yīng)對由HAdV-55引起的暴發(fā)或者流行，急需建立有效的腺病毒監(jiān)測體系，加強(qiáng)監(jiān)測，掌握該病毒進(jìn)化及流行情況，為其感染暴發(fā)的預(yù)測預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)。