榮翔，劉小方

（青島大學附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院肝膽胰脾外科，山東煙臺264000）

膽管癌是近年發(fā)病率、病死率增長較快的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，起病初期癥狀輕容易被忽視，多數(shù)患者在疾病進展至中晚期時才會出現(xiàn)黃疸、尿色深及大便顏色變淺等明顯的臨床癥狀，但此時往往已失去手術根治的機會，預后不佳。分子靶向治療特異性強、副作用少，是近來腫瘤治療研究的熱點，但目前膽管癌的分子靶向治療技術并不成熟，需要更深入地研究探尋膽管癌發(fā)生及進展的分子機制。

作為RNA 家族中的一員，microRNA（miRNA）只含有約22 個核苷酸，卻廣泛參與各項生命活動，其中的microRNA-133（miR-133）更是被證實在胃癌、肺腺癌中異常表達，并影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性程度[1-2]。筆者通過miRCancer 數(shù)據(jù)庫篩選發(fā)現(xiàn)，miR-133 可能與膽管癌的進展有關，使用miRBase 數(shù)據(jù)庫進一步篩選發(fā)現(xiàn)，肌動蛋白骨架蛋白（LIM and SH3 protein 1,LASP-1）或許是miR-133的下游靶蛋白，包含LIM 及SH3-1 2 個成員，其作用非常廣泛，包括和肌動蛋白絲結合來調節(jié)細胞的骨架結構、控制信號的轉導、影響細胞的運動[3]，以及促進腫瘤細胞的惡性進展等[4-5]。已有研究證實LASP-1 蛋白參與膽管癌細胞遷移及侵襲的調控[6]，但miR-133 是否在膽管癌細胞中異常表達并影響膽管癌細胞的惡性行為，以及miR-133 能否調控LASP-1 蛋白的表達鮮有報道。

本實驗通過抑制人膽管癌細胞QBC939 中miR-133 的表達，觀察膽管癌細胞LASP-1 蛋白的表達及膽管癌細胞遷移、侵襲行為的變化，分析miR-133 與LASP-1 蛋白的關系及miR-133 對膽管癌細胞遷移、侵襲的影響，驗證miR-133 能否調控膽管癌細胞的遷移及侵襲，并探尋其中可能存在的機制，為以miR-133 為靶點的抗膽管癌侵襲和轉移治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人膽管癌細胞QBC939（上海吉凱基因公司），胎牛血清、高糖DMEM 培養(yǎng)液（美國Corning 公司），M-MLV 試劑盒（美國Promega 公司），PCR 引物（武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司），LipofectamineTM2000轉染試劑盒（美國賽默飛世爾公司），基質膠Matrigel（美國BD 公司），Trizol 試劑盒（上海普飛生物科技有限公司），miR-133 抑制物、miRNA 模擬物（廣州銳博生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

轉移電泳槽（JY-ZY5，北京君意東方電泳設備有限公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRTPCR）儀（美國ABI 公司），半干轉印系統(tǒng)轉印槽1703940（美國伯樂公司），暗室紅燈、X 射線膠片（美國柯達公司），化學發(fā)光檢測系統(tǒng)（美國Pierce生物技術公司），TS-1 水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），PVDF 膜（美國密理博Millipore 公司），5600F 掃描儀（日本佳能公司），Transwell 實驗小室（美國Costar 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)將人膽管癌細胞QBC939 接種于DMEM 高糖培養(yǎng)基，于37℃、飽和濕度、二氧化碳體積分數(shù)5%條件下培養(yǎng)（后續(xù)的細胞培養(yǎng)均在該條件下）。收集對數(shù)生長期細胞繼續(xù)實驗。

1.3.2 qRT-PCR檢測miR-133a-5p、miR-133a-3p、miR-133b mRNA相對表達量使用Primer 5.0 設計引物（見表1）。提取RNA：將1 ml 的Trizol Reagent與100 mg 培養(yǎng)細胞混合研磨離心，取上清液、250 μl 三氯甲烷及80%的異丙醇混合，12 000 r/min 離心10 min，得到白色沉淀為目標RNA。75%乙醇洗滌，棄液體，溶解后用超微量分光光度計檢測吸光度值，調整濃度為200 ng/μl。逆轉錄得cDNA：加入miRNA 逆轉錄引物，加入4 μl 5×RT buffer，2 μl 10 mmol dNTPs，1 μl RNase inhibitor（40 u/μl）和1μl M-MLV-RTase（200 u/μl），冰浴。PCR 儀80℃滅活逆轉錄酶，得到cDNA。qRT-PCR 擴增：2×qPCR Mix，基因引物，cDNA 逆轉錄產物，ddH2O 組成反應體系，加入實時定量反應光學孔板（96 孔板），qRT-PCR 擴增，反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，循環(huán)40 次。檢測miR-133 3 種亞型（miR-133a-5p、miR-133a-3p、miR-133b）的表達，U6為內參基因。采用2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達量。樣本重復檢測3 次，選擇表達最高的亞型繼續(xù)實驗。

表1 引物序列

1.3.3 實驗分組及轉染DMEM 培養(yǎng)基中的細胞傳代培養(yǎng)，選擇細胞融合度達到80%的QBC939 細胞接種于24 孔細胞培養(yǎng)板，按LipofectamineTM2000 說明書操作，將QBC939 細胞轉染并分組。①干擾組：每孔加入100 nmol 的miR-133a-5p 抑制物（antimiR-133a-5p）；②陰性對照組：每孔加入50 nmol的miR-133a-5p 模擬物；③空白對照組：自然生長。于前文所述的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各處理因素的使用劑量均以轉染物說明書為依據(jù)。

1.3.4 qRT-PCR檢測3組細胞miR-133a-5p mRNA相對表達量收集3 組細胞，qRT-PCR 儀檢測3 組細胞miR-133a-5p mRNA 相對表達量，U6為內參基因。檢測結果采用2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達量，實驗重復3 次。

1.3.5 Transwell 細胞遷移實驗使用無血清的DMEM 培養(yǎng)基（內含F(xiàn)BS），加入被胰酶處理過的分組細胞，制成細胞重懸液。Transwell 小室的上室及下室內分別加入細胞重懸液200 μl 和DMEM 高糖培養(yǎng)液600 μl，每組設置3 個復孔。培養(yǎng)72 h，小室使用PBS 緩沖液清洗，95%酒精固定，0.1%結晶紫染色，沖水，晾干。20 倍光鏡下，統(tǒng)計5 個隨機視野內各組的細胞遷移數(shù)量。實驗重復3 次。

1.3.6 Transwell 細胞侵襲實驗接種前預處理小室：取混合稀釋膠（DMEM 培養(yǎng)基與Matrigel 膠按9∶1 的比例混合），加入4℃預冷后Transwell 小室底部膜的上室面。小室的上室及下室內分別加入細胞重懸液200 μl，DMEM 高糖培養(yǎng)液（含30%FBS）600 μl，每組設置3 個復孔。培養(yǎng)72 h，小室使用PBS 緩沖液清洗后去膠，95%酒精固定，0.1%結晶紫染色，沖水，晾干。20 倍光鏡下，統(tǒng)計5 個隨機視野內各組的細胞侵襲數(shù)量。實驗重復3 次。

1.3.7 Western blotting 檢測LIM 及SH3-1 蛋白的相對表達量細胞冰浴裂解30 min。LIM 及SH3-1 蛋白經SDS-PAGE 電泳移至PVDF 膜。麗春紅染色，PBS沖洗。一抗（1∶500）及HRP 酶標二抗（1∶1 000）在室溫下孵育1 h?；旌习l(fā)光底物5 min 后，將PVDF膜覆于保鮮膜下，暗箱中顯影曝光。Image J 軟件分析灰度值，GADPH 為內參。實驗重復3 次。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism6.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用Tukey 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-133 3種亞型mRNA相對表達量的比較

miR-133a-5p mRNA 相對表達量為（1.07±0.06），miR-133a-3p mRNA 相對表達量為（0.97±0.11），miR-133b mRNA 相對表達量為（0.73±0.07），經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.622，P=0.013）；miR-133a-5p mRNA 相對表達量最高，見圖1。選擇miR-133a-5p繼續(xù)實驗。

圖1 miR-133 3種亞型mRNA相對表達量比較

2.2 3組miR-133a-5p mRNA相對表達量的比較

3 組miR-133a-5p mRNA 相對表達量分別為：干擾組（0.70±0.08）、陰性對照組（1.43±0.34）、空白對照組（0.90±0.17），經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.459，P=0.018）；干擾組miR-133a-5p mRNA 相對表達量最低。見圖2。

圖2 3組miR-133a-5p mRNA相對表達量比較

2.3 不同處理因素對人膽管癌細胞QBC939 遷移、侵襲的影響

2.3.13 組細胞遷移數(shù)量的比較3 組細胞遷移數(shù)量分別為：干擾組（72.0±11.0）個，陰性對照組（110.3±4.2）個，空白對照組（106.0±10.4）個，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=16.040，P=0.004）；干擾組人膽管癌細胞QBC939 的遷移數(shù)量最少。見圖3。

圖3 3組Transwell遷移實驗結晶紫染色圖（×20）

2.3.2 3組細胞侵襲數(shù)量的比較3 組細胞侵襲數(shù)量分別為：干擾組（20.0±3.0）個，陰性對照組（65.0±2.6）個，空白對照組（83.7±3.5）個，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=340.200，P=0.000）；干擾組人膽管癌細胞QBC939 的侵襲數(shù)量最少。見圖4。

圖4 3組Transwell侵襲實驗結晶紫染色圖（×20）

2.4 不同處理因素對人膽管癌細胞QBC939 LIM 及SH3-1 蛋白表達的影響

2.4.13 組LIM 蛋白相對表達量的比較3 組LIM蛋白相對表達量分別為：干擾組（0.85±0.02），陰性對照組（0.30±0.06），空白對照組（0.28±0.05），經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=137.000，P=0.000）；干擾組人膽管癌細胞QBC939 LIM 蛋白相對表達量最多。見圖5、6。

圖5 3組膽管癌細胞中LIM、SH3-1蛋白的表達

圖6 3組LIM蛋白的相對表達量比較

2.4.23 組SH3-1 蛋白相對表達量的比較3 組SH3-1 蛋白相對表達量分別為：干擾組（0.71±0.01），陰性對照組（0.98±0.03），空白對照組（0.99±0.01），經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=263.200，P=0.000）；干擾組人膽管癌細胞QBC939 SH3-1 蛋白相對表達量最少。見圖5、7。

圖7 3組SH3-1蛋白的相對表達量比較

3 討論

伴隨著老年人口在社會總人口中的占比提升，癌癥的發(fā)病率也越來越高。膽管癌作為一種惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤，其早期診斷和有效治療方案一直是臨床工作中的難題。因此，需要更深入地了解膽管癌的發(fā)病機制，從根本上改變膽管癌患者的預后。

miRNA 能作用于mRNA，通過抑制翻譯和促進降解，降低DNA 轉錄后的表達水平[7]。這一作用存在于多種腫瘤細胞中，例如在非小細胞肺癌中，miR-7-5p 可以靶向調控下游p53基因，使其對應的mRNA 翻譯更加活躍，從而抑制非小細胞肺癌的增殖和侵襲[8]。一些miRNA 能反映癌癥的進展及患者的預后，如miR-363、miR-127-3p、miR-224 分別在肝癌、食管鱗癌及膽管癌細胞中表達失衡，且失衡的程度與疾病的進展呈正相關，對患者的生存評估具有一定的指導意義[9-11]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-133 在多種癌癥進展中發(fā)揮抑癌基因的作用，如miR-133 可直接靶向負調控YES1原癌基因的表達，抑制乳腺癌細胞的增殖和集落形成[12]。miR-133在胃癌、肺癌及結直腸癌中也表現(xiàn)出同樣的能力，其表達水平與癌癥進展呈負相關[13-15]。而筆者使用miRCancer 信息庫篩選后，發(fā)現(xiàn)miR-133 與膽管癌的進展也可能存在關聯(lián)，因此選擇miR-133 作為本實驗的研究對象。首先通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，miR-133 的3 種亞型在人膽管癌細胞QBC939 中的表達的確存在差異，miR-133a-5p 的表達最高，故選擇miR-133a-5p 進行后續(xù)的干擾實驗。通過細胞轉染分組培養(yǎng)，qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)干擾組人膽管癌細胞QBC939 的miR-133a-5p 表達明顯下降，說明轉染miR-133a-5p 抑制劑有效減少人膽管癌細胞QBC939 miR-133a-5p 的表達。在Transwell 實驗中，筆者觀察到干擾組膽管癌細胞的遷移、侵襲數(shù)量均低于空白對照組及陰性對照組，提示miR-133a-5p的低表達可使人膽管癌細胞的遷移、侵襲能力降低，推斷miR-133a-5p 在膽管癌細胞中很有可能發(fā)揮類似癌基因的作用，使膽管癌的惡性程度加重。

通過miRBase 信息庫的篩選，筆者發(fā)現(xiàn)LASP-1可能是miR-133a-5p 的下游靶蛋白，miR-133a-5p很有可能調控LASP-1 蛋白的表達。LASP-1基因位于人7 號染色體長臂17 區(qū)到21 區(qū)[16]，其表達產物LASP-1 蛋白有LIM 及SH3-1 2 個家族成員，在維持細胞形態(tài)及調節(jié)細胞運動過程中發(fā)揮著重要的作用。LASP-1 蛋白可以通過誘導細胞分裂周期的停滯，影響細胞的增殖、分化能力[17]。LASP-1 蛋白的過表達能顯著強化腫瘤細胞的攻擊性，如在結直腸癌細胞中，LASP-1 蛋白可通過上調基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達，在延緩腫瘤細胞凋亡的同時加速腫瘤細胞的增殖與轉移[18]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，干擾組人膽管癌細胞的LASP-1 蛋白表達發(fā)生變化：與陰性對照組和空白對照組比較，干擾組人膽管癌細胞的SH3-1 蛋白相對表達量降低，LIM蛋白相對表達量增加，提示miR-133a-5p 可調控LASP-1 蛋白的表達，敲減miR-133a-5p 能使人膽管癌細胞的SH3-1 蛋白表達下調、LIM 蛋白表達上調。ZHANG 等[6]證實LASP-1 蛋白具有調控膽管癌細胞增殖、遷移及侵襲的能力，其機制與破壞Bcl-2蛋白家族平衡[19]及加速上皮-間質轉化（EMT）[20]有關。而LASP-1 蛋白家族中的SH3-1 蛋白有加速細胞運動及侵襲的能力[21]，當SH3-1 蛋白表達減少時，細胞的運動及侵襲將會受到抑制，這與本研究結果中干擾組人膽管癌細胞的低SH3-1 表達及遷移、侵襲減弱一致。因此，筆者推測miR-133a-5p對人膽管癌細胞遷移、侵襲的影響可能是通過miR-133a-5p 對LASP-1 蛋白表達的調控實現(xiàn)的。但目前尚不明確這一過程的具體信號通路，需要未來實驗更深入的研究。

綜上所述，miR-133a-5p 可調控人膽管癌細胞QBC939 LASP-1 蛋白的表達，敲減miR-133a-5p 能使膽管癌細胞的SH3-1 蛋白表達下調、LIM 蛋白表達上調；miR-133a-5p 的低表達能抑制人膽管癌細胞QBC939 的遷移和侵襲，這可能與miR-133a-5p調控LASP-1 蛋白的表達有關。miR-133a-5p 可能通過調控LASP-1 蛋白的表達進而影響人膽管癌細胞的惡性行為，這為以miR-133a-5p 為新型分子靶點的抗膽管癌遷移、侵襲治療提供了廣闊的前景，也為膽管癌的早期診斷提供了新的思路。