丁 超，許 寅，葛韻芝

上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

作為一種常見的精神疾病，抑郁癥能夠影響患者的認知、情感及機體功能［1-2］。抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與多種風險因素有關，包括社會因素、心理壓力、慢性疾病與遺傳因數(shù)等［3］?；颊叱烁械奖瘋⒔箲]、空虛和絕望外，還常表現(xiàn)出興趣缺失、食欲不振及自殺傾向［1］。目前，全球約有4億人受到抑郁癥困擾［4-5］。

近年來，抑郁癥的病理機制逐漸明晰，包括下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitaryadrenal，HPA）軸改變、炎癥反應系統(tǒng)激活、代謝異常、內(nèi)分泌失調(diào)及神經(jīng)系統(tǒng)病變等［6-8］。而抗抑郁藥物也快速發(fā)展，臨床常用的三環(huán)類抗抑郁藥物、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）再攝取抑制劑和單胺氧化酶抑制劑等能夠一定程度上改善抑郁癥患者的認知與情感等功能［9］。但是，抑郁癥的高度異質(zhì)性［10-11］、易耐藥性［9］、藥物的嚴重不良反應及昂貴售價限制了現(xiàn)有抗抑郁藥物的臨床應用。因此，抗抑郁藥物的開發(fā)引起了研究人員的關注。而價格低廉、不良反應較小的中藥成為了抗抑郁藥物開發(fā)的重點［12-13］。

作為一種在亞洲國家被廣泛使用的天然藥物［14］，當歸（Angelica archangelicaL）能夠補血和血、調(diào)經(jīng)止痛，它參與了多種抗抑郁中藥復方的組成，包括逍遙散［15］、當歸補血湯［16］和當歸芍藥散［17］等?，F(xiàn)代藥理學研究報道［18］，當歸能夠顯著減少抑郁模型小鼠懸尾與強迫游泳不動時間，降低抑郁模型小鼠下丘腦中精氨酸加壓素的表達［19］；對抗慢性束縛應激引起的嗜睡癥狀［20］，增加抑郁模型大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達［21］。但是，當歸改善抑郁癥的活性成分和作用機制尚不明確。

當歸多糖（angelica polysaccharides，AP）是從當歸中分離得到的主要活性成分之一［22］。研究表明，當歸多糖具有廣泛的藥理活性，包括了免疫調(diào)節(jié)［23］、抗腫瘤［24］、抗肝臟損傷［25］、抗炎［26］、抗貧血［27］、抗脊髓損傷［28］等作用。然而，目前對于當歸多糖干預抑郁癥的研究仍然未見報道。在本研究中，筆者使用行為學評價、神經(jīng)遞質(zhì)檢測及mRNA測定的方法探討了當歸多糖對慢性應激誘導的抑郁模型小鼠的影響及作用機制，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57BL/6小鼠，SPF級，雄性，6周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物使用許可證號：［SYXK（滬）2014-0029］，飼養(yǎng)于復旦大學實驗動物科學部，飼養(yǎng)條件：溫度（22±1）℃，濕度（60±5）%，12 h明暗交替。

1.2 試藥與試劑當歸多糖（美國泛華醫(yī)藥公司，批號：A22000）；氟西?。绹Y來公司，批號：J20130010）；烏來糖（國藥集團化學試劑有限公司，批號：30191228）；蛋白測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：B69320）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、甲酸、乙腈及甲醇［賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號分別：11146024、166963、172443、138489］；qPCR 反應試劑盒［東洋紡（上海）生物科技有限公司，批號：SCQ-501］；RNA 提取試劑盒［賽默飛世爾科技（中國）有限公司及東洋紡（上海）生物科技有限公司，批號分別為AM1931、NPK-801］；qPCR引物（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司）。

1.3 模型制備采用曠場實驗篩選出60 只合格健康C57BL/6小鼠，適應性喂養(yǎng)7天后隨機分為正常對照組（Control）、模型對照組（Model）、當歸多糖低劑量組（20 mg/kg AP）、當歸多糖高劑量組（40 mg/kg AP）及氟西汀組（10 mg/kg Fluoxctinc），每組12 只。正常對照組小鼠正常飼養(yǎng)；其他組小鼠制備慢性應激抑郁模型，在標準小鼠框單籠飼養(yǎng)，并不定時給予以下7 種刺激：禁食24 h、禁水12 h、連續(xù)日照36 h、電擊5 min（0.7 A）、無墊料飼養(yǎng)24 h、傾斜45°飼養(yǎng)、24 h 和夾尾刺激1 min。每種刺激重復出現(xiàn)（非連續(xù)），共5 周。造模的同時灌胃給藥，其中正常對照組和模型對照組給予等體積的水，藥物組給予對應藥物灌胃。每周記錄小鼠體質(zhì)量。

1.4 觀察指標

1.4.1 行為學檢測 5 周結(jié)束時，進行強迫游泳測試（forced swimming test，F(xiàn)ST），將小鼠置于含20 cm 深清水容器中，記錄小鼠在6 min 內(nèi)累積不動時間；懸尾測試（tail suspension test，TST），將小鼠尾部固定在一根水平木棍上，使其倒掛，記錄小鼠在6 min 內(nèi)累積不動時間；高架十字迷宮實驗（elevated plus maze test，EPMT），使用30%的酒精清潔高架十字迷宮后，將小鼠放入中央位置并使頭部面向開臂，記錄6 min內(nèi)小鼠進入開臂的時間；記錄小鼠1 h 飲用1%蔗糖溶液百分比（糖水消耗量/用水量×100%）作為評價指標計算糖水偏好率（sugar perference）。

1.4.2 海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)檢測 5 周結(jié)束時，麻醉條件下將小鼠安樂死，取海馬組織加入500 μL的甲酸-甲醇（1∶1000）勻漿，以離心半徑15 cm，2 3000 r/min離心15 min。取上清液，使用LC-MS/MS色譜法進行海馬組織多巴胺（dopamine，DA）、5-HT、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和谷氨酸（glutamate，GLU）含量檢測。

液相條件如下：A 相為甲酸-水（1∶1000），B 相為乙腈，進行梯度洗脫。洗脫條件為0～2 min，0.02B；2.01 min，0.8B；7 min，0.9B；11 min，0.02B；流速為0.2 mL/min。

1.4.3 海馬組織TPH1、SNAP25 mRNA 檢測 取小鼠海馬組織進行色氨酸羥化酶1（tryptophan Hydroxylase 1，TPH1）和突觸體相關蛋白25（synaptosome associated Protein 25，SNAP25）mRNA表達的檢測，所有實驗方案嚴格按照qPCR試劑盒說明書操作，反應體系為20 μL。TPH1、SNAP25和ACTB引物序列見表1。

表1 引物序列

海馬組織總RNA提取方法如下：將海馬組織加入1 mL Trizol 試劑，勻漿后以離心半徑15 cm，12 000 r/min條件下離心15 min取上清液；加入200 μL氯仿，振蕩15 s 后靜置5 min，在離心半徑15 cm，12 000 r/min 離心15 min 取上清液；加入500 μL異丙醇，搖勻后在離心半徑15 cm，12 000 r/min離心10 min，取上清液；加入1 mL75%乙醇，吹打后離心半徑15 cm，7000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入60 μL RNase-free水溶解沉淀，搖勻。

1.5 統(tǒng)計學方法使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料使用表示，使用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學表現(xiàn)與正常對照組比較，其余各族可顯著增加小鼠在強迫游泳測試與懸尾測試中的累積不動時間（P＜0.01），減少小鼠在高架十字迷宮實驗中的進入開臂時間及糖水偏好率（P＜0.01），對小鼠體質(zhì)量的影響未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與模型對照組比較，當歸多糖高劑量組和氟西汀組顯著降低小鼠在強迫游泳測試中的累積不動時間（P＜0.05），增加小鼠在高架十字迷宮實驗中的進入開臂時間及糖水偏好率（P＜0.05）；當歸多糖各組及氟西汀組可顯著降低小鼠在懸尾測試中的累積不動時間（P＜0.05），對小鼠體質(zhì)量的影響未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠行為學表現(xiàn)

2.2 海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量與正常對照組比較，其余各組顯著減少小鼠海馬組織中DA、5-HT含量及GABA/GLU比率（P＜0.01），對GABA和GLU含量的影響未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與模型對照組比較，當歸多糖高劑量組和氟西汀組可顯著增加小鼠海馬組織中DA 和5-HT 含量（P＜0.05）；當歸多糖高劑量組顯著增加小鼠海馬組織中GABA/GLU 比率（P＜0.05），對GABA 和GLU 含量的影響未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量

2.3 海馬組織中TPH1 和SNAP25 mRNA 表達與正常對照組比較，其余各組可顯著減少小鼠海馬組織中的TPH1、SNAP25 mRNA 表達（P＜0.05）。與模型對照組比較，當歸多糖高劑量組可顯著增加小鼠海馬組織中的TPH1 mRNA 表達（P＜0.05），對SNAP25 mRNA表達的影響未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠海馬組織中TPH1和SNAP25 mRNA表達

3 討論

在我國，抑郁癥已經(jīng)成為造成青少年非正常死亡的首要原因［29］。近年來，抑郁癥和身體健康之間的生物學關聯(lián)越發(fā)得到重視［1］。由于細胞模型無法滿足對情緒及認知評估的要求，動物模型仍舊是抑郁癥實驗研究的首選［30］。目前，常用的抑郁癥動物模型包括藥物誘導、慢性應激誘導與腦損傷誘導等［30-31］。而作為人類抑郁癥的誘因之一，動物在經(jīng)歷慢性應激后容易產(chǎn)生與人類相似的食欲減少、淡漠及絕望情緒等抑郁癥狀［32］。因此，慢性應激誘導的抑郁模型是目前抗抑郁藥物評價時的常用模型［32-33］。在本研究中，我們采用慢性應激誘導的抑郁小鼠模型探討當歸中的主要活性成分當歸多糖對抑郁癥的影響。

在臨床上，抑郁量表與行為評分是評估抑郁癥程度的重要指標［34］。在動物模型上，由于可以較好地反映動物認知情況，行為學評估在抑郁癥藥物篩選中也是至關重要的［35-36］。常規(guī)的抑郁相關動物行為學評估包括糖水偏好率、FST、TST、EMPT 及曠場實驗（open field test，OFT）等［37-38］。這些測試能夠評估動物的認知與絕望情緒，進而反應動物的抑郁行為程度。在本研究中，模型組小鼠糖水偏好率、FST、TST、EMPT 顯著變化，說明慢性應激誘導了小鼠抑郁行為；高劑量當歸多糖可對小鼠糖水偏好率、FST、TST、EMPT 進行調(diào)節(jié)。該結(jié)果提示當歸中的主要活性成分當歸多糖能夠通過改善抑郁行為對抑郁癥產(chǎn)生影響。

抑郁行為的發(fā)展常與大腦中的神經(jīng)遞質(zhì)變化有關［39］。作為學習與記憶的關鍵部位，海馬組織也與抑郁癥的發(fā)生關系密切［40］。當抑郁發(fā)生時，海馬組織內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)傳導功能通常顯著受損［41-42］。在抑郁癥實驗模型中，海馬組織中的神經(jīng)遞質(zhì)檢測是常用的抑郁評估指標［43］。這些神經(jīng)遞質(zhì)包括DA、5-HT、GABA、GLU 和5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）等［44-46］。其中，DA 的缺失能夠引起悲傷和自我否定［47］；5-HT分泌減少能夠誘發(fā)人類抑郁與自殺行為［34］；GABA能夠直接影響人類認知與焦慮情緒［47］；海馬組織內(nèi)GLU 水平異常升高能夠引發(fā)興奮性神經(jīng)毒性，進而促進抑郁的產(chǎn)生［48］；GABA/GLU 比值變化與腦內(nèi)興奮抑制功能紊亂相關［48］。在本研究中，模型組小鼠海馬組織中DA、5-HT含量及GABA/GLU比率的下降，說明慢性應激誘導了小鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)傳導功能減退與興奮抑制功能紊亂；高劑量當歸多糖對小鼠海馬組織中DA、5-HT 含量及GABA/GLU比率的調(diào)節(jié)指示：當歸多糖能夠改善慢性應激誘發(fā)的小鼠大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)傳導功能減退與興奮抑制功能紊亂。該結(jié)果提示當歸中的主要活性成分當歸多糖改善抑郁癥的效果可能與其能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)傳導及糾正興奮抑制功能紊亂有關。

在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中，相關的神經(jīng)遞質(zhì)紊亂常與其上下游效應分子變化有關［5，36］。5-HT 是抑郁過程中的重要靶點，其在中樞系統(tǒng)的表達與抑郁行為密切相關［6］。TPH1 是5-HT 合成過程中的重要限速酶，與5-HT 含量直接相關，因此檢測海馬組織中TPH1 的表達可以衡量5-HT 傳導功能的情況［49］。SNAP25 直接影響著DA、5-HT、GLU 及GABA 等神經(jīng)遞質(zhì)合成后的遞質(zhì)釋放，與神經(jīng)遞質(zhì)傳遞能力密切相關。因此，檢測TPH1 和SNAP25 mRNA 表達可以評估腦內(nèi)5-HT 合成與神經(jīng)遞質(zhì)傳遞情況［50］。在本研究中，模型組小鼠海馬組織中TPH1 和SNAP25 mRNA 表達顯著下降，說明慢性應激誘導了小鼠腦內(nèi)5-HT 合成障礙和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞功能減退；高劑量當歸多糖組小鼠海馬組織中TPH1 mRNA 表達升高，SNAP25 mRNA 表達未見明顯變化，說明當歸多糖能夠改善慢性應激誘發(fā)的小鼠腦內(nèi)5-HT 合成障礙。綜合該結(jié)果與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量變化結(jié)果，提示當歸中的主要活性成分當歸多糖改善抑郁癥的效果可能與TPH1 mRNA 表達升高引起5-HT 合成增加有關，與SNAP25 mRNA表達變化引發(fā)的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞功能變化無關。

在本研究中，我們通過行為學評價、神經(jīng)遞質(zhì)檢測及mRNA 測定的方法探討了當歸多糖對慢性應激誘導的抑郁模型小鼠的影響及作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當歸多糖能夠改善慢性應激模型小鼠抑郁行為；其作用機制與上調(diào)TPH1 mRNA 表達引起5-HT 合成增加、提高DA 含量及升高GABA/GLU 比率進而調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)傳導及糾正興奮抑制功能紊亂有關，與調(diào)節(jié)SNAP25 mRNA 表達變化無關。該研究結(jié)果能夠為當歸多糖改善抑郁癥的藥物開發(fā)和作用機制研究提供物質(zhì)基礎。然而當歸多糖改善抑郁癥的作用機制仍未完全明晰。在未來的研究中，我們將進一步探討當歸多糖對腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)上下游效應分子的影響。