王繼鳳,劉曉冉,隋 欣,闞 默,李 輝,郭文軍,楊 擎,張 壯,明思彤,李 娜,曲曉波

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)分子藥理實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春130117；2.吉林省前衛(wèi)醫(yī)院普外科，吉林 長春130012）

中草藥對多種疾病表現(xiàn)出獨(dú)特的治療作用。獨(dú)參湯（Dushen Tang，DST）始記載于《十藥神書》，由單味人參煎煮而成［1］，并已在《世界藥典》上出版，其中所述的提取方法是水煎煮［2-3］，其應(yīng)用歷史悠久，已被廣泛使用，特別是其可用于增強(qiáng)記憶能力［4］?，F(xiàn)代藥理研究［5］證實(shí)：人參具有多種藥理作用，包括增強(qiáng)記憶力、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激和抗衰老。人參可通過增強(qiáng)海馬溶血磷脂酸受體蛋白1受體的表達(dá)和改善神經(jīng)元存活進(jìn)而改善D-半乳糖（D-galactose，D-gal）誘導(dǎo)的大鼠記憶缺陷［4］。研究［6-8］表明：DST主要有效成分為人參皂苷等，對阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）和衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病均有良好的療效。環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵的作用，能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活、再生和分化等，然而DST對該信號通路的作用尚未見報(bào)道。本研究基于cAMP/PKA/CREB信號通路探討DST對D-gal誘導(dǎo)衰老模型大鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用，為進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑和儀器SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±10）g，購于長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）-2018-0007。大鼠飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學(xué)動物飼養(yǎng)中心，溫度20℃～22℃，相對濕度50%±10%。人參購自吉林省芝恩堂參茸特產(chǎn)有限公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室鑒定，為15年以上五加科植物人參（Panax ginseng）。D-gal（上海源葉生物科技有限公司，批號H17M 7C14868），丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒和谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（南京建成科技有限公司，批號分別為20200629、20200630和20200630），超敏ECL發(fā)光檢測試劑盒（中國Proteintech公司，批號071119200916）。Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），透射電子顯微鏡（美國Tecnai公司），凝膠成像儀（美國Aplegen公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組和給藥40只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、陽性藥組和DST組，每組10只。除對照組外，其余各組大鼠按照500 mg·kg－1·d－1劑量腹腔注射D-gal 40 d建立衰老模型［9-10］。在注射D-gal第5天，陽性藥組大鼠給予維生素E 0.027 g·kg－1·d－1［11］，DST組 大 鼠 給 予 獨(dú) 參 湯5 mL（按照傳統(tǒng)工藝提取，相當(dāng)于生藥量0.3 g·kg－1·d－1，該劑量根據(jù)藥典規(guī)定人參的最低服用劑量3 g·d－1折算所得）至造模結(jié)束，對照組大鼠給予等容量生理鹽水。

1.3 觀察大鼠一般狀況并記錄體質(zhì)量實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠的毛發(fā)、精神和活動情況，每7 d用電子秤測定一次體質(zhì)量，并繪制生長曲線。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

①定位航行實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)將平臺擺放在其中一個(gè)象限的中間位置，水面高于平臺以上，并且將水迷宮中加入足夠的二氧化鈦，充分?jǐn)嚢杌靹?，便于儀器捕捉大鼠的位置。隨機(jī)將大鼠放入水池。計(jì)時(shí)開始后，儀器根據(jù)大鼠軌跡自動記錄運(yùn)動總距離、游泳軌跡和到達(dá)平臺時(shí)間（即逃避潛伏期），若大鼠2 min沒有找到平臺則大鼠的潛伏期定為120 s。

1.5 生化試劑盒檢測大鼠腦組織中SOD、GSH活性和MDA水平大鼠按“1.2”中的方法進(jìn)行分組給藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠戊巴比妥鈉麻醉取全腦，將生理鹽水預(yù)冷置于培養(yǎng)皿中，快速沖洗全腦，用濾紙吸干腦組織表面殘存液體，精密稱質(zhì)量，按試劑盒測定說明書檢測大鼠腦組織中SOD、GSH活性和MDA水平。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測大鼠腦組織中cAMP水平取各組大鼠腦組織，精密稱質(zhì)量，按試劑盒說明書中1∶9的比例進(jìn)行腦組織勻漿，2 500 r·min－1離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒測定說明書檢測大鼠腦組織中cAMP水平。

1.7 透射電鏡觀察大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)各組大鼠戊巴比妥鈉麻醉后，取大鼠海馬組織，于4%多聚甲醛中固定。進(jìn)行切片處理，在透射電鏡下觀察大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)。

1.8 剛果紅染色觀察大鼠海馬組織老年斑形成情況將各組大鼠腦組織置于4%多聚甲醛進(jìn)行固定，制備石蠟切片，進(jìn)行剛果紅染色，采用Image Scop軟件對剛果紅染色圖片進(jìn)行觀察，并通過Image J軟件測定老年斑面積。

1.9 Western blotting法檢測大鼠腦組織中cAMP/PKA/CREB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平取各組大鼠腦組織，精密稱質(zhì)量后進(jìn)行破碎，采用組織裂解液試劑盒提取總蛋白，并用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，采用SDS-PAGE垂直電泳分離50 min，轉(zhuǎn)膜70 min，脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃過夜，二抗孵育1 h，采用ECL法進(jìn)行顯色，拍照。凝膠成像系統(tǒng)分析各樣本灰度值，進(jìn)行定量分析。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)，大鼠腦組織中SOD、GSH活性及MDA和cAMP水平，大鼠腦組織中cAMP/PKA/CREB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和行為活動D-gal注射28 d后，與對照組比較，模型組大鼠毛色逐漸發(fā)黃，枯槁無光澤，掉毛明顯，皮膚彈性差，伴精神萎靡、倦怠、行動和反應(yīng)遲緩，出現(xiàn)明顯衰老體征。根據(jù)大鼠每7 d體質(zhì)量分析，與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量有下降趨勢；與模型組比較，陽性藥組和DST組大鼠體質(zhì)量更接近于對照組，且陽性藥組和DST組大鼠相對活潑好動、毛發(fā)光亮、皮膚彈性較好。見圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量Fig.1Body weights of rats in various groups

2.2 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)與對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），總運(yùn)動距離明顯增加（P＜0.05），穿越平臺有效區(qū)域次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥組和DST組大鼠逃避潛伏期和運(yùn)動總距離明顯縮短（P＜0.05），穿越平臺有效區(qū)域次數(shù)明顯增加（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測圖（A-D）和直條圖（E-G）Fig.2Detection chart(A-D)and histogram(E-G)of water maze experiment of rats in various groups

2.3 各組大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)對照組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，輪廓分明，核仁清晰，核膜平滑，線粒體大小正常，染色質(zhì)均勻分布，細(xì)胞器豐富；模型組大鼠海馬神經(jīng)元水腫，排列不規(guī)則，核膜破裂，輪廓不清，線粒體腫脹，細(xì)胞器擴(kuò)大；與模型組比較，陽性藥組和DST組大鼠海馬神經(jīng)元上述病理改變明顯改善。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)Fig.3Morphological manifestations of ultrastructures of hippocampal neurons of rats in various groups

2.4 各組大鼠腦組織海馬區(qū)老年斑形成情況對照組大鼠海馬區(qū)剛果紅染色呈陰性，具有豐富清晰的尼氏小體。模型組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞密度降低，散在分布少量的橘紅色沉積物，具有嗜紅色和磚紅色淀粉樣物質(zhì)沉積，形成老年斑。陽性藥組和DST組大鼠海馬區(qū)仍有少量橘紅色沉積物包繞藍(lán)色細(xì)胞帶，細(xì)胞體積小，排列稀疏。見圖4。

圖4 各組大鼠腦組織海馬區(qū)老年斑形態(tài)表現(xiàn)(剛果紅)Fig.4Morphological manifestations of age spots in hippocampus of rats in various groups(Congo red)

采用Image J軟件進(jìn)行對各組大鼠海馬區(qū)老年斑進(jìn)行定量檢測，與對照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)老年斑面積明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和DST組大鼠海馬區(qū)老年斑面積明顯減少（P＜0.01），與圖片觀察結(jié)果一致。見表1。

表1 各組大鼠海馬區(qū)老年斑面積Tab.1Areas of age spots in hippocampus of rats in various groups (n=8，±，A/μm2）

表1 各組大鼠海馬區(qū)老年斑面積Tab.1Areas of age spots in hippocampus of rats in various groups (n=8，±，A/μm2）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model Positive drug DST Area of age spots 0.00±0.00 1 885.00±100.13*380.00±27.22△546.33±16.62△

2.5 各組大鼠腦組織中SOD和GSH活性及MDA和cAMP水平與對照組比較，模型組大鼠腦組織中SOD和GSH活性及cAMP水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），MDA水 平 明 顯 升 高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和DST組大鼠腦組織中SOD和GSH活性及cAMP水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA水平明顯降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠腦組織中SOD和GSH活性及MDA和cAMP水平Fig.5Activities of SOD and GSH and levels of MDA and cAMP in brain tissue of rats in various groups

2.6 各組大鼠海馬組織中cAMP/PKA/CREB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白α抑制劑（guanine nucleotide binding protein alpha inhibitor，

GNAI）蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），cAMP和腺苷酸環(huán)化酶（recombinant adenylate cyclase，ADCY）蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和DST組大鼠海馬組織中GNAI蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），cAMP和ADCY蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中PKA、CREB和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和DST組大鼠海馬組織中PKA、CREB和BDNF蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見圖6。

圖6 各組大鼠海馬組織中cAMP/PKA/CREB通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A,B）和直條圖（C,D）Fig.6Electrophoregram(A,B)and histogram(C,D)of expressions of cAMP/PKA/CREB pathway related proteins in hippocampus tissue of rats in various groups

3 討 論

衰老是導(dǎo)致大腦功能逐漸衰退的主要因素，并與記憶喪失、癡呆癥和認(rèn)知障礙有密切關(guān)聯(lián)［12-13］。本研究結(jié)果顯示：DST能夠改善衰老大鼠神經(jīng)元受損程度，對海馬區(qū)神經(jīng)元修復(fù)具有明顯效果，且對海馬區(qū)老年斑形成具有明顯改善作用；D-gal可使大鼠腦組織中SOD、GSH活性和cAMP水平明顯降低，MDA水平明顯升高，且DST治療后能夠校正由D-gal導(dǎo)致的上述改變，表明DST能夠通過清除自由基，發(fā)揮抗氧化的作用，改善能量代謝，提高衰老大鼠認(rèn)知功能。在生理?xiàng)l件下，SOD和GSH抗氧化防御系統(tǒng)能夠清除高活性分子［14］。然而，如果活性氧的生成和細(xì)胞防御系統(tǒng)之間存在失衡，就會發(fā)生氧化損傷，從而啟動細(xì)胞凋亡，引發(fā)神經(jīng)退行性疾病。GSH是重要的抗氧化劑，具有緩解體內(nèi)氧化損傷的功效，常作為重要指標(biāo)來衡量機(jī)體的抗氧化能力。SOD作為體內(nèi)的抗氧化酶，能夠有效清除超氧陰離子自由基，產(chǎn)生過氧化氫，使細(xì)胞免受破壞。MDA作為自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化形成的產(chǎn)物，其水平降低說明氧化應(yīng)激得到改善［15］。DST對上述指標(biāo)的調(diào)節(jié)，表明其可通過清除自由基和抗氧化來改善衰老模型大鼠的認(rèn)知障礙。

近年來研究［16］顯示：cAMP/PKA/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起關(guān)鍵的作用，能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活、再生和分化等，而DST可通過激活該通路修復(fù)神經(jīng)元損傷。

PKA和CREB蛋白是cAMP/PKA/CREB信號通路的關(guān)鍵因子，DST可促進(jìn)其表達(dá)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)幫助神經(jīng)元存活，促進(jìn)其生長，對長期學(xué)習(xí)記憶的形成具有重要意義［17］。PKA催化絲氨酸133位點(diǎn)亞基磷酸化后，促進(jìn)CREB與DNA結(jié)合和基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)BDNF蛋白合成，抑制神經(jīng)元凋亡和促進(jìn)其修復(fù)［18］。

本研究結(jié)果顯示：DST治療后大鼠海馬組織中cAMP的水平明顯升高。cAMP是由磷酸二脂酶催化形成的，是cAMP/PKA/CREB信號通路中的第二信使［19］，細(xì)胞內(nèi)升高的cAMP活化PKA，cAMP/PKA信號通路被激活后可刺激一系列下游因素，促進(jìn)神經(jīng)再生［20-21］。

CREB是真核生物細(xì)胞核內(nèi)的調(diào)控因子，與神經(jīng)生長、損傷、再生、突觸可塑性及學(xué)習(xí)和記憶能力有密切關(guān)聯(lián)［22］。CREB信號在調(diào)節(jié)神經(jīng)元成熟過程中起著至關(guān)重要的作用，且CREB磷酸化可促進(jìn)海馬依賴性長期記憶的形成。研究［23］顯示：增加CREB活性可以緩解AD轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶缺陷。本研究結(jié)果顯示：DST治療后大鼠海馬組織中BDNF蛋白表達(dá)水平明顯升高。BDNF是CREB的下游靶基因之一，在神經(jīng)元存活中發(fā)揮重要作用，能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸傳遞和發(fā)生［24］，BDNF在腦衰老中具有多種作用［25］，主要調(diào)節(jié)與學(xué)習(xí)、記憶和運(yùn)動恢復(fù)相關(guān)的突觸及軸突的可塑性，可減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的損傷［26］。此外，BDNF促進(jìn)AD后血管生成和神經(jīng)再生，防止氧化損傷，并促進(jìn)功能恢復(fù)［27］。

綜上所述，DST可保護(hù)D-gal所致衰老大鼠海馬神經(jīng)元，減少大鼠海馬區(qū)老年斑形成，改善學(xué)習(xí)記憶功能，其機(jī)制可能與DST清除氧自由基和發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)，并可進(jìn)一步通過激活cAMP/PKA/CREB信號通路，修復(fù)神經(jīng)元損傷，從而發(fā)揮其改善衰老的作用。