王山林 駱新波 黃煊 王健 徐頌

成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞均是骨組織的重要組成部分,成骨細(xì)胞的骨形成能力以及破骨細(xì)胞的骨吸收能力的動(dòng)態(tài)平衡在骨生長(zhǎng)、發(fā)育、修復(fù)及重建中發(fā)揮著重要作用［1］。成骨細(xì)胞的骨形成能力與破骨細(xì)胞的骨吸收能力失衡會(huì)誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)生［2］。骨質(zhì)疏松癥的特征表現(xiàn)為骨量丟失,骨密度降低,骨脆性增加,其不僅會(huì)增加骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),而且會(huì)導(dǎo)致骨骼畸形,胸椎變形,甚至?xí)浩刃姆?出現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)障 礙［3,4］。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)數(shù)據(jù),65 歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率達(dá)到32.0%,其中男性為10.7%,女性為51.6%,城市地區(qū)為25.6%,農(nóng)村地區(qū)為35.3%,其發(fā)病率存在一定的性別及地域差異［5］。目前,臨床對(duì)骨質(zhì)疏松癥的致病機(jī)制尚不明確,故本次研究從破骨細(xì)胞功能調(diào)控入手,探討破骨細(xì)胞功能調(diào)控與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率之間的關(guān)系,現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取2019年6月～2020年 12月就診于本院并確診為骨質(zhì)疏松癥的患者92例作為觀察組,同時(shí)收集本院體檢中心健康志愿者48例作為對(duì)照組。其中觀察組男女比例53∶39,年齡52～75 歲,平均年齡(64.5±7.1)歲。對(duì)照組男女比例29∶19,年齡50～79 歲,平均年齡(63.1±7.1)歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組所有入組對(duì)象均符合世界衛(wèi)生組織(WHO)對(duì)骨質(zhì)疏松癥的診斷［6］。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有嚴(yán)重器質(zhì)性病變患者、影響骨代謝的自身免疫性疾病以及惡性腫瘤等患者。

1.2 方法

1.2.1 破骨細(xì)胞平均數(shù)計(jì)算 將骨髓巨噬細(xì)胞接種含有巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的α-最低必需培養(yǎng)基 (MEM)的T75 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí),轉(zhuǎn)接至96 孔板中過夜培養(yǎng)。第2 天后,用100 ng/ml 核因子κ-B 配體受體致活劑(RANKL)刺激骨髓巨噬細(xì)胞,直至破骨細(xì)胞形成。隨后,使用2.5%戊二醛固定細(xì)胞,并按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行TRAP 染色,染色完成后,在光學(xué)顯微鏡下觀察破骨細(xì)胞計(jì)數(shù),對(duì)于細(xì)胞核≥3個(gè)的細(xì)胞歸為破骨細(xì)胞,并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 TRACP 及 Cathepsin K 基因表達(dá)量測(cè)定 將培養(yǎng)好的骨髓巨噬細(xì)胞取出,提取其核糖核酸(RNA),將RNA 反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA),并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法獲得TRACP 及 Cathepsin K 的Ct 值,使用2-△△CT方法計(jì)算每個(gè)靶基因的相對(duì)表達(dá)。

1.2.3 白細(xì)胞介素細(xì)胞因子分泌水平的測(cè)定 留取培養(yǎng)＞2 d 的細(xì)胞上清液,將其分裝凍存于-80℃冰箱中,采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELASA)測(cè)定IL-6 及IL-1β 分泌水平,操作步驟按試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。ELASA 試劑盒購(gòu)自江萊生物科技有限公司。

1.2.4 骨吸收活力測(cè)定 將培養(yǎng)好的破骨細(xì)胞接種于羥基磷灰石涂覆的96 孔板,2 d 后漂洗并干燥觀察羥基磷灰石吸收情況,并用Image J 軟件進(jìn)行骨吸收面積分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用 Spearman 相關(guān)分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者間破骨細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)對(duì)比 觀察組患者破骨細(xì)胞平均數(shù)、TRACP 及 Cathepsin K 基因表達(dá)水平、IL-6 及IL-1β 分泌水平、骨吸收活力均顯著高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組患者間破骨細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)對(duì)比 ()

表1 兩組患者間破骨細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)對(duì)比 ()

注：與對(duì)照組對(duì)比,aP＜0.05

2.2 各指標(biāo)與骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性分析 破骨細(xì)胞平均數(shù)、TRACP 及 Cathepsin K 基因表達(dá)分泌水平、IL-6 及IL-1β、骨吸收活力與骨質(zhì)疏松癥呈正相關(guān)(P＜0.05)。見表2。

表2 骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性分析

2.3 不同指標(biāo)間的相關(guān)性分析 為進(jìn)一步探明各指標(biāo)之間的相關(guān)性,本研究將TRACP 及Cathepsin K 基因表達(dá)水平、IL-6 及IL-1β 分泌水平與破骨細(xì)胞平均數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析,研究發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-1β 水平及TRACP、Cathepsin K 基因表達(dá)水平均與破骨細(xì)胞平均數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.505、0.286，0.374、0.448,P＜0.05)。

3 討論

骨組織重建過程的調(diào)節(jié)主要由成骨細(xì)胞的骨形成功能及破骨細(xì)胞的骨吸收功能完成,長(zhǎng)期過度的骨吸收會(huì)導(dǎo)致上述平衡被破壞,進(jìn)而誘發(fā)由于骨吸收增多所引起的一系列疾病［6］。骨質(zhì)疏松癥作為一種骨破壞性疾病,曾有研究表明破骨細(xì)胞在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病過程中起到重要作用［7］。因此,本研究在系統(tǒng)文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)對(duì)比骨質(zhì)疏松患者與健康體驗(yàn)者之間破骨細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)差異,并研究各指標(biāo)與疾病發(fā)生之間的相關(guān)性,以期為明確骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制,指導(dǎo)該病的臨床診療提供理論指導(dǎo)與參考借鑒。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),觀察組患者破骨細(xì)胞平均數(shù)、TRACP 及 Cathepsin K 基因表達(dá)水平、IL-6 及IL-1β分泌水平、骨吸收活力均顯著高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示破骨細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)在骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)高表達(dá)。破骨細(xì)胞平均數(shù)、TRACP及 Cathepsin K 基因表達(dá)水平、IL-6 及IL-1β 分泌水平在骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞因子分泌量及破骨細(xì)胞標(biāo)志物基因表達(dá)水平均與破骨細(xì)胞平均數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.505、0.286，0.374、0.448,P＜0.05)。提示臨床可通過評(píng)估炎癥因子分泌水平或基因表達(dá)水平以判定破骨細(xì)胞的表達(dá)水平,進(jìn)而評(píng)估骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。此外,有研究發(fā)現(xiàn)包括IL-6 及IL-1β 等在內(nèi)的炎癥因子參與破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能的調(diào)節(jié)［8］,為進(jìn)一步探討細(xì)胞因子在破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化和功能改變方面的作用,本研究系統(tǒng)對(duì)比了骨質(zhì)疏松患者與對(duì)照組之間炎癥因子的分泌水平,研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者的炎癥因子分泌水平顯著高表達(dá),且其與破骨細(xì)胞數(shù)量之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05),這提示骨質(zhì)疏松癥骨髓單個(gè)核細(xì)胞局部分泌的炎癥因子異常升高,從而刺激骨髓單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并提高已成熟的破骨細(xì)胞的骨細(xì)胞活力,進(jìn)而成為導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上,本研究證實(shí)破骨細(xì)胞功能調(diào)控與骨質(zhì)疏松發(fā)生息息相關(guān),建議臨床基于研究結(jié)果,探討有效手段抑制破骨細(xì)胞表達(dá),進(jìn)而提高骨質(zhì)疏松癥的臨床診療效果。