馬偉科，楊衛(wèi)國，林燕鴻，張蕾，魏鋒

1深圳市兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東深圳 518038；2深圳市兒童醫(yī)院消化內(nèi)科

膿毒癥是感染引起的全身反應(yīng)綜合征，為全球兒童發(fā)病、病死的主要原因，全球每年有超過120萬例兒童患膿毒癥［1］。肝損傷是膿毒癥的常見并發(fā)癥，是病情進(jìn)展為多器官功能障礙的早期臨床表現(xiàn)之一，患兒病死率高達(dá)60%［2］。因此，早期對患兒進(jìn)行預(yù)后評估具有重要意義。研究［3］表明，炎癥反應(yīng)、腸道細(xì)菌/內(nèi)毒素移位與膿毒癥并發(fā)肝損傷（sepsisassociated liver injure，SALI）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，可調(diào)控細(xì)胞多種生物學(xué)功能，在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［4］。miR-122a是特異性高表達(dá)于肝臟組織的一種miRNA。miR-122a參與了炎癥反應(yīng)，與多種肝臟疾病有關(guān)［5］。高遷移率 族 蛋 白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一類高度保守蛋白質(zhì)，是啟動(dòng)和維持炎癥瀑式反應(yīng)的中心分子，可促進(jìn)多種炎性介質(zhì)的生成和釋放［6］。miR-122a、HMGB1是否可用于SALI患兒的預(yù)后評估目前暫無相關(guān)報(bào)道。我們檢測了SALI患 兒 血 清miR-122a、HMGB1，探 討miR-122a、HMGB1在SALI患兒預(yù)后評估中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取深圳市兒童醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護(hù)室2018年7月－2020年5月間收治的膿毒癥患兒198例，根據(jù)是否合并肝損傷分為兩組，肝損傷組80例，其中男44例，女36例；年齡2～12歲，中位8歲；BMI 13～17 kg/m2，中位14 kg/m2。根據(jù)TBIL或ALT較正常水平升高程度［8］評估SALI組肝損傷程度，重度為TBIL升高＞3倍或ALT升高＞5倍，中度為TBIL升高2～3倍或ALT升高3～5倍，輕度為TBIL升高1倍或ALT升高1～2倍。根據(jù)肝損傷程度將肝損傷組分為重度37例、中度23例、輕度20例。無肝損傷組118例，其中男68例，女50例；年齡1～12歲，中位7歲；BMI 13～17 kg/m2，中位15 kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：①膿毒癥符合《兒童膿毒性休克（感染性休克）診治專家共識(shí)（2015版）》［7］診斷標(biāo)準(zhǔn)；②肝損傷符合《國際兒科敗血癥共識(shí)會(huì)議：小兒敗血癥和器官功能障礙的定義》［8］診斷標(biāo)準(zhǔn)：血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）＞34.1μmol/L或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）＞80 U/L；③患兒家屬或監(jiān)護(hù)人對研究知情同意；④臨床資料完整者；⑤年齡1～12歲；排除標(biāo)準(zhǔn)：①藥物、中毒等導(dǎo)致的肝損傷者；②既往存在肝臟疾病病史；③自身免疫性疾病者；④惡性腫瘤者；⑤肝炎病毒感染者。另選取同期60例體檢健康兒童為對照組，其中男24例，女36例；年齡3～12歲，中位7歲；BMI 13～17 kg/m2，中位14 kg/m2；三組年齡、性別比例等一般資料具有可比性（P均＞0.05）。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 各組血清miR-122a、HMGB1檢測 采集肝損傷組和無肝損傷組入院后次日清晨，對照組入院當(dāng)日6 mL空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min，半徑8 cm，分離血清，置于-80℃冰箱中待檢。取3 mL，TRIzol試劑盒（北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司）提取血清總RNA，TakaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA，加入miR-122a引物序列（正向引物：5'-GGGAAGTGGATACGAAGAATGC-3'，反 向 引 物：5'-CGACTTTAACACAGCGTGGAG-3'），實(shí)時(shí)熒光定量法檢測，反應(yīng)條件：95℃15 s、65℃20 s、75℃15 s，循環(huán)40次，以U6做內(nèi)參校正（正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反 向 引 物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'），反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管Ct，以2-ΔΔCt代表miR-122a的相對表達(dá)量。另取3 mL，ELISA法（北京方程生物科技有限公司）測定血清HMGB1，所有操作均嚴(yán)格按使用說明書進(jìn)行。重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料間比較采用Z檢驗(yàn)；正態(tài)分布且方差齊計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較q檢驗(yàn)；偏態(tài)分布或方差不齊計(jì)量資料以M（QL，QU）表示，兩組間Z檢驗(yàn)，多組間H檢驗(yàn)，組間兩兩比較Bonferroni法校正；對肝損傷組患兒隨訪28 d，以PICU時(shí)間、肝損傷程度（重度=3；中度=2；輕度=1）、miR-122a、HMGB1為自變量，預(yù)后情況為因變量（死亡=1，存活=0），采用多因素Logistics回歸分析法分析SALI患兒不良預(yù)后的影響因素；繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析血清miR-122a表達(dá)、HMGB1水平對SALI患兒不良預(yù)后的預(yù)測價(jià)值，曲線下面積（area under curve，AUC）的比較采用Z檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組及不同肝損傷程度的SALI患兒血清miR-122a表達(dá)、HMGB1水平比較 肝損傷組、無肝損傷組、對照組血清miR-122a相對表達(dá)量分別為2.85±0.56、2.61±0.45及1.01±0.12，血清HMGB1水平分別為29.33（25.50，35.40）、20.45（16.20，24.64）及14.65（11.59，17.60）μg/L。與對照組比較，肝損傷組血清miR-122a相對表達(dá)量、HMGB1水平均升高，與無肝損傷組、對照組比較，肝損傷組血清miR-122a表達(dá)、HMGB1水平均升高（P均＜0.05）。

重、中、輕度SALI患兒血清miR-122a相對表達(dá)量分別為3.29±0.37、2.74±0.30及2.17±0.28，血 清HMGB1水 平 分 別 為35.58（31.65，39.41）、27.88（27.24，30.45）、22.15（23.90，24.79）μg/L。與輕度組比較，中度組血清miR-122a表達(dá)、HMGB1水平高（P均＜0.05），與中、輕度組比較，重度組血清miR-122a表達(dá)、HMGB1水平高（P均＜0.05）。

2.2 SALI患兒不良預(yù)后的影響因素 SALI患兒死亡48例、存活32例，死亡者男28例、20女例，年齡8（6，10）歲，BMI 15（13，16）kg/m2，PICU時(shí)間10.5（5，12）d，機(jī)械通氣時(shí)間2.5（2，4）d，心率（116.65±6.96）次／分，感染部位為呼吸系統(tǒng)10例、消化系統(tǒng)12例、泌尿系統(tǒng)16例、中樞神經(jīng)系統(tǒng)9例及其他1例，肝損傷程度為重度28例、中度11例、輕度9例，血清miR-122a相對表達(dá)量為3.19±0.40，血清HMGB水平為133.62（29.79，38.44）μg/L。存活者男16例、女16例，年齡8（5，9）歲，BMI 14（13，15）kg/m2，PICU時(shí)間5（3，11）d，機(jī)械通氣時(shí)間3（1，4）d，心率（115.44±4.61）次／分，感染部位為呼吸系統(tǒng)7例、消化系統(tǒng)7例、泌尿系統(tǒng)12例、中樞神經(jīng)系統(tǒng)4例及其他2例，肝損傷程度為重度9例、中度12例、輕度11例，血清miR-122a相對表達(dá)量為2.35±0.37，血清HMGB1水平為24.71（22.96，27.22）μg/L。二者PICU時(shí)間、肝損傷程度和血清miR-122a相對表達(dá)量、HMGB1水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。重度肝損傷、miR-122a、HMGB1為SALI患兒不良預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。SALI患兒不良預(yù)后的Logistics回歸分析結(jié)果見表1。

表1 SALI患兒不良預(yù)后影響因素的Logistics回歸分析結(jié)果

2.3 血清miR-122a表達(dá)、HMGB1水平對SALI患兒不良預(yù)后的預(yù)測價(jià)值 當(dāng)截?cái)嘀凳?.490時(shí)，血清miR-122a表達(dá)預(yù)測SALI患兒不良預(yù)后的AUC為0.793，敏感度77.08%，特異度71.87%。當(dāng)截?cái)嘀凳?7.88μg/L時(shí)，血清HMGB1水平預(yù)測SALI患兒不良預(yù)后的AUC為0.788，敏感度64.58%，特異度78.12%，當(dāng)截?cái)嘀凳?.46時(shí)，血清miR-122a+HMGB1預(yù)測SALI患兒不良預(yù)后的AUC為0.921，敏感度87.50%，特異度81.25%。血清miR-122a+HMGB1聯(lián)合預(yù)測SALI患兒不良預(yù)后的AUC大于miR-122a、HMGB1（Z=4.093、3.623，P均＜0.05），敏感度、特異度也高于血清miR-122a、HMGB1單獨(dú)預(yù)測。

3 討論

肝臟是人體具有解毒、代謝、免疫等重要功能的器官，同時(shí)也是機(jī)體最大的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，是膿毒癥早期易侵及損傷的器官之一［9-10］。肝損傷是膿毒癥患者病情發(fā)展進(jìn)入多器官功能障礙綜合征的重要標(biāo)志，其重要性高于中樞神經(jīng)、循環(huán)、呼吸系統(tǒng)等預(yù)警指標(biāo)，因此早期評估患者的預(yù)后極為重要。膿毒癥發(fā)生后，肝臟可介導(dǎo)免疫反應(yīng)清除細(xì)菌和內(nèi)毒素，但同時(shí)也會(huì)引起肝臟炎癥反應(yīng)、免疫抑制，最終引起肝臟損傷；同時(shí)，腸道作為機(jī)體最大的細(xì)菌/內(nèi)毒素儲(chǔ)存地，隨著內(nèi)毒素產(chǎn)生量增加，可破壞腸黏膜，進(jìn)入血液，再經(jīng)血液進(jìn)入肝臟，超過肝臟自身處理能力，加重肝損傷程度［3］。

miRNAs是一類內(nèi)源基因編碼長度為20～24個(gè)核苷酸的RNA分子，其家族成員主要存在動(dòng)植物細(xì)胞核、細(xì)胞外及血液循環(huán)中，可互補(bǔ)配對mRNA堿基序列，結(jié)合靶miRNA的3’-非翻譯區(qū)，抑制靶miRNA翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與了細(xì)胞多種生命過程［11］。miR-122a是肝臟特異性高表達(dá)miRNA，占總肝臟miRNAs的70%，參與調(diào)控肝細(xì)胞分化、增殖、凋亡等眾多生物學(xué)過程［12］。目前研究證實(shí)，miR-122a還具有調(diào)控肝炎病毒復(fù)制、脂質(zhì)代謝等功能，在miR-122a在肝細(xì)胞癌、纖維化、脂肪性肝炎等肝臟疾病中發(fā)揮作用。RAHMEL等［13］研究顯示，膿毒癥患者血清miR-122表達(dá)明顯上調(diào)，與患者器官功能障礙發(fā)生和預(yù)后相關(guān)。而miR-122a作為miR-122家族一員，是否也與膿毒癥患者器官功能障礙有關(guān)？研究發(fā)現(xiàn)，miR-122a可通過抑制B淋巴細(xì)胞瘤-2、B淋巴細(xì)胞瘤-XL表達(dá)，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，抑制機(jī)體免疫功能［14］。本研究結(jié)果顯示，對照組、無肝損傷組、肝損傷組血清miR-122a相對表達(dá)量逐漸提升，提示miR-122a可能參與了SALI發(fā)生。進(jìn)一步分析顯示，血清miR-122a相對表達(dá)量隨著肝損傷加重而提升，為SALI患兒不良預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素，分析與miR-122a可抑制機(jī)體免疫功能、增強(qiáng)細(xì)菌和內(nèi)毒素介導(dǎo)炎癥反應(yīng)有關(guān)。閉合蛋白是一種跨膜緊密連接蛋白，過低或過度表達(dá)均會(huì)引起緊密連接屏障功能障礙。腸道中腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的閉合蛋白表達(dá)主要由miR-122a調(diào)節(jié)，提示miR-122a可能通過上調(diào)閉合蛋白的表達(dá)，引起腸屏障功能障礙，促進(jìn)腸道細(xì)菌/內(nèi)毒素移位，加重肝損傷，導(dǎo)致患兒預(yù)后不良［15］。

HMGB1是一種非組蛋白核蛋白，廣泛分布于心、肝、腎、肺、腦、淋巴等組織中，在進(jìn)化過程中高度保守，在細(xì)胞核中具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、DNA修復(fù)、核小體形成等作用，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能具有重要作用［16］。HMGB1可通過被動(dòng)釋放或主動(dòng)分泌從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞組織應(yīng)激反應(yīng)，并結(jié)合Toll樣受體2、Toll樣受體4、晚期糖基化終末產(chǎn)物等相應(yīng)胞膜受體，參與炎癥反應(yīng)［17］。LEE等［18］對小鼠注射重組HMGB1，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)膿毒癥表現(xiàn)，再次注射姜酮靶向抑制HMGB1表達(dá)，小鼠體內(nèi)組織損傷和總死亡率明顯降低，說明HMGB1參與了膿毒癥發(fā)生。YANG等［19］研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1過度表達(dá)與肝細(xì)胞死亡程度呈正相關(guān)，參與急性肝衰竭的全身炎癥和多器官衰竭，說明HMGB1參與了肝損傷。本研究結(jié)果顯示，對照組、無肝損傷組、肝損傷組血清HMGB1水平逐漸提升，提示HMGB1可能參與了SALI發(fā)生。進(jìn)一步分析顯示，血清HMGB1水平隨著肝損傷加重而提升，為SALI患兒不良預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素，分析可能原因?yàn)榘釮MGB1可通過結(jié)合晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，磷酸化促分裂原活化蛋白激酶，引起活化蛋白-1和核因子-κB核內(nèi)轉(zhuǎn)移，啟動(dòng)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)［20］。同時(shí)過度HMGB1表達(dá)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)還可提升腸道黏膜通透性，促進(jìn)腸道細(xì)菌/內(nèi)毒素移位［21］。

進(jìn)一步分析SALI患兒不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素后發(fā)現(xiàn)，死亡及存活患兒的PICU時(shí)間、肝損傷程度和血清miR-122a、HMGB1水平差異明顯。重度肝損傷、miR-122a、HMGB1為SALI患兒不良預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素。重度肝損傷說明患兒病情嚴(yán)重，因此患兒的預(yù)后更差。

血清miR-122a表達(dá)、預(yù)測SALI患兒不良預(yù)后的AUC、敏感度、特異度為0.793、77.08%、71.87%，血清HMGB1水平分別為0.788、64.58%、78.12%，說明miR-122a與HMGB1均對SALI患兒不良預(yù)后具有一定預(yù)測價(jià)值，但二者聯(lián)合檢測的AUC明顯增加，且敏感度、特異度更高，說明聯(lián)合檢測血清miR-122a、HMGB1水平更有利于評估SALI患兒不良預(yù)后。

綜上所述，隨肝損傷嚴(yán)重程度升高，膿毒癥患兒血清miR-122a表達(dá)、HMGB1水平升高。SALI患兒不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素為重度肝損傷、血清miR-122a及HMGB1水平升高。血清miR-122a表達(dá)、HMGB1水平聯(lián)合檢測可用于預(yù)測SALI患兒的不良預(yù)后。