楊露銀，楊忠明

1西南醫(yī)科大學(xué)，四川瀘州 646000；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科

宮頸癌（Cervical Cancer，CC）是女性常見惡性腫瘤之一。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明CC在全球女性癌癥中的發(fā)病率及病死率均較高，且呈年輕化趨勢［1］。因CC臨床表現(xiàn)缺乏特異性，多數(shù)患者就診時(shí)病情已處于晚期，導(dǎo)致臨床總體療效不高。放化療治療常導(dǎo)致CC患者出現(xiàn)不良反應(yīng)，使得患者治療的依從性較差。尋求包括中醫(yī)藥在內(nèi)的綜合CC治療方案是目前的研究熱點(diǎn)。六君子湯出自《醫(yī)學(xué)正傳》，由人參、白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、半夏六味藥組成，主治脾胃氣虛兼痰濕證。六君子湯具良好的抗腫瘤作用，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞遷移和血管生成，調(diào)節(jié)免疫功能及改善患者惡病質(zhì)等；臨床研究［2］數(shù)據(jù)亦表明該方能減輕放化療不良反應(yīng)、提升腫瘤患者的免疫功能等［2］。但目前六君子湯治療CC的藥理學(xué)作用及其機(jī)制尚不完全明確，仍需進(jìn)一步研究。2020年8月—2021年1月，我們采取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選六君子湯治療CC的主要活性成分及其關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，分析六君子湯主要活性成分關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的生物學(xué)功能，以期為六君子湯治療CC的藥物臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 六君子湯治療CC的主要活性成分分析 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索六君子湯中人參、白術(shù)、茯苓、陳皮、半夏、甘草的化學(xué)成分，依據(jù)ADME原則，篩選出OB值（Oral Bioavailability）≥30%，DL值≥0.18的活性成分。

1.2 六君子湯治療CC的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因篩選

1.2.1 六君子湯主要活性成分作用靶點(diǎn)基因篩選 將篩選出的活性成為在DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫中匹配相關(guān)藥物作用靶點(diǎn)基因，并運(yùn)用Uniport（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫對獲取的藥物作用靶點(diǎn)名稱進(jìn)行校正。在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中查詢所獲取的活性成分的2D分子結(jié)構(gòu)式并保存；將獲取的2D分子結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）以 預(yù)測活性成分的作用靶點(diǎn)基因，以Probability≥0.3為標(biāo)準(zhǔn)最終得到六君子湯活性成分的作用靶點(diǎn)基因。

1.2.2 CC的疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)基因篩選 在Gene Cards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫及OMIM（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫中以“cervical cancer”、“cervical carcinoma”為檢索對象進(jìn)行檢索，獲取CC的治療的相關(guān)靶點(diǎn)，并匯總、去重。由于疾病靶點(diǎn)信息較多，故依據(jù)score得分篩選出中位數(shù)，并選取score得分在中位數(shù)前的靶點(diǎn)信息作為疾病靶點(diǎn)。將獲取的疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot中，選定范圍為“Homo sapiens”，將靶點(diǎn)信息轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的Uniprot ID及基因名稱，最終得到CC的疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)基因。

1.2.3 六君子湯治療CC的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因篩選 治療CC的六君子湯主要活性成分作用靶點(diǎn)基因和CC疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)基因?qū)隫enny2.1.0在線工具（https：//bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index.html）進(jìn)行韋恩圖繪制，獲取共同靶點(diǎn)。將獲取的共同靶點(diǎn)信息上傳至string數(shù)據(jù)平臺（https：//string-db.org）進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，設(shè)定高置信度為0.9，并隱藏?zé)o關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)后得到六君子湯主要活性成分作用靶點(diǎn)基因與CC疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。將獲取的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理，使用cytoHubba插件及Net-workAnalyzer進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，篩選度值（degree）前30的靶點(diǎn)為六君子湯治療CC的核心靶點(diǎn)。

1.3 六君子湯主要活性成分關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的生物學(xué)功能 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析，分析六君子湯治療CC的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的生物學(xué)功能。GO富集結(jié)果包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component）及分子功能（molecular function，MF）三個方面，依據(jù)P-Value、count及Fold Enrichment等指標(biāo)篩選出排名前10的結(jié)果進(jìn)行富集；KEGG富集分析時(shí)，篩選P≤0.05的通路進(jìn)行富集，并使用R語言繪制富集氣泡圖。將獲取的六君子湯主要活性成分、關(guān)鍵作用靶點(diǎn)基因及信號通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，繪制六君子湯主要活性成分—關(guān)鍵靶點(diǎn)基因—信號通路圖，進(jìn)一步明確靶點(diǎn)進(jìn)與信號通路在六君子湯治療CC中的作用。

2 結(jié)果

2.1 六君子湯治療CC主要活性成分 六君子湯治療CC的主要活性成分有槲皮素、山奈酚、柚皮素、β谷甾醇、豆甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、黃芩素、芒柄花黃素、川陳皮素、苜蓿素等149個。

2.2 六君子湯治療CC的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因 六君子湯前6位活性成分的藥物的作用靶點(diǎn)基因有促分裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、促分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（STAT3）、MAPK1、MAPK3、JUN、SRC、MAPK14、NR3CI、RELA、AKT1、TP53等331個。CC治療相關(guān)靶點(diǎn)有3 300個。將331個藥物活性成分作用靶點(diǎn)基因與3 300個疾病（CC）靶點(diǎn)合并、取交集，并進(jìn)行維恩分析，得到222個藥物—疾病共同靶點(diǎn)。最終篩選出六君子湯治療CC的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因有MAPK3、MAPK1、STAT3等30個。

2.3 六君子湯主要活性成分關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的生物學(xué)功能 六君子湯治療CC關(guān)鍵靶點(diǎn)基因涉及BP條目99個、細(xì)胞組成條目13個、MF條目21個。六君子湯治療CC關(guān)鍵靶點(diǎn)基因主要參與的生物學(xué)功能為RNA轉(zhuǎn)錄、DNA鏈的特異性結(jié)合、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等，六君子湯治療CC關(guān)鍵靶點(diǎn)基因主要富集在腫瘤相關(guān)信號通路、癌癥中的蛋白多糖、ErbB信號通路等108條信號通路。六君子湯治療CC的主要活性成分—靶點(diǎn)基因—通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖見圖1。

圖1 六君子湯治療CC的主要活性成分—靶點(diǎn)基因—信號通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

3 討論

目前臨床CC的治療方法以手術(shù)及放化療為主。隨中醫(yī)藥在腫瘤治療領(lǐng)域中的應(yīng)用不斷擴(kuò)寬，越來越多的證據(jù)表明中醫(yī)藥能增效減毒，提高腫瘤患者生存質(zhì)量、延長生存期。六君子湯作為臨床應(yīng)用十分廣泛的經(jīng)方之一，具有良好的抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、改善惡病質(zhì)、減輕放化療不良反應(yīng)等作用。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，通過對六君子湯的活性成分、作用靶點(diǎn)基因的篩選，構(gòu)建成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析其生物過程與信號通路，從而推測六君子湯治療CC的作用機(jī)制。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步篩選出六君子湯治療CC的活性成分主要有槲皮素、山奈酚、柚皮素、β谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、芒柄花黃素、川陳皮素、苜蓿素等。槲皮素（Quercetin）主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，可以通過滅活caspase/Cyto-c途徑、抑制AP-2β/h TERT、抑制NF-κB/COX-2和阻斷Akt/ERK1/2信號通路而發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。山奈酚（Kaempferol）能抑制ERK/MAPK通路和PI3K-AKT通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，還能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制癌細(xì)胞黏附、遷移與侵襲等方式發(fā)揮其抗腫瘤活性［4］。柚皮素（Naringenin）可以通過誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)JNK磷酸化從而激活JNK/Bcl2信號通路，繼而誘導(dǎo)CC細(xì)胞凋亡，抑制CC細(xì)胞的生長［5］。β-谷甾醇（beta-sitosterol）能通過介導(dǎo)AMPK、PTEN和HSP90發(fā)揮抗腫瘤作用，豆甾醇（Stigmasterol）能下調(diào)FOS、MYC、RAS、Bcl-2等多種癌基因和上調(diào)NF-2為代表的抑癌基因和Map2k6的表達(dá)；除此之外，還能增加G0/G1期細(xì)胞比例、降低G2/M期細(xì)胞比例，上調(diào)Bax蛋白、P53基因等促凋亡基因的表達(dá)，激活促凋亡蛋白caspase-8、caspase-9的表達(dá)，并通過損傷細(xì)胞DNA的方式，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［6-7］。

黃芩素（Baicalein）具有多途徑、多靶點(diǎn)及多層次抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管新生、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞化療抗藥性、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等效應(yīng)［8-9］。芒柄花黃素（Formononetin）可以通過Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白調(diào)節(jié)多種信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還能在體外和體內(nèi)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B1和細(xì)胞周期蛋白D1等介質(zhì)誘導(dǎo)抗腫瘤特性細(xì)胞周期阻滯，通過激活STAT、PI3K/AKT及MAPK信號通路抑制細(xì)胞增殖，通過調(diào)節(jié)VEGF、FGF2、MMP-2和MMP-9等達(dá)到抗腫瘤作用［10］。

川陳皮素（Nobiletin）主要通過抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞周期和蛋白表達(dá)以及與化療藥物的聯(lián)合以增強(qiáng)抗腫瘤作用［11］。苜蓿素（Medicarpin）能通過下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)能降低內(nèi)皮細(xì)胞上ROS的生成從而下調(diào)VEGFR2信號傳導(dǎo)，還能通過抑制腫瘤細(xì)胞中HIF-1積聚來降低VEGF的表達(dá)［12］。通過上述分析可以得知，六君子湯多種活性成分均有抗腫瘤活性，能從腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞周期等方面發(fā)揮抗腫瘤作用。

六君子湯治療CC的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)基因包括STAT3、MAPK家族相關(guān)蛋白、JUN等。SATA3作為信號蛋白，能參與多種和腫瘤形成相關(guān)的信號通路，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，能抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖從而加速腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，在其與宮頸上皮內(nèi)病變和CC組織表達(dá)的研究中，也提示STAT3的過表達(dá)與CC的發(fā)生發(fā)展有較為密切的關(guān)系［13］。MAPK家族相關(guān)蛋白作為蛋白激酶，在多種信號通路中充當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成分，能調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新血管生成，從而加速腫瘤的生長，促進(jìn)癌細(xì)胞的擴(kuò)散［14］。JUN在細(xì)胞中常以亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的異源二聚體AP-1的形式存在，可因結(jié)構(gòu)改變而被激活為癌基因。JUN的過表達(dá)可以導(dǎo)致AP-1的活化，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因促進(jìn)轉(zhuǎn)移瘤新生血管形成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)和黏附分子的異常表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲［15］。這表明六君子湯可能通過抑制上述靶點(diǎn)基因的表達(dá)從而對CC產(chǎn)生治療作用。

KEGG通路富集結(jié)果表明，六君子湯治療CC可能與癌癥相關(guān)信號通路、ErbB信號通路、催乳素信號通路、HIF-1信號通路及MAPK信號通路等有關(guān)。在癌癥相關(guān)通路中，包括Wnt信號通路、PI3K-Akt信號通路、Jak-STAT信號通路及MAPK信號通路等經(jīng)典信號通路均參與其中。Wnt通路的異常調(diào)控可能導(dǎo)致CC的發(fā)生［16］。PI3K/Akt通路是細(xì)胞生長、增殖和存續(xù)的一個關(guān)鍵信號。有證據(jù)表明這一途徑還可發(fā)出促進(jìn)細(xì)胞死亡信號，尤其是促進(jìn)細(xì)胞壞死的信號［17］。在PI3K/Akt通路與CC的關(guān)系的研究［18-19］中發(fā)現(xiàn)，BMX能通過PI3K/Akt和STAT3信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和CC細(xì)胞的形成，而FOX-C1能直接靶向激活PI3K/Akt通路從而促進(jìn)CC細(xì)胞存活、增殖和上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

Akt信號通路作為HPVE6、E7癌基因蛋白的下游靶點(diǎn)，是CC發(fā)展的主要介質(zhì)。JAK-STAT是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的傳導(dǎo)通路。研究［20］表明，JAK-STAT通路的活化與多種腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系，通過調(diào)節(jié)JAK-STAT通路能有效抑制Hela細(xì)胞的增殖。MAPK通路是細(xì)胞增殖、應(yīng)激、炎癥、分化、功能同步化、轉(zhuǎn)化、凋亡等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同交匯通路之一，能把細(xì)胞外的信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，從而參與細(xì)胞增殖、分化、癌變、轉(zhuǎn)移、凋亡等多種生物過程。由此可推測，六君子湯的多種活性成分能夠通過多種腫瘤相關(guān)通路對CC產(chǎn)生治療作用。

綜上所述，六君子湯治療CC的活性成分主要有槲皮素、山奈酚、柚皮素等149個。六君子湯活性成分與宮頸癌治療的共同靶點(diǎn)222個。六君子湯可能通過STAT3、MAPK家族相關(guān)蛋白、JUN蛋白等靶點(diǎn)，調(diào)控JAK-STAT、Wnt信號通路、PI3K-Akt信號通路及MAPK信號通路，作用于RNA轉(zhuǎn)錄、DNA鏈的特異性結(jié)合、細(xì)胞凋亡等過程。