胡 可，胡紫薇，古月明，唐小冬，溫優(yōu)良

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2019級(jí)碩士研究生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院康復(fù)學(xué)院；3. 贛南醫(yī)學(xué)院第三臨床醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步降低新生兒死亡率的同時(shí)增加了腦癱患兒的發(fā)病率。腦癱是導(dǎo)致兒童身體殘疾的重要疾患，給家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。目前臨床上對(duì)腦癱患兒主要采用藥物、手術(shù)、康復(fù)治療及高壓氧等治療手段，但這些治療對(duì)腦癱患兒療效不穩(wěn)定，更多是一種支持性治療，尤其對(duì)一些重癥患兒療效不佳［1］。近年來(lái)，干細(xì)胞在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的潛在作用受到廣泛關(guān)注，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）在治療腦癱的臨床試驗(yàn)上表現(xiàn)出積極的結(jié)果［2-5］。近年，有研究證實(shí)脂肪來(lái)源的MSCs 即脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived mesenchymal stem ce11s，ADMSCs）在特定的誘導(dǎo)技術(shù)下，同樣可以定向分化成多種類(lèi)型的細(xì)胞和分泌多種生物活性因子［6］。目前，ADMSCs 除應(yīng)用于皮膚組織缺損［7-8］、骨關(guān)節(jié)炎［9-10］、糖尿?。?1-12］等疾病治療外，有動(dòng)物疾病模型實(shí)驗(yàn)也證實(shí)其在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的可行性［13-14］，且在臨床試驗(yàn)上也有案例報(bào)道證實(shí)其療效［15］。本文主要對(duì)ADMSCs治療腦癱的應(yīng)用及研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ADMSCs治療腦癱的取材優(yōu)勢(shì)

一直以來(lái)，骨髓和臍帶是獲取MSCs 的主要來(lái)源，并廣泛地應(yīng)用于臨床與實(shí)驗(yàn)研究。但BMSCs 的獲取不僅具有侵入性，增加感染風(fēng)險(xiǎn)，而且從骨髓中提取出的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量與質(zhì)量也會(huì)受供體者年齡的影響［4］。同樣獲得足夠數(shù)量的UCMSCs大約只能在40%的臍帶樣品中才能實(shí)現(xiàn)［2］。研究表明，人體脂肪中含有充足的ADMSCs，每毫升吸脂劑的干細(xì)胞數(shù)比骨髓中的干細(xì)胞數(shù)約高8 倍［16］，而且ADMSCs 具有穩(wěn)定的增殖分化能力，可以避免因供體者年齡的增長(zhǎng)而顯著下降［17］。ADMSCs 另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)是具有極低的免疫原性，即它可以逃避T 細(xì)胞的免疫識(shí)別而在異體內(nèi)長(zhǎng)期存活。產(chǎn)生此優(yōu)勢(shì)的原因可能是ADMSCs不表達(dá)共刺激表面抗原及其分泌的細(xì)胞因子形成了免疫抑制微環(huán)境對(duì)T細(xì)胞增殖具有直接抑制作用［18］。因此，ADMSCs 通?？梢匀∽曰純旱哪赣H臍周區(qū)域脂肪來(lái)實(shí)現(xiàn)異體移植治療腦癱，有效地避免倫理學(xué)上的爭(zhēng)議?？梢?jiàn)，ADMSCs憑借來(lái)源豐富、提取率高、倫理學(xué)爭(zhēng)議性小、低免疫原性的取材優(yōu)勢(shì)，有望成為治療腦癱的良好種子細(xì)胞。

2 ADMSCs治療腦癱可能的機(jī)制

目前，ADMSCs 治療腦癱的機(jī)制雖然還不能完全明確，但有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)研究證實(shí)它具有促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)和神經(jīng)保護(hù)作用的特性，并可能通過(guò)以下直接或間接的作用機(jī)制來(lái)治療腦癱［19］。

2.1 直接作用直接作用是指腦癱發(fā)生后，受損的腦組織會(huì)釋放出多種生物活性因子，在“歸巢”機(jī)制的作用下，引導(dǎo)移植入患兒體內(nèi)的ADMSCs 容易穿過(guò)已受損的血腦屏障遷移至腦損傷區(qū)域而產(chǎn)生作用［20］。ADMSCs 到達(dá)受損組織處后，在受損組織的特定微環(huán)境誘導(dǎo)下，通過(guò)增殖分化發(fā)育為相應(yīng)組織類(lèi)型的功能細(xì)胞，使各個(gè)腦區(qū)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)連接增加，從而改善腦癱患兒的功能結(jié)局［21］。近年來(lái)，雖有體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)ADMSCs 可以向多種細(xì)胞類(lèi)型分化，但其在體內(nèi)可否直接分化替代受損細(xì)胞卻存在爭(zhēng)議［22］，有待進(jìn)一步深入研究。

2.2 間接作用間接作用是指當(dāng)ADMSCs 移植到患兒體內(nèi)后可旁分泌各種生長(zhǎng)因子來(lái)修復(fù)受損腦組織和營(yíng)造良好的恢復(fù)微環(huán)境［23］，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）能促進(jìn)損傷部位的血管再生，穩(wěn)定損傷部位的血液循環(huán)；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte growth factor，HGF）可影響少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和生長(zhǎng)，加速髓鞘的形成；腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Brain-derived neuro trophic factor，BDNF）可通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，Erk）磷酸化或TrkB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)改善低髓鞘化，還可以與神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Nerve growth factor，NGF）共同激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞再生［19］。另外，在這些生長(zhǎng)因子的作用下能夠?qū)κ軗p組織起到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、減輕炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化、抗凋亡等多種共同作用［24-25］。這些間接治療作用的潛力使得ADMSCs 移植成為治療腦癱的理想選擇。目前，這種間接作用的機(jī)制也被大多數(shù)學(xué)者所接受。

3 ADMSCs治療腦癱的臨床研究

3.1 臨床試驗(yàn)的案例報(bào)道HIRANO A 等［26］首次報(bào)告1 例7 歲腦癱患兒經(jīng)過(guò)6 次靜脈注射移植同種異體ADMSCs 后，評(píng)估了其治療安全性和可行性。報(bào)告顯示在隨訪12個(gè)月的時(shí)間里，患兒臨床表現(xiàn)顯著改善，生活質(zhì)量及身心評(píng)分均顯著提高，未見(jiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。此研究一定程度上反應(yīng)同種異體ADMSCs 在腦癱患兒中可安全有效地使用，但由于受試對(duì)象僅為1 例，其結(jié)果是否可推廣到其他腦癱患兒，需要進(jìn)一步研究。

目前，ADMSCs 治療腦癱的臨床試驗(yàn)側(cè)重于對(duì)單個(gè)受試對(duì)象的療效及安全性評(píng)價(jià)的研究。截止到2020 年1 月31 日從美國(guó)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（Clinicaltrials）查詢到使用ADMSCs 治療腦癱的臨床試驗(yàn)共2 項(xiàng)［27-28］，治療缺血缺氧性腦?。℉ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）的臨床試驗(yàn)共1 項(xiàng)［29］（表1）。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)應(yīng)用ADMSCs 治療腦癱的臨床試驗(yàn)開(kāi)展。

表1 ADMSCs治療腦癱的臨床試驗(yàn)

3.2 臨床試驗(yàn)的注意事項(xiàng)ADMSCs 治療腦癱要想在臨床上得到廣泛應(yīng)用，仍需要開(kāi)展更多標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物模型的臨床前試驗(yàn)和多中心的臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)來(lái)科學(xué)證實(shí)ADMSCs治療腦癱臨床安全性和有效性。在已開(kāi)展的MSCs 治療腦癱的臨床試驗(yàn)中，受試者的年齡、給藥途徑、給藥劑量及隨訪時(shí)間等方面均不一致，這就加大了臨床試驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)。參考其他來(lái)源的MSCs 治療腦癱的臨床試驗(yàn)，為確保ADMSCs 治療腦癱臨床試驗(yàn)的規(guī)范性必須考慮以下3個(gè)方面。

3.2.1 ADMSCs 的來(lái)源與制備ADMSCs 的低免疫原性優(yōu)勢(shì)決定治療腦癱的ADMSCs來(lái)源可以是自體的，也可以是異體的。有研究表示來(lái)自異體的ADMSCs 和自體的ADMSCs 在作用上沒(méi)有差異，甚至接受同種異體MSCs 的患者較自體的不良反應(yīng)更少［26］；但也有研究表明不同脂肪組織來(lái)源的ADMSCs 的分化能力具有差異性［18］，尤其是肥胖者脂 肪 中 的ADMSCs 分 化 潛 力 較 差［30］，因 此 對(duì)ADMSCs 來(lái)源的供體者要進(jìn)行詳細(xì)健康檢查。目前，尚沒(méi)有統(tǒng)一的ADMSCs制備方法，不同的方法制備質(zhì)量也不同。實(shí)驗(yàn)室中較為安全、有效的方法是將采集到的脂肪組織經(jīng)過(guò)緩沖液反復(fù)沖洗以獲得純度較高的脂肪顆粒，隨后用適當(dāng)濃度的Ⅰ型膠原酶或胰蛋白酶對(duì)這些脂肪顆粒進(jìn)行連續(xù)消化離心，接著在無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)貼壁培養(yǎng)傳代擴(kuò)增，獲取足夠數(shù)量的ADMSCs懸浮液冷凍保存?zhèn)溆茫?6］。

3.2.2 ADMSCs 的鑒定與給藥劑量臨床試驗(yàn)中給腦癱患兒注射的ADMSCs 試劑必須根據(jù)《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定［31］。考慮到傳代擴(kuò)增帶來(lái)的影響，臨床試驗(yàn)中一般應(yīng)采用3～5 代的ADMSCs。采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)其表面的標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果必須要符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)規(guī)定的3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)［32］，才能保證治療的安全性。采用臺(tái)盼藍(lán)染色和排除試驗(yàn)測(cè)定制備的ADMSCs 試劑存活率＞80%［26］，才能保證治療的有效性。此外，還要對(duì)試劑進(jìn)行細(xì)菌、支原體、內(nèi)外源致病因子、內(nèi)毒素水平、致瘤風(fēng)險(xiǎn)等檢測(cè)［3，33］。只有給予足夠數(shù)量的干細(xì)胞才能起到一定的療效，但各臨床試驗(yàn)的給藥劑量不一致。在國(guó)內(nèi)針對(duì)神經(jīng)恢復(fù)的臨床細(xì)胞治療指南中建議通過(guò)靜脈注射的方式UCMSCs 的給藥劑量在5×105個(gè)·kg-1～8×105個(gè)·kg-1是安全可行的［34］，但實(shí)際臨床試驗(yàn)中遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了這個(gè)劑量。

3.2.3 ADMSCs 的給藥途徑影響ADMSCs 治療腦癱療效的主要因素在于ADMSCs能否準(zhǔn)確到達(dá)受損部位?，F(xiàn)有干細(xì)胞治療給藥途徑包括腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔注射、腦立體定向手術(shù)和靜脈注射等［4］。其中前兩種給藥方式能夠更有效地將細(xì)胞輸送到受損的腦組織區(qū)域，治療效果更明顯，但其給藥過(guò)程具有較大的侵入性且不易控制治療劑量，由此增加患兒的不良反應(yīng)，甚至出現(xiàn)繼發(fā)性損傷［4，35］。靜脈注射相對(duì)比較安全，但注射后細(xì)胞大部分停留在肺毛細(xì)血管網(wǎng)中很難到達(dá)腦受損部位［36］，必須加大治療劑量才能達(dá)到治療作用，增加了治療成本和肺栓塞形成的風(fēng)險(xiǎn)。目前，還沒(méi)有對(duì)這三種給藥途徑的差異性進(jìn)行研究對(duì)比的報(bào)道。在已開(kāi)展的臨床試驗(yàn)中大多采用靜脈注射重復(fù)間隔給藥方式，但對(duì)于年齡較大、癥狀較重的受試者可以考慮前兩種給藥方式。

3.3 臨床試驗(yàn)的安全性和療效評(píng)估在臨床試驗(yàn)的過(guò)程中，要重視對(duì)受試對(duì)象安全性及療效的客觀反映才能使試驗(yàn)結(jié)果具有科研價(jià)值。在安全性評(píng)估方面，所有開(kāi)展的臨床試驗(yàn)都必須嚴(yán)格遵守《干細(xì)胞臨床研究管理辦法（試行）》的規(guī)定進(jìn)行［37］。在試驗(yàn)前要對(duì)受試者進(jìn)行全面的體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查、心電圖、胸片、腦部核磁共振等。有癲癇史、肝或腎功能不全、凝血功能障礙、嚴(yán)重過(guò)敏性或自身免疫性疾病等高危風(fēng)險(xiǎn)的患兒不應(yīng)納入試驗(yàn)對(duì)象［4］。在每次實(shí)施ADMSCs 移植時(shí)要監(jiān)測(cè)受試者的生命體征［33］，移植后要密切關(guān)注其是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，且至少要隨訪半年以上。對(duì)于臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)的不良反應(yīng)如發(fā)熱、呼吸困難、白細(xì)胞減少等，應(yīng)及時(shí)予以觀察是否終止試驗(yàn)并做好記錄。在療效評(píng)估方面，臨床檢查和功能評(píng)定應(yīng)貫穿整個(gè)治療過(guò)程。在每次實(shí)施ADMSCs移植后應(yīng)該采用各種評(píng)估工具詳細(xì)地對(duì)受試者的運(yùn)動(dòng)功能、言語(yǔ)功能、心理狀態(tài)、自我照顧、社會(huì)適應(yīng)等方面進(jìn)行評(píng)估，最好采用“雙盲”進(jìn)行療效評(píng)估，以便更加客觀地反映治療效果。目前，常用的療效評(píng)估量表有粗大運(yùn)動(dòng)功能測(cè) 試 量 表（GMFM-88）、改 良 的Ashworth 量 表（MAS）、改良Barthel 指數(shù)量表、腦性癱瘓綜合功能評(píng)分量表和語(yǔ)言發(fā)育遲緩量表（S-S）等。這些量表在腦癱療效判斷中具有較好的信度及效度，還可以避免因版權(quán)問(wèn)題受到限制［38］。

4 小 結(jié)

盡管ADMSCs 治療腦癱的前景是樂(lè)觀的，但臨床推廣仍存在一些爭(zhēng)議。例如，通過(guò)靜脈注射方式移植的ADMSCs 除在受損部位可檢測(cè)到外，也會(huì)在肺和心臟等器官發(fā)現(xiàn)，且一段時(shí)間后很難在體內(nèi)再檢測(cè)到ADMSCs。這就增加了我們對(duì)ADMSCs 長(zhǎng)期治療作用的爭(zhēng)議性和向腫瘤細(xì)胞分化的擔(dān)憂，從而限制臨床試驗(yàn)的開(kāi)展。其實(shí)目前對(duì)ADMSCs治療腦癱最大的問(wèn)題在于ADMSCs的體內(nèi)增殖分化機(jī)制尚不完全明確以及缺少治療后長(zhǎng)期隨訪的療效評(píng)價(jià)。其他方面的問(wèn)題有：因腦癱疾病診斷的滯后性，在治療時(shí)機(jī)上錯(cuò)過(guò)最佳的治療時(shí)間；缺少大樣本的受試對(duì)象；聯(lián)合治療不規(guī)范以及最佳治療劑量的未知等?？傊?，ADMSCs 憑借其良好的生物學(xué)特性在治療腦癱上展現(xiàn)出極大的潛力，現(xiàn)有的臨床試驗(yàn)也表現(xiàn)出積極的結(jié)果。但由于基礎(chǔ)研究欠缺和已開(kāi)展的臨床試驗(yàn)較少，我們還需要對(duì)ADMSCs 在體內(nèi)的分化機(jī)制、最佳治療時(shí)機(jī)、最佳治療劑量等做進(jìn)一步的研究。相信隨著研究的深入開(kāi)展，ADMSCs 移植治療腦癱有望徹底實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。