潘啟強(qiáng)， 李云霞， 陳健鑫， 呂則佳， 伍建榕，*， 馬煥成

(1.西南林業(yè)大學(xué) 生物多樣性保護(hù)學(xué)院， 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南 昆明 650224； 2.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院， 國(guó)家林業(yè)局 西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南 昆明 650224)

引言

【研究意義】羊肚菌〔Morchellaesculenta(L.) Pers.〕又稱(chēng)羊肚蘑、羊肚菜，因其外形與羊肚相似而得名[1]，子實(shí)體呈蜂窩狀，屬于子囊菌門(mén)(Ascomycotina)、盤(pán)菌綱(Discomycetes)、盤(pán)菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌屬(Morchella)[2]。羊肚菌的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，據(jù)測(cè)定，羊肚菌含粗蛋白20%、粗脂肪26%、碳水化合物38.1%[3]，至少含有17種氨基酸，特別是谷氨酸含量高達(dá)83.44 mg/g[4]，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源。野生羊肚菌全世界都有分布，在我國(guó)的分布也很廣，主要集中在西藏、云南、四川、新疆、山西、河南、陜西、甘肅等地，但是野生羊肚菌數(shù)量相對(duì)稀少，因此人工栽培滿(mǎn)足市場(chǎng)需求成為必然?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1980年，美國(guó)Ower發(fā)表了野外羊肚菌人工工廠化馴化栽培技術(shù)的專(zhuān)利[5]，為人工栽培羊肚菌奠定了理論基礎(chǔ)。21世紀(jì)初，譚方河[6]在馴化栽培研究中發(fā)現(xiàn)影響羊肚菌人工栽培的2個(gè)重要條件：一是易出菇羊肚菌品種，二是外源營(yíng)養(yǎng)袋補(bǔ)料技術(shù)。這兩項(xiàng)重要條件能夠保證羊肚菌人工栽培的穩(wěn)定增產(chǎn)，同時(shí)極大的促進(jìn)了我國(guó)羊肚菌人工栽培技術(shù)的飛躍。由于羊肚菌人工栽培技術(shù)不斷進(jìn)步，種植羊肚菌的菇民增多。目前，中國(guó)已成為世界上羊肚菌人工栽培面積最大的國(guó)家。2016年，我國(guó)羊肚菌栽培面積達(dá)1 600 hm2。2017年，人工栽培面積近4 666.7 hm2，鮮菇產(chǎn)量約100 kg/667m2，年產(chǎn)量近 7 000 t，2018—2019年全國(guó)栽種面積已達(dá)8 000～9 333 hm2，羊肚菌已成為近年來(lái)我國(guó)食用菌最暢銷(xiāo)的栽種品種之一[7]。麗江是云南省羊肚菌的主要產(chǎn)區(qū)之一，麗江市屬于低緯暖溫帶高原山地季風(fēng)氣候，年溫差小而晝夜溫差大，兼具有海洋性氣候和大陸性氣候特征，利于開(kāi)展羊肚菌的人工栽培。近年來(lái)，羊肚菌的人工栽培技術(shù)取得較大進(jìn)展，栽培面積不斷擴(kuò)大，同時(shí)羊肚菌的病害問(wèn)題也逐漸凸顯。【研究切入點(diǎn)】鐮刀菌一旦危害羊肚菌，病害能夠在短時(shí)間內(nèi)迅速大面積爆發(fā)，且通常聚集連片發(fā)生，最終導(dǎo)致羊肚菌萎蔫、畸形，嚴(yán)重影響其品質(zhì)。截至目前，有關(guān)鐮刀菌危害羊肚菌的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道，但對(duì)麗江栽培羊肚菌的研究尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)麗江市永勝縣人工栽培羊肚干腐病進(jìn)行普查和專(zhuān)題調(diào)查，并統(tǒng)計(jì)相關(guān)病害的發(fā)病率和病情指數(shù)，采集羊肚菌病害標(biāo)本，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，以確定引起羊肚菌干腐病的病原，為人工栽培羊肚菌干腐病的綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 分別于2018年3月、5月和9月在麗江市永勝縣羊肚菌人工種植基地采集病癥病狀明顯的羊肚菌子實(shí)體，對(duì)羊肚菌干腐病的發(fā)生數(shù)量進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，觀察病害癥狀，并做好相關(guān)記錄。標(biāo)本風(fēng)干后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖(或蔗糖)20 g，瓊脂15～20 g，鏈霉素30 mg，水1 000 mL，pH自然，121℃下滅菌30 min。

1.1.3 試劑 分離培養(yǎng)試驗(yàn)使用的試劑有蒸餾水、馬鈴薯、葡萄糖、蔗糖、瓊脂、75%酒精。分子生物學(xué)試驗(yàn)使用的試劑有超純水、液氮、TAE緩沖液、Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、2×Taq Master Mix、核酸染料，真菌引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)病率及病情指數(shù)調(diào)查 對(duì)麗江市永勝縣濤源鎮(zhèn)、魯?shù)乩?zhèn)和三川鎮(zhèn)30塊羊肚菌人工種植基地發(fā)生的羊肚菌干腐病進(jìn)行發(fā)病率和病情指數(shù)調(diào)查，并做好相關(guān)記錄。羊肚菌干腐病的專(zhuān)項(xiàng)調(diào)查，采用五點(diǎn)取樣法抽樣調(diào)查，以株為單位進(jìn)行隨機(jī)抽樣調(diào)查，統(tǒng)計(jì)發(fā)病株數(shù)和總株數(shù)并計(jì)算發(fā)病率，根據(jù)羊肚菌腐爛面積進(jìn)行分級(jí)(表1)，發(fā)病率及病情指數(shù)計(jì)算公式如下。

發(fā)病率=(病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100%

病情指數(shù)=∑[(各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值)]×100

表1 羊肚菌干腐病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 病原菌的分離

1) 組織分離 。在滅菌的1 L PDA培養(yǎng)基中加入30 mg鏈霉素，制成PDA平板。取病害標(biāo)本的病健交界處，先用75%酒精再用0.1%升汞進(jìn)行消毒，最后用無(wú)菌水沖洗3次，滅菌吸水紙吸干組織塊表面的水分，采用五點(diǎn)法將處理過(guò)的組織塊放在備用的PDA培養(yǎng)基平板上，貼好封口膜，3次重復(fù)，25℃條件下倒置培養(yǎng)[8]。待菌絲長(zhǎng)出后，挑取少量菌絲到新的PDA培養(yǎng)基中純培養(yǎng)，然后將純菌落挑入PDA試管斜面中培養(yǎng)3～4 d后，置于4℃冰箱中保存待用。

2) 純化培養(yǎng)。在超凈工作臺(tái)中用接種針輕輕挑取發(fā)病部位的霉?fàn)钗锏絇DA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)。待菌絲長(zhǎng)出后，挑取少量菌絲進(jìn)行2～3次純化，然后將純菌落挑入試管斜面中培養(yǎng)3～4 d后，置于4℃冰箱中保存待用[9-10]。

1.2.3 致病性的測(cè)定 將分離純化保存后的病原菌菌株接在PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)進(jìn)行活化，然后使用1 mm打孔器取得病原菌菌餅，用消毒的手術(shù)刀在健康羊肚菌子實(shí)體表面劃十字切口，將菌餅接種到十字切口位點(diǎn)上，在自然條件下培養(yǎng)，以滅菌的PDA菌餅為空白對(duì)照組，每處理重復(fù)3次，觀察其癥狀表現(xiàn)，待羊肚菌發(fā)病后再將病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，觀察病原菌形態(tài)特征并再次進(jìn)行分子鑒定，以確定與接種菌株的一致性[11]。

1.2.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 在真菌生長(zhǎng)期間觀察菌落形態(tài)特征，培養(yǎng)7 d時(shí)挑取菌落制成臨時(shí)玻片，在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、孢子大小等特征，并進(jìn)行拍照記錄。對(duì)于挑取菌落觀察不符合要求的菌株采用玻片培養(yǎng)檢視法進(jìn)行鑒定，在PDA平板上45°斜插滅菌的蓋玻片，接菌后25℃培養(yǎng)，菌落始產(chǎn)孢時(shí)取出蓋玻片，置于滴有1滴蒸餾水的載玻片上制作成臨時(shí)玻片，顯微鏡下觀察菌絲、孢子等結(jié)構(gòu)并進(jìn)行拍照記錄。

1.2.5 病原菌的分子鑒定 用75%酒精殺菌消毒挑針并于火焰上灼燒，挑取黃豆大小的菌絲置于離心管中，勿挑取培養(yǎng)基，用鑷子夾取蓋緊離心管后放于液氮中，冷凍后取出用研磨棒磨碎。采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原真菌DNA，轉(zhuǎn)錄區(qū)擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1和ITS4，PCR擴(kuò)增體系：2×Taq Master Mix 25 μL，ddH2O 20 μL，ITS11.5 μL，ITS41.5 μL，DNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存[12]。將擴(kuò)增序列送至華大基因公司測(cè)序。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 測(cè)序后的序列與從GenBank下載的序列進(jìn)行比對(duì)。

1) 最大簡(jiǎn)約法。多重比對(duì)由在線MAFFT version 7自動(dòng)進(jìn)行，在BioEdit中手動(dòng)調(diào)整。系統(tǒng)發(fā)育分析方法采用最大簡(jiǎn)約法(MP)分析，并在PAUP4.0中執(zhí)行樹(shù)型構(gòu)建過(guò)程，最后使用FigTree對(duì)樹(shù)進(jìn)行可視化和布局編輯。

2) 最大似然法。利用ClustalX進(jìn)行多重比對(duì)，在BioEdit中手動(dòng)調(diào)整。系統(tǒng)發(fā)育分析方法采用最大似然法(ML)分析，并利用raxmlGUI 2.0-beta執(zhí)行樹(shù)型構(gòu)建過(guò)程，使用FigTree對(duì)樹(shù)進(jìn)行可視化和布局編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌干腐病發(fā)病情況

2.1.1 癥狀 由圖1可見(jiàn)，羊肚菌干腐病通常聚集連片發(fā)生，初期主要在羊肚菌子實(shí)體表面出現(xiàn)白色絲狀物，導(dǎo)致發(fā)病部位凹陷、萎焉，被侵染的子實(shí)體壞死、畸形。

圖1 羊肚菌干腐病癥狀

2.1.2 發(fā)病率及病情指數(shù) 調(diào)查羊肚菌6 734株，其中干腐病發(fā)病株數(shù)為1 650株，發(fā)病率為24.51%。根據(jù)子實(shí)體受害面積進(jìn)行分級(jí)，統(tǒng)計(jì)各級(jí)株數(shù)，以樣地1為例，0級(jí)、1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)和4級(jí)的株數(shù)分別為508株、105株、42株、11株和7株，病情指數(shù)為9.3(表2)；濤源鎮(zhèn)、魯?shù)乩?zhèn)和三川鎮(zhèn)10塊樣地的平均病情指數(shù)分別為22.0、16.2和19.8；永勝縣3個(gè)鎮(zhèn)羊肚菌干腐病的病情指數(shù)平均為19.3。

表2 羊肚菌干腐病病情指數(shù)

2.2 病原菌的分離

從發(fā)病羊肚菌的病健交界處分離到3株菌，編號(hào)為YL1～YL3。由圖2可見(jiàn)，YL1在PDA培養(yǎng)基上菌落正面白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)、絮狀，菌絲光滑、無(wú)色、無(wú)隔；YL2、YL3在PDA培養(yǎng)基上菌落正面白色偏淡黃色、菌落隆起，繁茂，較厚，致密。

圖2 發(fā)病羊肚菌分離菌落的形態(tài)

2.3 病原菌的致病力

YL1、YL2和YL3株對(duì)羊肚菌均有致病力。由圖3可見(jiàn)，發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為2 d后羊肚菌子實(shí)體表面出現(xiàn)白色菌絲，有的出現(xiàn)在菌蓋頂部，感染部位組織停止生長(zhǎng)發(fā)育。7 d后發(fā)病部位凹陷、萎焉，子實(shí)體壞死，畸形。

圖3 病原菌在羊肚菌的致病力

2.4 病原菌的形態(tài)鑒定

YL1在PDA培養(yǎng)基上菌落正面白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)、絮狀，菌絲光滑、無(wú)色、無(wú)隔，菌落背面為淡黃色。分生孢子串生，長(zhǎng)橢圓形(圖4)。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，參照魏景超的《真菌鑒定手冊(cè)》[13]，將YL1初步鑒定為擬青霉屬(Paecilomycessp.)。YL2、YL3在PDA培養(yǎng)基上菌落正面白色偏淡黃色、菌落隆起，繁茂，較厚，致密，菌落背面為淡黃色。分生孢子無(wú)色透明，大型分生孢子鐮刀形，稍彎曲，兩端漸細(xì)，具2～5個(gè)隔膜，大小為(12.5～30.0)μm×(2.5～5)μm。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和文獻(xiàn)[14-15]，將YL2、YL3初步鑒定為鐮孢屬真菌(Fusariumsp.)。

圖4 分離真菌的形態(tài)特征

2.5 病原菌的分子鑒定

以Mariannaeacamptospora序列作為外類(lèi)群，GenBank中的登錄號(hào)為AY624202，基于ITS序列采用最大簡(jiǎn)約法與最大似然法構(gòu)建擬青霉屬(Paecilomyces)和鐮刀菌屬(Fusarium)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可見(jiàn)，YL1、YL2、YL3分別與Paecilomycespenicillatus、Fusariumavenaceum、Fusariumredolens相似度最高(圖5)。因此，YL1鑒定為長(zhǎng)毛擬青霉(P.penicillatus)，YL2鑒定為燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)，YL3鑒定為芬芳鐮刀菌(F.redolens)。

圖5 基于ITS序列采用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

據(jù)報(bào)道，在中國(guó)栽培的梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)上發(fā)生了由變紅鐮刀菌(Fusariumincarnatum)、木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)[16]和長(zhǎng)毛擬青霉(Paecilomycespenicillatus)引起的白霉病[17]。擬青霉屬的長(zhǎng)毛擬青霉常常能引發(fā)羊肚菌發(fā)生白霉病，王耀進(jìn)[18]也通過(guò)形態(tài)學(xué)、分子學(xué)鑒定和科赫氏驗(yàn)證，引起羊肚菌白霉病的病原真菌為擬青霉(Paecilomycespenicillatus)，與研究中導(dǎo)致麗江人工栽培羊肚菌發(fā)病的病原菌結(jié)果一致，均為長(zhǎng)毛擬青霉(Paecilomycespenicillatus)。

鐮刀菌(Fusariumspp.)是一類(lèi)世界性分布的真菌，可在土壤中越冬越夏，還可侵染多種農(nóng)作物，也是一種羊肚菌子囊果病原菌。鐮刀菌對(duì)羊肚菌子囊果初期以危害菌柄為主，后期能侵染菌帽，侵染部位產(chǎn)生白色菌絲物，在22℃以上的高溫高濕天氣，可在短時(shí)間內(nèi)侵染整個(gè)羊肚菌菌株，并具有大面積擴(kuò)散暴發(fā)的危害，最終導(dǎo)致羊肚菌萎蔫、畸形，嚴(yán)重影響其品質(zhì)。鐮刀菌可產(chǎn)生鐮刀菌毒素，因此被鐮刀菌感染的羊肚菌不能再繼續(xù)食用[19]。麗江人工栽培羊肚菌的癥狀表現(xiàn)與上述基本一致，最終導(dǎo)致羊肚菌萎蔫、畸形。羊肚菌的致病菌已被鑒定出有變紅鐮刀菌(F.incarnatum)和木賊鐮刀菌(F.equiseti)。何培新等[20]對(duì)羊肚菌內(nèi)生真菌鑒定中發(fā)現(xiàn)有腐皮鐮刀菌(F.solani)與串珠鐮刀菌(F.moniliforme)。余苗等[21]也認(rèn)為，尖孢鐮刀菌(F.oysporum)和亞洲鐮刀菌(F.asiaticum)可能為羊肚菌鐮刀菌病或霉菌性枯萎病的病原菌。而研究中YL2燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)，YL3芬芳鐮刀菌(F.redolens)均為鐮刀菌屬的真菌，產(chǎn)生的癥狀相同。因此，YL2燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)和YL3芬芳鐮刀菌(F.redolens)是麗江市羊肚菌人工種植基地發(fā)生干腐病病害的病原菌，燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)和芬芳鐮刀菌(F.redolens)與現(xiàn)在已報(bào)道的羊肚菌病原不是同一種，但為鐮刀菌屬，可能是由于地域環(huán)境差異導(dǎo)致不同。

研究確定了麗江市羊肚菌人工種植基地發(fā)生干腐病病害的病原菌有長(zhǎng)毛擬青霉、燕麥鐮刀菌和芬芳鐮刀菌，此3種病原皆為羊肚菌干腐病的病原，感染這些病原后終會(huì)導(dǎo)致羊肚菌萎焉、畸形、壞死，降低了麗江當(dāng)?shù)匮蚨蔷慕?jīng)濟(jì)價(jià)值?，F(xiàn)已知麗江羊肚菌干腐病的病原后，可為之后麗江人工栽培羊肚菌發(fā)生干腐病病害防治提供理論依據(jù)。但目前防治羊肚菌干腐病尚未有高效且無(wú)害的藥劑成果，建議廣大種植羊肚菌的菇農(nóng)們做好相關(guān)的人工防護(hù)措施，如在羊肚菌播種前要對(duì)土壤進(jìn)行處理、避免高溫高濕環(huán)境、選擇以環(huán)境溫度低于20℃為最佳播種時(shí)間、見(jiàn)白就采，在羊肚菌出菇階段發(fā)生真菌病害后，直接將羊肚菌摘除，帶離產(chǎn)區(qū)。

4 結(jié)論

調(diào)查結(jié)果顯示，麗江市永勝地區(qū)3個(gè)鎮(zhèn)30塊人工栽培的羊肚菌干腐病發(fā)生嚴(yán)重，平均干腐病發(fā)病率為24.51%，病情指數(shù)為19.30。羊肚菌作為食用菌，一旦發(fā)病，病害能夠在短時(shí)間內(nèi)迅速大面積爆發(fā)，且通常聚集連片發(fā)生。致病性測(cè)定試驗(yàn)中導(dǎo)致雙孢菇發(fā)病的病原真菌菌株共有3株，病原真菌菌株有YL1、YL2和YL3，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定，YL1鑒定為長(zhǎng)毛擬青霉，YL2鑒定為燕麥鐮刀菌，YL3鑒定為芬芳鐮刀菌。