劉琳營 蘇曉俊 閔玲

摘要：長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，簡稱lncRNA），通常定義為長度超過200 nt的非編碼RNA，是幾乎不具有編碼能力或具有弱編碼能力的RNA轉(zhuǎn)錄本。早期的研究質(zhì)疑lncRNA的重要性，因?yàn)榕cmRNA相比，lncRNA具有低表達(dá)和低序列保守性的特點(diǎn)，認(rèn)為它是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，故將其存在歸因于轉(zhuǎn)錄噪聲。近年來，隨著對(duì)非編碼RNA的深入研究，lncRNA獨(dú)特的生物學(xué)特性和功能被陸續(xù)鑒定，多數(shù)研究學(xué)者認(rèn)為lncRNA是一種在生物體中普遍存在且參與基因調(diào)控的重要組分。本文主要對(duì)植物中發(fā)現(xiàn)的lncRNA的種類、發(fā)揮功能的分子機(jī)制、參與的生物學(xué)過程及研究策略等進(jìn)行綜述，為在植物領(lǐng)域進(jìn)一步研究lncRNA提供依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA;植物;功能;分子機(jī)制;研究策略

中圖分類號(hào)： S184文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）12-0012-08

收稿日期：2020-11-07

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2016YFD0101402）。

作者簡介：劉琳營（1994—），女，山東濟(jì)寧人，碩士研究生，研究方向?yàn)閘ncRNA與棉花花藥發(fā)育及高溫響應(yīng)。E-mail：linyingliu_257@webmail.hazu.edu.cn。

通信作者：閔 玲，博士，副教授，主要從事棉花生殖發(fā)育、環(huán)境與生殖發(fā)育互作研究。E-mail：lingmin@mail.hazu.cn。

近年來，生物技術(shù)的快速發(fā)展使研究者證實(shí)真核生物的基因組中并非全部序列都可以編碼蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)是非編碼序列 [1]。在以往對(duì)于非編碼RNA的研究中，備受重視的是一系列短鏈非編碼RNA，如siRNA、miRNA、snRNA等，自1991年科學(xué)家證實(shí)Xist參與X染色體失活的調(diào)控后[2]，不斷有研究表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，簡稱lncRNA）在調(diào)控真核生物的生命活動(dòng)中具有重要的作用。

大多數(shù)的lncRNA與mRNA一樣，能夠被RNA Pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄，具有5′端帽子、3′端poly（A）尾以及選擇性剪接位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[3-4]，一些lncRNA可被RNA Pol Ⅲ轉(zhuǎn)錄，植物中也有少數(shù)lncRNA是由植物特異性RNA Pol Ⅳ和Ⅴ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的[5-7]。一般來說，真核生物編碼蛋白質(zhì)的序列相對(duì)保守，同源性很高，而lncRNA是一類在不同物種中具有低序列保守性的轉(zhuǎn)錄本，由此推測(cè)，個(gè)體和物種間存在差異的原因可能是由于非編碼序列差異導(dǎo)致[8-9]。隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表達(dá)譜分析技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的研究表明lncRNA在真核生物的生長發(fā)育過程中扮演著十分重要的角色[10]。相比于動(dòng)物中l(wèi)ncRNA的研究，植物lncRNA的探索仍處于初級(jí)階段，研究主要集中在擬南芥、蒺藜苜蓿、番茄和水稻等植物中（表1）。本文主要對(duì)植物lncRNA的分類、分子機(jī)制研究進(jìn)行綜述，總結(jié)了lncRNA參與植物生長發(fā)育和逆境脅迫中的重要調(diào)控機(jī)制，并對(duì)植物中l(wèi)ncRNA的研究策略進(jìn)行概述，為深入研究植物中l(wèi)ncRNA的功能和分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 lncRNA的來源和種類

1.1 lncRNA的來源

在真核生物中，編碼蛋白質(zhì)的基因幾乎是通過部分或整體復(fù)制以及隨后的序列分化而產(chǎn)生的，由于大多數(shù)非編碼RNA受到較低程度的進(jìn)化限制，所以只有很少一部分在不同物種之間表現(xiàn)出序列保守性，因此研究者推測(cè)lncRNA可能來自以下幾種途徑：（1）閱讀框插入蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子之間，插入的閱讀框與先前的編碼序列重新整合形成功能性lncRNA;（2）染色體重排，將2個(gè)分開的非轉(zhuǎn)錄區(qū)連接在一起而產(chǎn)生有多外顯子的lncRNA;（3）非編碼基因進(jìn)行逆轉(zhuǎn)座復(fù)制形成功能性逆基因或非功能性假基因;（4）局部重復(fù)序列串聯(lián)產(chǎn)生相鄰重復(fù)的lncRNA;（5）轉(zhuǎn)座因子插入產(chǎn)生功能性lncRNA[11]。

1.2 lncRNA的種類

1.2.1 基于所在基因組位置進(jìn)行分類

根據(jù)lncRNA在基因組中與蛋白編碼基因的相對(duì)位置，可將其分為正義lncRNA（sense long non-coding RNA）、反義lncRNA（antisense long non-coding RNA）、雙向lncRNA（bidirectional long non-coding RNA）、基因內(nèi)lncRNA（intronic long non-coding RNA）、基因間lncRNA（intergenic long non-coding RNA）5類，其中基因間lncRNA也被稱為大型介入性非編碼RNA，即lincRNA（large intervening noncoding RNA）[30-31]。

1.2.2 基于分子機(jī)制進(jìn)行分類

大多數(shù)lncRNA具有功能，前期研究者發(fā)現(xiàn)lncRNA可按分子功能進(jìn)行以下分類[32-33]。

信號(hào)分子：lncRNA可作為信號(hào)分子調(diào)控鄰近基因表達(dá)。例如在雌性動(dòng)物發(fā)育過程中，Xist誘導(dǎo)X染色體的失活，該lncRNA在一條X染色體上表達(dá)會(huì)導(dǎo)致整個(gè)染色體沉默[34]。而在植物發(fā)育調(diào)控中，DOG1（delay of germination 1）基因調(diào)控?cái)M南芥種子休眠，as-DOG1（antisense delay of germination 1） lncRNA會(huì)抑制DOG1基因的表達(dá)，打破種子休眠[11]。

誘餌分子：lncRNA可以作為誘餌，通過招募RNA結(jié)合蛋白（RNA binging protein，簡稱RBP），例如：轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)修飾物或者其他調(diào)控因子間接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)[32]。此外，lncRNA作為誘餌可以結(jié)合miRNAs，阻斷miRNAs與其特異性的靶基因互作，這個(gè)過程被稱為內(nèi)源模擬靶標(biāo)（endogenous target mimicry，簡稱eTM）[33]。在擬南芥中，miR399及其靶基因PHO2（PHOSPHATE 2，編碼泛素結(jié)合酶相關(guān)蛋白的基因）在維持磷酸鹽穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用[35]。lncRNA IPS1（INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION1）和At4都會(huì)競爭性地與miR399結(jié)合，導(dǎo)致PHO2上調(diào)表達(dá) [12-13，24]。

引導(dǎo)分子：lncRNA可以引導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白復(fù)合體定位到特定位置或招募染色質(zhì)修飾酶到靶基因，順式（cis）或反式（trans）作用于靶基因[32]。例如，在蒺藜苜蓿中發(fā)現(xiàn)lncRNA Enod40可直接與根瘤中的MtRBP1（medicago truncatula RNA binding protein 1）蛋白結(jié)合，將MtRBP1從植物細(xì)胞的核斑點(diǎn)重新定位到細(xì)胞質(zhì)顆粒中發(fā)揮重要的作用[14]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)lncRNA COLDAIR與植物PRC2（polycomb repressive complex 2）蛋白復(fù)合體中的亞基CLF（CURLY LEAF）特異結(jié)合，指導(dǎo)PRC2復(fù)合體到達(dá)FLC（FLOWERING LOCUS C）位點(diǎn)，PRC2通過組蛋白H3K27甲基化改變FLC位點(diǎn)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而抑制FLC的表達(dá)，調(diào)控開花時(shí)間[15-16]，這一過程中COLDAIR作為引導(dǎo)分子進(jìn)行反式調(diào)節(jié)。最近研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MAS可以與COMPASS-like復(fù)合物中的WDR5a（WD40-REPEAT 5a）結(jié)合并將其引導(dǎo)到MAF4（MADS AFFECTING FLOWERING4）位點(diǎn)，從而促進(jìn)H3K4的甲基轉(zhuǎn)移酶活性并激活MAF4的表達(dá)，進(jìn)而微調(diào)開花時(shí)間[17]。

支架分子：lncRNA可以作為支架分子行使分子功能。以往有研究認(rèn)為很多復(fù)合物都是用蛋白質(zhì)作為支架[36]。但近年來研究表明，lncRNA有多種不同的結(jié)合功能域，可以與不同的蛋白復(fù)合體或效應(yīng)分子結(jié)合，這對(duì)復(fù)雜的生物信息傳遞、分子間的相互作用以及對(duì)信號(hào)本身特異性的精準(zhǔn)調(diào)控非常重要[37-38]。植物中特有的Pol V可以產(chǎn)生siRNA和相關(guān)蛋白，識(shí)別其靶基因所需的支架轉(zhuǎn)錄本，通過RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RNA directed DNA methylation，簡稱RdDM）途經(jīng)進(jìn)行染色質(zhì)修飾[39]。RdDM途經(jīng)主要依賴2種核心蛋白DICER-LIKE 3（DCL3）和ARGONAUTE 4（AGO4），前者切割長雙鏈RNA產(chǎn)生小干擾RNAs（small interfering RNAs，簡稱siRNAs），這些siRNAs與AGO蛋白結(jié)合，形成AGO-siRNAs復(fù)合物，Pol V產(chǎn)生的lncRNA作為支架將AGO-siRNAs復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到染色質(zhì)的目標(biāo)位點(diǎn)[40-42]。例如，lincRNA APOLO（AUXIN REGULATED PROMOTER LOOP RNA）作為支架RNA參與染色質(zhì)環(huán)的形成[18]。

lncRNA除以上4種分子機(jī)制，還是小RNA（siRNA和miRNA）生物合成的前體，如植物中特有的Pol Ⅳ產(chǎn)生的lncRNA，可以由DCL蛋白切割產(chǎn)生siRNA[43];也可能是miRNA的靶標(biāo)，如miRNA可通過靶向切割lncRNA生成phasiRNA的方式參與植物對(duì)長日照脅迫的響應(yīng)[44]。由于lncRNA在植物中的研究尚處于早期階段，導(dǎo)致植物中缺乏系統(tǒng)和一致的lncRNA調(diào)控機(jī)制，隨著研究的不斷深入，對(duì)lncRNA的分子功能劃分將更加完善。

2 lncRNA在植物中參與的生物學(xué)過程

2.1 lncRNA參與植物生長發(fā)育

對(duì)lncRNA參與植物生長發(fā)育的研究主要集中在生長素運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面。lncRNA ENOD40和lnc351被稱為ASCO-RNA（alternative splicing competitor RNA），可以與核斑RNA結(jié)合蛋白（nuclear speckle RNA-binding proteins，簡稱NSRs）相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因選擇性剪切。在擬南芥中ASCO-RNA能與mRNA競爭性結(jié)合NSRs，干擾下游生長素應(yīng)答基因的選擇性剪接，進(jìn)而影響側(cè)根的生長[45]。此外，ENOD40能參與調(diào)節(jié)細(xì)菌或真菌與豆科植物的共生關(guān)系，在共生相互作用中，根瘤菌迅速誘導(dǎo)根瘤菌原基中ENOD40的表達(dá)。雖然潛在的分子機(jī)制尚不清楚，但ENOD40可以在運(yùn)輸非共生植物細(xì)胞生長所必需的代謝物方面發(fā)揮作用[46-47]。最近研究表明，生長素調(diào)控啟動(dòng)子環(huán)APOLO（auxin egulated promoter loop）可以動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)下游基因PID（PINOID）啟動(dòng)子的環(huán)化過程，從而影響PID啟動(dòng)子的活性。PID是植物生長素極性轉(zhuǎn)運(yùn)的重要調(diào)節(jié)因子，生長素激活RDD（ROS1、DML2、DML3）介導(dǎo)的DNA去甲基化，促進(jìn)覆蓋PID啟動(dòng)子區(qū)域的環(huán)打開[18，48]。HID1（HIDDEN TREASURE 1）是長度為236 nt的lncRNA，在擬南芥中，HID1受持續(xù)紅光調(diào)控，抑制了光敏色素互作因子PIF3（phytochrome-interacting factor 3）的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)了幼苗的光形態(tài)發(fā)生[49]。在水稻中，LAIR（LRK antisense inetrgenic RNA）是由鄰近基因LRK（leucine-rich repeat receptor kinase）的反義鏈轉(zhuǎn)錄而來，LAIR可以結(jié)合染色質(zhì)修飾蛋白OsMOF和OsWDR5，并共同定位于LRK1基因組位點(diǎn)，從而激活LRK1轉(zhuǎn)錄，提高水稻產(chǎn)量[19]。此外，在水稻中發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)lncRNA TL（TWISTED LEAF）可以通過調(diào)控R2R3-MYB基因的表達(dá)，維持水稻葉片的平展度[20]。

2.2 lncRNA參與植物的開花調(diào)控及生殖發(fā)育

有大量研究報(bào)道，在植物生殖發(fā)育過程中，lncRNA也起到了非常重要的調(diào)控作用。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)lncRNA COLDAIR可以調(diào)控FLC（FLOWERING LOCUS）染色質(zhì)區(qū)域的組蛋白甲基化，COLDAIR由FLC的第1個(gè)內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄而來，春化期間可以與多梳組蛋白復(fù)合體PRC2（Polycomb Repressive Complex 2）中的CLF（CURLY LEAF）直接相互作用，指導(dǎo)PRC2復(fù)合體到FLC基因位點(diǎn)，PRC2具有H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，通過使H3K27me3富集來抑制FLC基因表達(dá)，促進(jìn)擬南芥正常開花[15，50-51]。近年來，有研究者在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)天然反義轉(zhuǎn)錄長鏈非編碼RNA（natural antisense transcript-lncRNAs，簡稱NAT-lncRNAs），命名為MAS（one NAT-lncRNA，NAT-lncRNA_2962），可結(jié)合組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的關(guān)鍵組分WDR5a（WD40 containing repeat 5a），將其招募到MAF4（MADS AFFECTING FLOWERING4）的基因位點(diǎn)，增強(qiáng)H3K4me3并激活MAF4的表達(dá)[17]，從而調(diào)控?cái)M南芥的開花時(shí)間。

除了調(diào)節(jié)植物開花，lncRNA也會(huì)影響花粉發(fā)育過程。與水稻光敏雄性不育相關(guān)的lncRNA被稱為長日照特異性雄性不育相關(guān)RNA（long-day-specific male-fertility-associated RNA，簡稱LDMAR），在長日照環(huán)境下，花粉正常發(fā)育需要LDMAR的表達(dá)，而突變產(chǎn)生的單核苷酸多態(tài)性（SNP）改變了LDMAR 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致LDMAR的啟動(dòng)子區(qū)域中甲基化作用增強(qiáng)，降低了LDMAR的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致發(fā)育中的花粉過早發(fā)生細(xì)胞程序性死亡，這是造成水稻光敏不育系敗育的重要原因[21]。在大白菜中，研究人員基于花粉特異性克隆了一個(gè)全長828 bp的cDNA，命名為BcMF11（Brassica campestris male fertility gene 11），是一種全新的非編碼RNA，其沒有明顯的開放閱讀框或編碼能力，當(dāng)BcMF11的表達(dá)降低時(shí)會(huì)產(chǎn)生花藥絨氈層降解推遲、小孢子分離不同步、花粉粒發(fā)育中斷等異常現(xiàn)象[22-23]，最終導(dǎo)致花粉粒不正常發(fā)育，出現(xiàn)敗育表型。

隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的快速發(fā)展，在很多物種中鑒定出與生殖發(fā)育有關(guān)的lncRNA。有研究表明，在蕪菁的花粉發(fā)育過程中，lncRNA可以作為內(nèi)源模擬靶標(biāo)調(diào)節(jié)miRNA的功能，其中bra-eTM160-1和 bra-eTM160-2這2個(gè)lncRNAs預(yù)測(cè)是bra-miR160-5p的eTM，研究證實(shí)轉(zhuǎn)基因植株的花器官形狀雖然正常，但花藥中有一半的花粉粒具有小且皺縮、無活力、沒有細(xì)胞核或花粉內(nèi)壁缺失的敗育表型[24]。在水稻中，同源四倍體水稻在遺傳進(jìn)化方面比二倍體水稻具有更大的優(yōu)勢(shì)，但常伴有育性低及種子結(jié)實(shí)不良等特點(diǎn)，研究人員利用高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)座因子和減數(shù)分裂調(diào)控靶點(diǎn)相關(guān)的lncRNA可能是花粉和胚囊發(fā)育的內(nèi)源調(diào)控因子，其差異表達(dá)導(dǎo)致同源四倍體水稻的育性降低[52]。在棉花中，研究人員對(duì)棉花的RNA-seq數(shù)據(jù)分析表明，在花藥組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的lncRNA較其他組織多，共鑒定到3 925個(gè)在花藥中高表達(dá)的lincRNAs[53]。為了進(jìn)一步研究lncRNA在棉花花藥中的作用，Zhang等對(duì)三系雜交棉（胞質(zhì)不育系、保持系、恢復(fù)系）的花藥發(fā)育過程進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共鑒定到80 695個(gè)參與胞質(zhì)雄性不育和生育力恢復(fù)的候選lncRNAs，隨后分別對(duì)不育系-保持系和不育系-恢復(fù)系差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行GO分析，分析結(jié)果顯示不育系-保持系在細(xì)胞激素代謝過程和氧化還原反應(yīng)過程中存在明顯差異，而不育系-恢復(fù)系的差異主要在于棉花育性恢復(fù)過程中調(diào)控細(xì)胞形態(tài)形成的功能基因[54]。研究人員對(duì)不育系-保持系的花粉母細(xì)胞時(shí)期、四分體時(shí)期和小孢子時(shí)期的差異lncRNAs和mRNAs分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，這些差異lncRNAs和mRNAs可能參與了絨氈層細(xì)胞降解、小孢子發(fā)育、花粉發(fā)育以及棉花花藥細(xì)胞壁的分化、增殖和凋亡等生殖發(fā)育過程，進(jìn)一步的GO和KEGG分析顯示它們分別參與植物氧化磷酸化、類黃酮生物合成、戊糖和葡萄糖酸相互轉(zhuǎn)化、脂肪酸生物合成和MAPK信號(hào)通路，由于代謝途經(jīng)異常導(dǎo)致花藥敗育，最終造成雄性不育[55]。

2.3 lncRNA參與植物的逆境脅迫響應(yīng)

植物在生長過程中往往會(huì)經(jīng)歷高溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫及細(xì)菌、真菌、病毒等生物脅迫。由于植物的固著生長，只能通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)及代謝物的改變來應(yīng)對(duì)不斷變化的環(huán)境條件，其中l(wèi)ncRNA在植物響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮重要的角色。lncRNA DRIR（drought induced RNA）在干旱、鹽脅迫和脫落酸處理后被激活，調(diào)控植物中ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、水運(yùn)輸?shù)软憫?yīng)非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)[25]。此外，Li等對(duì)水稻進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組鏈特異性測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)lncRNA可以參與短期干旱“記憶”反應(yīng)[56]。近年來，有研究對(duì)耐旱甘藍(lán)型油菜及敏旱甘藍(lán)型油菜在干旱和復(fù)水條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，構(gòu)建了lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而篩選出了在干旱中參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的lncRNA，并且驗(yàn)證了這些lncRNA在油菜中可以正調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而對(duì)干旱脅迫作出響應(yīng)[57]。在低磷脅迫下，擬南芥中的lncRNA IPS1（induced by phosphate starvation1）和玉米中的lncRNA PILNCR1（Pi-deficiency-induced long-noncoding RNA1）都可以模擬miR399的靶標(biāo)，競爭性地與miR399結(jié)合，從而增加miR399靶標(biāo)基因PHO2的表達(dá)，維持植株在低磷脅迫下的正常生長[12，58]。在蒺藜苜蓿中，lncRNA PDIL1（Phosphate Deficiency-Induced lncRNA 1）作為miR399的模擬靶標(biāo)競爭性地抑制MtPHO2轉(zhuǎn)錄本，MtPHO2通過泛素化途經(jīng)參與Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的降解[26]，表明PDIL1通過間接控制MtPHO2對(duì)Pi的轉(zhuǎn)運(yùn)來保持植物體中相對(duì)穩(wěn)定的磷濃度。

此外，lncRNA在植物響應(yīng)生物脅迫的過程中也具有關(guān)鍵調(diào)控作用。在擬南芥中，RNA Pol Ⅲ轉(zhuǎn)錄的lncRNA AtR8在擬南芥根中特異性表達(dá)，對(duì)野生型和atr8突變體的微陣列分析表明AtR8與防御反應(yīng)存在較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，在擬南芥處于發(fā)育早期、低水楊酸條件或感染紫丁香假單胞菌時(shí)，AtR8的積累與2個(gè)WRKY基因（WRKY53/WRKY70）的積累呈負(fù)相關(guān)，由NPR1（nonexpressor of pathogenesis-related gene 1）協(xié)同調(diào)控植物的防御反應(yīng)及根系伸長[27，59]。在番茄中，lncRNA33732沉默會(huì)導(dǎo)致RBOH基因的表達(dá)降低，減少H2O2的含量，導(dǎo)致番茄對(duì)番茄疫霉根腐病的敏感性增強(qiáng)，而番茄lncRNA16397可激活SlGRX表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量積累，使細(xì)胞膜不易損傷，從而增強(qiáng)番茄對(duì)致病疫霉的抗性[28-29]。同時(shí)，番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，簡稱TYLCV）也是番茄作物的毀滅性病害，對(duì)番茄的生產(chǎn)具有重要威脅，最新的研究發(fā)現(xiàn)易感番茄的lncRNA SILNR1可與TYLCV的小干擾RNA （small-interfering RNAs，簡稱siRNAs）互作，為TYLCV誘導(dǎo)疾病及宿主抗病毒免疫提供了合理的模型[60]。在棉花中，lncRNAs Ghlnc NAT-ANX 2（L2）和Ghlnc NAT-RLP 7（L3）在棉花對(duì)黃萎病菌和灰霉病菌的抗性中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)L2和L3進(jìn)行沉默后會(huì)上調(diào)其鄰近蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)棉花的抗病性[61]。

3 植物中l(wèi)ncRNA的研究策略

在真核基因組中非編碼序列雖沒有蛋白質(zhì)編碼能力，但在調(diào)控個(gè)體的生命過程中扮演著重要的角色，目前對(duì)非編碼RNA研究占主導(dǎo)地位的是長度小于200 nt的小RNA（如microRNAs、siRNA、與Piwi蛋白互作的piRNA），其分類和功能機(jī)制研究的較為透徹[62]。由于lncRNA在不同物種間具有保守性差、易降解、表達(dá)豐度低等特點(diǎn)[5]，早期沒有引起研究者的重視，隨著現(xiàn)代生物測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，更多的lncRNA被鑒定出來，成為科研領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

目前對(duì)lncRNA的研究一般集中在動(dòng)物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，研究的基本策略主要分為：（1）lncRNA的篩選與鑒定。隨著鏈特異性建庫的廣泛應(yīng)用，lncRNA預(yù)測(cè)算法的不斷發(fā)展，在擬南芥[17，63]、桑樹[64]、甘藍(lán)[65]和棉花[54-55]等植物中篩選和鑒定了大量潛在的lncRNAs。近年來，以單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的第三代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，可實(shí)現(xiàn)RNA的直接測(cè)序以及RNA上修飾的檢測(cè)[66]，從擬南芥[67]、水稻[68]、澳洲棉[69]等物種中鑒定了大量lncRNAs。（2）lncRNA的表達(dá)和定位。通過高通量測(cè)序篩選的lncRNA需要運(yùn)用成熟的技術(shù)驗(yàn)證其表達(dá)水平及定位，包括Northern印記、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、RNA熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，簡稱FISH）和瞬時(shí)表達(dá)等。（3）lncRNA的功能和機(jī)制研究。通過高效穩(wěn)定的植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以進(jìn)一步揭示候選lncRNA的生物學(xué)功能。基本策略主要包含功能獲得性研究和功能缺失性研究。功能獲得性研究主要是通過導(dǎo)入過表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)，功能缺失性研究主要采用CRISPR/Cas9基因敲除和RNAi干涉等方法進(jìn)行研究。在水稻中，通過對(duì)病原體敏感的lncRNA轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ALEX1可以激活茉莉酸途經(jīng)和對(duì)白葉枯病的抗性[70];在番茄中，利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)獲得lncRNA1459缺失突變體，其果實(shí)表現(xiàn)出明顯的成熟延遲[71];在番茄中超表達(dá)和干涉lncRNA33732可以影響番茄對(duì)致病疫霉的抗性[29]。此外，lncRNA與蛋白質(zhì)的互作研究常用RNA-pull down技術(shù)、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，簡稱RIP）、RNA純化的染色質(zhì)分離（chromatin isolation by RNA purification，簡稱ChIRP）、目標(biāo)RNA的捕捉雜交分析（capture hybridization analysis of RNA targets，簡稱CHART）和交聯(lián)免疫沉淀（crosslinking-immunopurification，簡稱CLIP）。因此依據(jù)前人研究結(jié)果，總結(jié)出在植物中可以實(shí)現(xiàn)的lncRNA的研究策略（圖1）。

4 展望

隨著高通量測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)，研究顯示，lncRNA并不是之前所認(rèn)識(shí)的“垃圾序列”，而是可以在各種層面上調(diào)控基因的表達(dá)，如表觀遺傳[15，17，72]、轉(zhuǎn)錄調(diào)控[73-74]及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[12，43，75]。雖然目前對(duì)lncRNA的研究取得了一些成果，但研究者所面臨的問題仍然很多，如：許多l(xiāng)ncRNA的生物學(xué)功能未得到闡明;判斷非編碼轉(zhuǎn)錄物是否有功能依然困難;lncRNA作用機(jī)制復(fù)雜多樣，不同的lncRNA研究結(jié)果之間的借鑒意義不高。面對(duì)這些問題，可以從新的技術(shù)策略和思路入手：（1）納米孔測(cè)序技術(shù)可以直接對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序，并可擴(kuò)展到lncRNA的全長繪制[67]。（2）單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和表觀基因組的同時(shí)分析可以建立lncRNA與染色質(zhì)之間的功能聯(lián)系[76]。（3）對(duì)已獲得的差異lncRNAs實(shí)行靶基因預(yù)測(cè)、與差異mRNA的共表達(dá)分析及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)。（4）CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可應(yīng)用在多種植物基因工程中，雖然目前CRISPR基因編輯技術(shù)

發(fā)展較快，且編輯精度日益提高，為研究重要的植物生長和發(fā)育特征提供了有力的支持，但對(duì)lncRNA的編輯則需要更特異的sgRNA靶標(biāo)來確保敲除全長。隨著研究技術(shù)的逐漸成熟，研究領(lǐng)域的逐漸深入，相信對(duì)植物中l(wèi)ncRNA功能的挖掘和調(diào)控機(jī)制的了解會(huì)更加透徹，對(duì)探索其在植物生命活動(dòng)及發(fā)育過程中的作用具有十分重要的意義。

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