謝久鳳 秦章元 張寒蕾 閆睢豪 郭陽陽 楊亞昕 李海霞

摘要：選取14種園林植物的葉片和花瓣作為試驗材料，通過離體方法對大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行揮發(fā)性成分抑制效果分析。結(jié)果表明，不同物種之間的抑菌效果差異顯著。碧桃葉片、花瓣對4種供試菌的抑制率幾乎均達(dá)到了100%，櫻花、紫玉蘭、金鐘、紫丁香和貼梗海棠對4種供試菌也有很好的抑制作用;草本植物葉片、花瓣對4種供試菌的抑制效果明顯低于木本植物，長壽花、菊花葉片、花瓣對金黃色葡萄球菌均無抑制作用，鳳仙花葉片對枯草芽孢桿菌的抑制率最高為75.6%。此外，供試植物葉片的抑菌率普遍高于其花瓣，其中西府海棠葉片對傷寒沙門氏菌的抑制率是其花瓣的65倍，而草本植物葉片與花瓣抑菌率的差異沒有木本植物明顯，但也存在一定差異，如長壽花、菊花葉片與花瓣對傷寒沙門氏菌的抑制率相差10.8倍。對抑菌率達(dá)100%的木本植物進(jìn)行最大抑菌強度試驗，結(jié)果表明，紫玉蘭葉片的抑菌強度最高，達(dá)到7.156×106CFU/（mL·cm2）。研究結(jié)果為優(yōu)選園林植物美化和凈化室內(nèi)外環(huán)境提供了依據(jù)，同時也為進(jìn)一步探討園林植物抗菌活性成分提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：園林植物;葉片;花瓣;揮發(fā)性物質(zhì);抑菌強度

中圖分類號：S184 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）12-0100-05

收稿日期：2020-10-21

基金項目：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)工程項目（編號：KF201913）。

作者簡介：謝久鳳（1983—），女，遼寧阜新人，碩士，實驗師，主要從事微生物學(xué)與植物學(xué)研究。E-mail：xiejiufeng@henau.edu.cn。

通信作者：李海霞，碩士，實驗師，主要從事植物生理生化研究和實驗教學(xué)與管理工作。E-mail：lihaixia@henau.edu.cn。

園林植物是生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級生產(chǎn)者，是維持生態(tài)系統(tǒng)平衡的天然寶庫，也是提取生物活性物質(zhì)的最佳材料。同時，園林植物也為人們提供良好的戶外及室內(nèi)景觀。如果在發(fā)揮園林植物景觀美化作用的同時，還能夠使其莖葉等組織分泌物達(dá)到清除空氣致病菌、提高空氣質(zhì)量的效能，那么園林植物將顯示出更高的開發(fā)利用價值[1]。李濤等研究了宿根花卉葉片揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)6種植物對供試微生物都有不同程度的抑制作用[2];張國帥等研究了5種常綠園林樹種葉片揮發(fā)性物質(zhì)對真菌、細(xì)菌的抑制能力，發(fā)現(xiàn)供試樹種葉片都有一定的抑菌活性，而且不同樹種之間的抑菌率有明顯差異[3]。沈鑫等選取華南地區(qū)22種常見園林植物，采用水蒸氣蒸餾法提取葉片中的揮發(fā)油進(jìn)行抑菌試驗，結(jié)果表明，不同植物之間的抑菌效果差異顯著，香樟精油產(chǎn)生的抑菌圈最大，直徑為22.5 mm，黃蘭最小，為5.56 mm[4]。馬海旭等比較興安落葉松、銀中楊2種園林植物葉片水提液、醇提液和鮮汁液對5種菌種的抑制能力，同時進(jìn)行最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，簡稱MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，簡稱MBC）的測定，發(fā)現(xiàn)不同植物葉片的不同處理方式對不同種類微生物的抑制作用存在差異[5]。

目前，國內(nèi)研究者對園林植物抑菌試驗的研究基本都是基于葉片，而植物花瓣的抑菌能力尚不清楚，關(guān)于園林植物抑菌強度的試驗也未見報道。本試驗選取我國北方常見的9種園林木本植物和5種草本植物進(jìn)行葉片、花瓣抑菌試驗的比較研究，同時對抑菌能力強的植物葉片、花瓣進(jìn)行抑菌強度測定。本研究對園林植物葉片、花瓣抑菌能力差異的探究，可以更好地闡明園林植物的抑菌作用和生態(tài)價值，為合理配置良好的人居植物景觀類型提供理論依據(jù)[6-7]。

1 材料與方法

1.1 供試植物

本研究選取我國北方地區(qū)廣泛應(yīng)用于城市園林綠化的9種木本植物及室內(nèi)景觀價值較高的5種草本植物。9種木本植物分別為紫荊（Bauhinia blakeana Dunn.）、榆葉梅（Amygdalus triloba）、西府海棠（Malus micromalus）、金鐘（Forsythia viridissima Lindl.）、紫丁香（Syringa oblata Lindl.）、貼梗海棠（Chaenomeles speciosa）、碧桃（Prunuspersica Batsch.var.duplex Rehd.）、櫻花（Prunus serrulata）和紫玉蘭（Magnolia denudata Desr.），均于4月中旬采集于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)文化路校區(qū)。草本植物分別為瓜葉菊（Pericallis hybrida）、長壽花（Kalanchoe blossfeldiana Poelln.）、菊花（Dendranthema morifolium）、鳳仙花（Impatiens balsamina）和矮牽牛（Petunia integrifolia），均采購于河南省鄭州市陳寨花卉市場。

1.2 試驗菌種

選擇具有致病性的3種細(xì)菌及1種常見的芽孢桿菌作為供試菌種，分別為大腸桿菌（Escherichia coli ）、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.3 菌懸液的制備

按照常規(guī)方法配制牛肉膏蛋白胨固體和液體培養(yǎng)基，其中牛肉粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，pH值7.2～7.4（固體培養(yǎng)基加20 g瓊脂粉，液體培養(yǎng)基不加），于121 ℃下滅菌30 min備用。用接種環(huán)挑取分離純化好的菌種接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，于37 ℃、100 r/min下培養(yǎng)12 h，制成菌懸液。用10倍稀釋法稀釋菌懸液，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果選取適宜的濃度作為試驗菌懸液。

1.4 葉片和花瓣處理

采集健康、完整的植物葉片和花瓣，用自來水清洗3次以除去表面的灰塵與異物，再用無菌水清洗3次，最后用75%乙醇浸泡10 s消毒，取出后平鋪在無菌吸水紙上，吸干水分后放入超凈工作臺內(nèi)，正反面分別紫外照射20 min。

1.5 抑菌試驗

在無菌環(huán)境下，將活化好的菌種用接種環(huán)接入液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、100 r/min搖床內(nèi)培養(yǎng) 12 h，用無菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋至適宜濃度，用移液槍吸取0.1 mL稀釋好的菌液，加入準(zhǔn)備好的固體平板上，用三角涂布棒均勻涂布、倒置，靜置 20 min 后備用。

稱取1.0 g葉片，加入液氮，用研缽快速研磨成粉末，將粉末全部移入皿蓋中均勻分散，蓋上皿底，用封口膜封口，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每種葉片設(shè)3個重復(fù)，對照組不加葉片，花瓣的試驗過程同葉片。大腸桿菌、傷寒沙門氏菌和枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24 h，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)48 h，觀察平板上細(xì)菌的生長情況并計算菌落數(shù)，與對照組進(jìn)行比較，用以下公式計算抑菌率：

抑菌率=（對照組菌落數(shù)-處理組菌落數(shù)）/對照組菌落數(shù)×100%。

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析。

1.6 最大抑菌強度試驗

選取試驗中對細(xì)菌抑制率為100%的木本植物葉片和花瓣，處理方式同“1.4.1”節(jié)。用無菌水對菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-6，吸取0.1 mL各梯度菌液并涂布在牛肉膏蛋白胨平皿上，稱取1.0 g供試植物葉片或花瓣，粉碎研磨，均勻加入皿蓋中，蓋上涂過菌液的皿底，用封口膜封嚴(yán)，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h或48 h，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，試驗所用平皿的直徑為9 cm，面積為63.585 cm2，將平皿上完全不長菌落的濃度設(shè)為葉片或花瓣的最大抑菌濃度，由此計算單位面積內(nèi)受抑制的最大菌落數(shù)，即為最大抑菌強度（maximum bacteriostatic strength，簡稱MAS），計算公式：最大抑菌強度[CFU/（mL·cm2）]=最大抑菌濃度（CFU/mL）/平板面積（cm2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 木本植物對供試菌種的抑制作用

分別取9種木本植物的新鮮葉片和花瓣各1 g，將其研磨成粉末，均勻鋪在皿蓋上，將事先涂過供試菌的皿底倒扣在皿蓋上，密封后于37 ℃培養(yǎng)24 h或48 h進(jìn)行抑菌率的測定。如表1所示，木本植物的葉片、花瓣對4種細(xì)菌有不同程度的抑制作用，且差異較大，抑制率為0～100%。碧桃葉片、花瓣對4種菌的抑制效果最突出，基本實現(xiàn)了完全抑制;櫻花、紫玉蘭的葉片、花瓣也有很好的效果，其中櫻花葉片對大腸桿菌、傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等3種致病菌完全實現(xiàn)了抑制，花瓣能完全抑制金黃色葡萄球菌，紫玉蘭葉片對傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌實現(xiàn)了完全抑制，花瓣的抑菌能力較差;金鐘、貼梗海棠葉片對枯草芽孢桿菌完全實現(xiàn)了抑制，紫丁香葉片對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌完全實現(xiàn)了抑制。總體看來，木本植物葉片的抑菌能力普遍高于其花瓣。

2.2 草本植物對供試菌種的抑制作用

采用上述同樣的方法，對5種草本植物的葉片、花瓣進(jìn)行抑菌率的測定。由表2可以看出，草本植物的抑菌能力普遍低于木本植物，草本植物對金黃色葡萄球菌的抑制率較低，長壽花、菊花葉片、花瓣的抑菌率均為0，對傷寒沙門氏菌的抑制率為3.0%～76.0%;其中對大腸桿菌的抑制效果最不明顯，5種植物中對大腸桿菌抑制性最強的是長壽花葉片，其抑菌率只有29.9%。

2.3 葉片與花瓣抑菌能力的比較

如圖1所示，不同植物葉片抑菌率/花瓣抑菌率的值差異顯著，說明一些植物葉片的抑菌能力與花瓣的抑菌能力顯著不同，而另一些植物葉片和花瓣則具有相同水平的抑菌能力。圖1-A中，西府海棠葉片、花瓣對傷寒沙門氏菌的抑菌率相差近65倍，紫荊葉片對金黃色葡萄球菌的抑制能力是花瓣的40倍，金鐘葉片、花瓣對金黃色葡萄球菌的抑菌率比值為28，而碧桃的葉片、花瓣表現(xiàn)出相同的抑菌能力，葉片抑菌率/花瓣抑菌率的值均為1，榆葉梅、貼梗海棠和櫻花葉片、花瓣的抑制能力間的差異也較小。

對于草本植物而言，其葉片、花瓣抑菌能力的差異沒有木本植物明顯，如圖1-B所示， 草本植物葉片與花瓣抑菌率（對傷寒沙門氏菌）的比值最高的是長壽花、菊花，但檢測抑制金黃色葡萄球菌的效果時，這2種植物葉片、花瓣的抑菌能力相同，均為0，而其他植物葉片、花瓣的抑菌能力差異均不明顯。

2.4 抑菌能力強的園林植物最大抑菌強度的比較

挑選出對供試菌種具有完全抑制能力的植物葉片、花瓣進(jìn)行最大抑菌強度試驗，即考察1 g葉片或花瓣對梯度稀釋的不同濃度的菌液所能表現(xiàn)出的最大抑菌濃度，計算其能夠抑制的單位面積的最大菌落數(shù)[CFU/（mL·cm2）]。如表3所示，對大腸桿菌抑制強度最大的是碧桃葉片、櫻花葉片，是碧桃花瓣的1 000倍;碧桃葉片、紫玉蘭葉片對傷寒沙門氏菌的抑菌強度最大，紫玉蘭葉片對枯草芽孢桿菌的抑制強度最大，為碧桃花瓣、紫丁香葉片的105倍;櫻花葉片對金黃色葡萄球菌的最大抑菌強度是紫丁香的105倍。試驗結(jié)果表明，不同植物之間抑菌強度差異顯著，說明不同植物所含抑菌物質(zhì)不同，為進(jìn)一步分析植物抗菌活性成分提供了理論依據(jù)。

3 討論與結(jié)論

在本試驗中，5種草本植物的葉片、花瓣對4種供試菌有較明顯的抑制作用，瓜葉菊葉片、花瓣對傷寒沙門氏菌的抑制率分別達(dá)到了62.1%、60.7%;長壽花葉片對傷寒沙門氏菌的抑制率為76.0%，花瓣對大腸桿菌的抑制率為24.2%;矮牽?；ò陮莶菅挎邨U菌的抑制率為46.6%。木本植物對4種供試菌的抑制率明顯高于草本植物，木本植物中有6個品種對4種菌的抑制率達(dá)到100.0%，之前從未有如此高的關(guān)于植物抑菌率的報道。在本研究中，木本植物花瓣對4種菌的抑制率較高，碧桃花瓣對4種菌幾乎實現(xiàn)了完全抑制，櫻花花瓣對4種菌的抑制效果也很顯著，貼梗海棠花瓣對金黃色葡萄球菌實現(xiàn)了100%抑制。在本研究中，植物葉片的抑菌率普遍高于花瓣，可能由于葉片的生長周期比花瓣長，積累的有機物質(zhì)較多。不同植物由于生長條件不同、組織結(jié)構(gòu)不同，所含代謝物質(zhì)有差異，最終導(dǎo)致抑菌能力不同[8]。

已有的報道都是將菌液稀釋到一定濃度后，將活菌數(shù)控制在可計算的范圍內(nèi)，再將菌液涂布在培養(yǎng)基平板上，加碎葉計算被抑制菌的數(shù)量，以此得出抑菌率。此方法簡單、快捷、易操作，但也存在明顯不足，因為每次試驗菌液濃度都會有差異，導(dǎo)致同種植物不同批次的試驗抑菌率有差異，目前關(guān)于抑菌試驗中活菌數(shù)的濃度沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。劉洋等選取8種常見園林草本花卉植物葉片進(jìn)行抑菌研究，發(fā)現(xiàn)葉片揮發(fā)性物質(zhì)具有抑菌作用，1 g彩葉草碎葉對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制率最高，分別為53.13%、56.99%、44.44%[9]。孫雨珂等對四川省成都市16種園林植物葉片進(jìn)行抑菌作用進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)八角金盤對金黃色葡萄球菌12 h的抑制作用最大，對照組菌落數(shù)41個，試驗組菌落數(shù)8個，12 h抑菌率為80.5%;南天竹對大腸桿菌12 h的抑制率最高，對照組菌落數(shù)69個，試驗組菌落數(shù)15個，12 h抑菌率為78.2%[10]。針對本研究中抑菌率為100%的木本植物葉片，為了探究其抑菌能力，本研究提出了一個新的概念——最大抑菌強度（MAS），即1 g碎葉抑制單位面積的最大活菌數(shù)量。結(jié)果顯示，同樣是抑菌率為100%的植物葉片，MAS結(jié)果差異顯著，對于大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌，MAS最高值與最低值的比值分別為104、103、105、105。碧桃、櫻花對大腸桿菌的MAS可達(dá)到106數(shù)量級，碧桃、紫玉蘭對傷寒沙門氏菌的MAS可達(dá)到105數(shù)量級，紫玉蘭對枯草芽孢桿菌的MAS可達(dá)到106數(shù)量級，櫻花對金黃色葡萄球菌的MAS可達(dá)到105數(shù)量級，如此強的抑菌能力使這些植物成為提取天然植物抑菌劑的最佳對象。

綠色植物不僅能美化環(huán)境、釋放氧氣，還能分泌揮發(fā)性物質(zhì)，抑制或殺死空氣中的微生物[11-12]。植物體內(nèi)抑菌化學(xué)成分通過揮發(fā)作用被釋放出來，使微生物結(jié)構(gòu)受損，阻礙代謝途徑，破壞細(xì)胞內(nèi)的酶和蛋白質(zhì)，從而抑制其生長甚至導(dǎo)致植物死亡[13]。目前，植物抑殺菌作用已應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、食品防腐保鮮等方面，但在園林綠化、人居環(huán)境改善中還有較大的研究空間[14]。本試驗選取的草本、木本植物葉片、花瓣都有很好的抑殺菌效果，可以在人口活動密集場所如醫(yī)院周圍、街道旁、鬧市區(qū)、工廠附近等大量種植，不僅美觀，還能凈化空氣，是城市園林綠化樹種的最佳選擇。草本植物不但能作為綠化的地被植物，還可在室內(nèi)種植。辦公區(qū)域、商場、超市、醫(yī)院病房等人員流動場所，多放置一些此類物種，既能營造良好的氛圍，緩解人們疲勞，減輕壓力，又能有效阻止由細(xì)菌引起的疾病傳播。

本研究只是將供試植物對4種細(xì)菌抑制效果進(jìn)行了初步分析，關(guān)于植物抑菌物質(zhì)和抗菌活性成分尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

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