蔣雨洲，陳順輝，李文卿*，劉青麗，李志宏，張?jiān)瀑F，張燕，唐英琪

1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163391；

2 福建省煙草專賣局煙草科學(xué)研究所，福州 350013；

3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081

生物固氮在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、環(huán)境保護(hù)和建立氮素生態(tài)平衡方面具有重要作用[1]。在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，每年由微生物介導(dǎo)的固氮量平均達(dá)90～130 Tg[2]。施肥年限、施肥類型和土壤本質(zhì)等因素，都會(huì)對(duì)土壤微生物活性、生物量和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同影響，最終表現(xiàn)為對(duì)農(nóng)田有害、有益和無(wú)影響的結(jié)果[3]。因此，研究土壤固氮微生物其群落結(jié)構(gòu)及其與施肥的關(guān)系，對(duì)于認(rèn)識(shí)土壤氮素循環(huán)過(guò)程具有重要的意義。

固氮微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中十分重要的功能群之一，其數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)的變化，直接影響著土壤固氮效率高低和土壤氮素循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)[4]。固氮微生物中廣泛存在編碼固氮酶含鐵蛋白的nifH基因，與生物固氮過(guò)程有著緊密的聯(lián)系[5-6]。Wakelin等[7]研究表明玉米秸稈回田可以顯著增加含nifH基因細(xì)菌的豐度，而氮肥的施用不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生顯著影響；而劉樸方[8]認(rèn)為，氮肥用量的增加會(huì)導(dǎo)致nifH基因豐度的降低，并影響含nifH基因細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。Teng QH等[9]證實(shí)低量有機(jī)肥導(dǎo)致玉米土壤含nifH基因細(xì)菌多樣性增加。

稻草回田和餅肥施用是南方煙-稻輪作煙區(qū)的常用土壤保育措施，對(duì)提高土壤質(zhì)量，保障烤煙生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前，有關(guān)施肥對(duì)土壤含nifH基因微生物群落影響的研究，主要集中在單一的施肥措施對(duì)微生物群落豐度、組成和多樣性的影響，而長(zhǎng)期定位施用餅肥和稻草回田對(duì)煙田土壤中含nifH基因微生物群落豐度、組成和多樣性的影響，土壤中含nifH基因細(xì)菌的多樣性與無(wú)機(jī)氮含量之間的關(guān)系方面尚未見(jiàn)報(bào)道。本文主要通過(guò)研究土壤無(wú)機(jī)氮含量與硝化細(xì)菌種群和固氮細(xì)菌種群的偶聯(lián)關(guān)系，揭示農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用餅肥和稻草回田對(duì)煙田土壤無(wú)機(jī)氮含量及nifH細(xì)菌多樣性的影響，旨在為煙田建立科學(xué)的施肥制度，提高土壤質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和品種

試驗(yàn)在福州市晉安區(qū)宦溪鎮(zhèn)福建省煙草科學(xué)研究所科研基地進(jìn)行。2008 年水稻收割后試驗(yàn)田 0～20 cm耕層土壤基本養(yǎng)分較為一致，養(yǎng)分含量分別為：有機(jī)質(zhì) 28.96 g/kg，堿解氮 144.66 mg/kg，速效磷 5.85 mg/kg，速效鉀 142.43 mg/kg，pH 5.76。土壤類型為沙壤土。2009 年開(kāi)始進(jìn)行定位施肥處理。供試烤煙品種為翠碧 1 號(hào)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)從 2009 年烤煙生產(chǎn)季開(kāi)始，2008年水稻收割后將田塊分成 3 個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū) 350 m2。試驗(yàn)共設(shè)置3 個(gè)處理，分別為：T1：常規(guī)施用化肥對(duì)照處理，每年水稻收割后將稻草清除出田；T2：常規(guī)施用化肥+稻草回田處理，在 T1 處理施肥的基礎(chǔ)上，每年水稻收割后，將稻草粉碎后回田處理；T3：常規(guī)施用化肥+稻草回田+餅肥處理， 在 T2 處理的基礎(chǔ)上，移栽前施條溝肥時(shí)增加施用餅肥 300 kg/hm2。各處理均不設(shè)重復(fù)。

1.3 田間管理

各處理每年晚稻收割后均進(jìn)行溶田。每個(gè)處理2009—2013年烤煙生產(chǎn)季施用90 kg/hm2?；实琋：P2O5：K2O＝1：0.75：2.63；2014—2017年 烤煙生產(chǎn)季施用97.5 kg/hm2化肥氮，N：P2O5：K2O＝1：0.75：2.63；（肥料分別為煙草專用肥N：P2O5：K2O＝12：8：22，復(fù) 合 肥N：P2O5：K2O＝15：15：15；硝酸鉀N：P2O5：K2O＝13：0：38和硫酸鉀含K2O 51%）；基肥：追肥=60：40。試驗(yàn)當(dāng)季施用餅肥全氮含量3.91%，全磷含量10.7 g/kg，全鉀含量11.92 g/kg；稻草全氮含量8.55 g/kg，全磷含量1.55 g/kg，全鉀含量15.36 g/kg。每年水稻季N用量為96.3 kg/hm2，P2O5用量為70.5 kg/hm2的和K2O用量為26.25 kg/hm2，肥料種類分別為碳銨、過(guò)鈣（有效磷≥12%）、復(fù)合肥（N：P2O5：K2O＝15：15：15）和水稻專用肥（N：P2O5：K2O＝12：6：7）。

1.4 樣品采集

1.4.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定樣品采集

2017 年烤煙施肥移栽前，各小區(qū)按梅花 5 點(diǎn)取0～20 cm 耕層土壤混合樣，剔除雜質(zhì)后過(guò) 5 mm 篩，風(fēng)干待測(cè)定土壤常規(guī)理化性質(zhì)。6 月 30 日煙葉采收結(jié)束后每處理距離煙株 15 cm 處取 3 個(gè)煙畦縱切面土壤（2 cm 厚度）混合樣， 風(fēng)干后測(cè)定化學(xué)成分。

1.4.2 土壤細(xì)菌多樣性測(cè)定樣品采集

在 2017 年 6 月 15 日，烤煙收獲季，取煙株根際土壤，每個(gè)處理小區(qū)各取樣 3 次重復(fù)，剔除雜質(zhì)后并過(guò) 2 mm 篩，裝于封口袋冷凍保存，進(jìn)行功能基因多樣性分析。

1.5 樣品的測(cè)定

土壤理化性質(zhì)測(cè)定：土壤NO3--N含量和NH4+-N含量采用0.01 mol/L無(wú)水氯化鈣浸提，德國(guó)默克公司生產(chǎn)的Reflectoquant試劑盒測(cè)定。

土壤細(xì)菌DNA提取，PCR擴(kuò)增和Miseq測(cè)序：采集的土壤樣品送至北京奧維森基因科技有限公司利用Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。采用PowerSoil?DNA Isolation kit (MO BIO Laboratories,Inc., CA, USA）試劑盒，按操作步驟說(shuō)明提取土壤DNA。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和濃度。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶8-bp Barcode的特異引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。nifH上游引物為AAA GGY GGW ATC GGY AAR TCC ACC AC，nifH下游引物為TTG TTS GCS GCR TAC ATS GCC ATC AT。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)32次，循環(huán)結(jié)束后72℃保持7 min，4℃條件下結(jié)束，收集數(shù)據(jù)。將同一樣本3次PCR反應(yīng)產(chǎn)物的混合物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）定量檢測(cè)，最后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。混合后的樣品進(jìn)行Miseq測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)（SRA accession: PRJNA542599）。測(cè)定樣品時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣品同時(shí)進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR反應(yīng)體系配置如下：2×Taq Plus Master Mix 10 μL，10 mmol/L上游引物和下游引物各0.5 μL，加水至18 μL。加入2 μL DNA后，按以下程序進(jìn)行PCR：95℃，30 s；40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，5 s；60℃，40 s（收集熒光））結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得待測(cè)樣品中nifH基因拷貝數(shù)。

1.6 計(jì)算方法和數(shù)據(jù)分析

生物信息學(xué)分析等由北京奧維森基因科技有限公司完成，原始數(shù)據(jù)下機(jī)后，首先進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，通過(guò)序列拼接、過(guò)濾和去嵌合體后得到優(yōu)化序列，然后進(jìn)行OTU聚類及注釋，其中OTU劃分基于核苷酸序列97%相似性水平。

不同處理對(duì)土壤nifH基因拷貝數(shù)、Alpha多樣性的影響采用SAS package 9.1（SAS Institute，Cary，NC，USA）進(jìn)行ANOVA分析，LSD（P＜0.05）進(jìn)行差異比較；進(jìn)化發(fā)生樹(shù)通過(guò)MAFFT進(jìn)行序列對(duì)齊，F(xiàn)astTree進(jìn)行建樹(shù)，并根據(jù)R語(yǔ)言把其物種的豐度和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行可視化展示；Venn圖通過(guò)R語(yǔ)言工具統(tǒng)計(jì)和作圖。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng) EXCEL 2010 整理后作圖，并用SPSS 11.5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)期定位施肥對(duì)土壤無(wú)機(jī)氮的影響

由圖 1 可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)連續(xù) 8 年的定位施肥的試驗(yàn)地，烤煙采收后常規(guī)施用化肥的土壤T1處理和施用化肥+稻草回田的土壤T2處理的無(wú)機(jī)氮含量均高于移栽前土壤，而施用化肥+稻草回田+餅肥的土壤T3處理則反之；3 個(gè)處理烤煙移栽前和采收后的土壤無(wú)機(jī)氮含量，均以T3處理最高，分別為46.6 mg/kg和25.5 mg/kg，與同時(shí)期T1和T2處理間均呈顯著性差異，但在移栽前T2處理的土壤無(wú)機(jī)氮含量高于T1處理，兩處理間無(wú)顯著性差異，而采收后T2低于T1處理土壤無(wú)機(jī)氮含量，兩處理間無(wú)顯著性差異。說(shuō)明在稻草回田基礎(chǔ)上再添加餅肥，能夠提高煙田土壤無(wú)機(jī)氮含量。

圖1 不同施肥處理煙田土壤無(wú)機(jī)氮含量Fig.1 Inorganic nitrogen contents in tobacco planting soil treated with different fertilization scheme

2.2 長(zhǎng)期定位施肥對(duì)煙田土壤含nifH基因細(xì)菌α多樣性的影響

如圖 2所示，與長(zhǎng)期單一施化肥的 T1 處理相比，稻草回田 T2 處理降低了煙田土壤中chao1指數(shù)，而增加餅肥的 T3 處理提高了煙田土壤中chao1指數(shù)，各處理間均無(wú)顯著性差異。各處理的PD_whole_tree指數(shù)變化規(guī)律與chao1指數(shù)較為相似，T3處理最高，其次是T1 處理，而T2 處理最低。說(shuō)明在稻草回田基礎(chǔ)上增施餅肥有利于提高煙田土壤細(xì)菌的豐富度和譜系多樣性。與長(zhǎng)期單一施化肥的 T1 處理相比，稻草回田 T2 處理能夠提高煙田土壤中shanoon指數(shù)，而再增施餅肥的 T3 處理可進(jìn)一步提高煙田土壤中shanoon指數(shù)， T3 處理分別與T1和T2處理間呈顯著性差異。從observed_species來(lái)看，各處理實(shí)際觀測(cè)到OTU的個(gè)數(shù)變化規(guī)律與shanoon指數(shù)相似，T3處理最高，其次是T2處理，而T1 處理最低。說(shuō)明在稻草回田基礎(chǔ)上增施餅肥有利于提高煙田土壤細(xì)菌多樣性。

2.3 長(zhǎng)期定位施肥對(duì)煙田土壤中含nifH基因細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

如圖 3 可知，3 個(gè)處理共測(cè)得 2003 個(gè) OTU。T1和 T3處理的共有 OTU 個(gè)數(shù)最多，為 100 個(gè)；其次是T2 和 T3 處理的共有 OTU 個(gè)數(shù)為99個(gè)，而T1 和T2 處理的共有 OTU 個(gè)數(shù)最少，為98個(gè)。T2 處理獨(dú)有 OTU 個(gè)數(shù)最少，為 18 個(gè)；其次是T1 處理的獨(dú)有OTU 個(gè)數(shù)為19個(gè)，而T3 處理的獨(dú)有 OTU 個(gè)數(shù)最高，為34個(gè)。說(shuō)明煙-稻輪作體系下，長(zhǎng)期稻草回田后加施餅肥均對(duì)土壤獨(dú)有細(xì)菌種類的影響較小。

2.4 不同施肥處理的土壤nifH細(xì)菌OTU差異

各處理的OTU差異反映在二維坐標(biāo)圖上，處理組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。如圖4所示，各處理的3次重復(fù)分布較為集中，處理間差異明顯。其中PC1因子的影響達(dá)62.16%，PC2因子影響為18.62%，兩者影響合計(jì)為80.78%。T1 處理位于橫坐標(biāo)-0.2附近，縱坐標(biāo)0～0.1的區(qū)間內(nèi)；T2處理位于橫坐標(biāo)-0.1～0和縱坐標(biāo)-0.1以下的區(qū)間內(nèi)；T3處理位于橫坐標(biāo)0.15～0.2和縱坐標(biāo)0～0.1的區(qū)間內(nèi)。從各處理所在區(qū)間距離來(lái)看，T1 處理與T3處理在橫坐標(biāo)（PC1影響因子）的距離最遠(yuǎn)，并且高于T1 處理與T2處理和T2處理與T3處理，均約為2倍；從PC2影響因子看T1處理和T3處理差異較小，均與T2處理有較大的差異。說(shuō)明在試驗(yàn)不同施肥類型主處理影響因子下，T1與T3處理對(duì)含nifH基因細(xì)菌影響的差異較大，T2處理居于兩者中間；在PC2影響因子（定位施肥時(shí)間）影響下，T2處理與T1和T3處理的差異逐漸增大。

圖 2 不同施肥處理煙田土壤中細(xì)菌 α 多樣性分析Fig.2 Bacterial α-diversity in tobacco field soil treated with different fertilization scheme

圖3 不同施肥處理煙田土壤中含nifH 基因細(xì)菌OTU 數(shù)的Venn 圖Fig.3 Venn of nifH bacteria OTUs in tobacco field soil treated by different fertilization

2.5 不同施肥處理的含nifh基因細(xì)菌進(jìn)化分支圖

圖4 不同施肥處理的土壤nifH細(xì)菌OTU差異Fig.4 Difference in OTU of soil nifH bacteria under different fertilization scehme

如圖 5 可知，不同施肥處理對(duì)煙田土壤細(xì)菌進(jìn)化分支有著不同的影響，從門至屬的分類級(jí)別由輻射的圓圈內(nèi)至外，著色為黃色的無(wú)顯著差異物種所占比例較高，與之相比各處理中體現(xiàn)各自差異的細(xì)菌類群較少。各處理中在進(jìn)化分支圖明顯體現(xiàn)的細(xì)菌在門水平未出現(xiàn)，T1 處理在進(jìn)化分支圖明顯體現(xiàn)的細(xì)菌在綱水平未出現(xiàn)；在目水平包括Gallionellales；在科水平包括Phyllobacteriaceae、Desulfohalobiaceae和Gallionellaceae等。T2處理在進(jìn)化分支圖明顯體現(xiàn)的細(xì)菌在綱水平包括Alphaproteobacteria；在目水平包括Rhizobiales；在科水平包括Bradyrhizobiaceae和Oxalobacteraceae等。T3 處理在進(jìn)化分支圖明顯體現(xiàn)的細(xì)菌在綱水平未出現(xiàn)；在目水平包括Caulobacterales；在科水平包括Caulobacteraceae和Chloroflexaceae等。從而說(shuō)明，單施化肥的煙田和化肥＋稻草回田+增施餅肥處理的煙田細(xì)菌在綱水平未出現(xiàn)顯著的優(yōu)勢(shì)種群，而化肥＋稻草回田處理的煙田細(xì)菌在綱、目、科屬水平均有較多的優(yōu)勢(shì)種群。

圖5 不同施肥處理的土壤含nifH基因細(xì)菌 LEf Se 進(jìn)化分支圖Fig.5 LEf Se of soil nifH bacteria under different fertilization scheme

2.6 長(zhǎng)期定位施肥對(duì)煙田土壤中含nifH基因細(xì)菌組成的影響

試驗(yàn)的3個(gè)處理共鑒定出17個(gè)門、23個(gè)綱、55個(gè)目、97個(gè)科、175個(gè)屬。從表1可見(jiàn)，所占比例較高（相對(duì)豐度＞0.5%）的5個(gè)菌門，依 次 分 別 為Proteobacteria＞Cyanobacteria＞Verrucomicrobia＞Actinobacteria＞Spirochaetes，分 別 介 于80.01%～82.36%、33.24%～4.36%、3.15%～3.58%、3.49%～4.72%和0.48%～1.08%之間，以Proteobacteria最高，介于80.01%～82.36%之間。T1處理Proteobacteria的相對(duì)豐度為80.21%，T3處理比T1處理減少了0.25%，T2處理比T1處理增加了2.68%，且顯著高于其它兩個(gè)處理。

所占比例較高（相對(duì)豐度＞0.5%）的7個(gè)菌綱，依次分別為Alphaproteobacteria＞Deltaproteobacteria＞Betaproteobacteria＞Gammaproteobacteria＞Opitutae＞Actinobacteria＞Spirochaetia，分 別 介 于32.16%～36.02%、26.62%～27.90%、12.93%～16.09%、4.86%～5.34%、3.15%～3.58%、3.49%～4.72%和0.48%～1.08%之間，主要的4個(gè)菌綱：Alphaproteobacteria的相對(duì)豐度T1處理為32.16%，顯著低于其它兩個(gè)處理，T2和T3處理分別比T1處理增加了12.00%和7.45%；Deltaproteobacteria的相對(duì)豐度T1處理為26.62%，T2和T3處理分別比T1處理增加了4.81%和3.92%，三個(gè)處理間差異不顯著；Betaproteobacteria的相對(duì)豐度T1處理為16.09%，T2和T3處理分別比T1處理顯著減少了18.19%和19.63%；Gammaproteobacteria的相對(duì)豐度T1處理為5.34%，T2和T3處理分別比T1處理減少了1.21%和9.01%，三個(gè)處理間差異不顯著。

所占比例較高（相對(duì)豐度＞0.5%）的12個(gè)菌目，依 次 分 別 為Rhizobiales ＞ Desulfovibrionales ＞Gallionellales ＞ Desulfuromonadales＞ Rhodocyclales＞ Nostocales ＞ Opitutales ＞ Burkholderiales ＞Myxococcales ＞ Frankiales ＞ Desulfobacterales ＞Methylococcales， 分 別 介 于31.32%～35.29%、14.16%～14.95%、6.02%～9.46%、6.64%～7.30%、3.44%～4.01%、2.27%～3.37%、3.14%～3.58%、2.62%～3.39%、2.93%～3.22%、3.34%～4.51%、1.93%～2.03%和1.61%～1.95%之間，主要的4個(gè)菌目：Rhizobiales的相對(duì)豐度T1處理為31.32%，T2和T3處理分別比T1處理增加了12.67%和7.74%，差異達(dá)到顯著水平；Desulfovibrionales的相對(duì)豐度T1處理為14.16%，T2和T3處理分別比T1處理增加了5.54%和0.77%，處理間差異不顯著；Gallionellales的相對(duì)豐度T1處理為9.46%，T2和T3處理分別比T1處理減少了26.37%和36.30%，降幅達(dá)到顯著水平；Desulfuromonadales的相對(duì)豐度T1處理為6.64%，T2和T3處理分別比T1處理增加了8.49%和10.03%，處理間差異不顯著。

所占比例較高（相對(duì)豐度＞0.5%）的12個(gè)菌科，依次分別為Bradyrhizobiaceae ＞ Desulfovibrionaceae＞ Gallionellaceae ＞ Geobacteraceae ＞ Rhodocyclaceae＞ Opitutaceae ＞ Nostocaceae ＞ Anaeromyxobacteraceae＞ Frankiaceae ＞ Methylococcaceae ＞ Methylocystaceae＞ Desulfobulbaceae，分 別 介 于28.12%～31.68%、13.18%～14.18%、6.02%～9.46%、6.37%～7.12%、3.44%～4.01%、3.14%～3.58%、1.97%～2.95%、2.92%～3.20%、3.34%～4.51%、1.61%～1.95%、1.60%～2.07%和1.22%～1.33%之 間，主 要 的4個(gè)菌科：Bradyrhizobiaceae的相對(duì)豐度T1處理為28.12%，T2和T3處理分別比T1處理增加了12.66%和7.70%，T1處理和T2處理差異達(dá)到顯著水平；Desulfovibrionaceae的相對(duì)豐度T1處理為13.18%，T2和T3處理分別比T1處理增加了7.63%和3.20%，處理間差異不顯著；Gallionellaceae的相對(duì)豐度T1處理為9.46%，T2和T3處理分別比T1處理減少了26.37%和36.30%，降幅達(dá)到顯著水平；Geobacteraceae的相對(duì)豐度T1處理為6.37%，T2和T3處理分別比T1處理增加了9.38%和11.87%，三者差異不顯著。

所占比例較高（相對(duì)豐度＞0.5%）的14個(gè)菌屬，依次分別為Bradyrhizobium ＞ Desulfovibrio＞ Sideroxydans ＞ Geobacter＞ Anaeromyxobacter＞ Frankia ＞ Azospira ＞ Nostoc ＞ Methylocystis＞ Azoarcus ＞ Desulfobulbus ＞ Spirochaeta ＞Pseudacidovorax ＞ Methylococcus， 分 別 介 于27.96%～31.56%、13.18%～14.18%、6.02%～9.46%、6.37%～7.12%、2.92%～3.20%、3.34%～4.51%、1.30%～1.82%、0.66%～1.84%、1.60%～2.07%、1.50%～1.58%、1.08%～1.22%、0.45%～1.-03%、0.68%～1.03%和0.97%～1.10%之間，主要的4個(gè)菌屬：Bradyrhizobium的相對(duì)豐度T1處理為27.96%，T2和T3處理分別比T1處理增加了12.88%和7.62%，T2處理和T1處理間差異達(dá)到顯著水平；Desulfovibrio的相對(duì)豐度T1處理為13.18%，T2和T3處理分別比T1處理增加了7.63%和3.20%，處理間差異不顯著；Sideroxydans的相對(duì)豐度T1處理為9.46%，T2和T3處理分別比T1處理減少了26.37%和36.30%，降幅達(dá)到顯著水平；Geobacter的相對(duì)豐度T1處理為6.37%，T2和T3處理分別比T1處理增加了9.38%和11.87%，處理間差異不顯著。屬水平的細(xì)菌豐度在1%以上的有10個(gè)，分別 為Bradyrhizobium、Desulfovibrio、Sideroxydans、Geobacter、Anaeromyxobacter、Frankia、Azospira、Methylocystis、Azoarcus和Desulfobulbus。

表1 不同施肥處理對(duì)煙田土壤中含nifH基因細(xì)菌的組成與土壤無(wú)機(jī)氮含量Pearson相關(guān)性分析Tab. 1 Pearson correlation between relative abundance of nifH bacteria and inorganic nitrogen contents uin tobacco planting soil treated different fertilization scheme

續(xù)表1

2.7 相關(guān)性分析

表1所示，煙田土壤中含nifH基因細(xì)菌組成與土壤無(wú)機(jī)氮Pearson相關(guān)性分析，土壤中細(xì)菌門水平組成中Verrucomicrobia 和Acidobacteria相對(duì)豐度均與土壤無(wú)機(jī)氮呈極顯著正相關(guān)；土壤中細(xì)菌門水平組成中Proteobacteria和Spirochaetes相對(duì)豐度分別與土壤無(wú)機(jī)氮呈顯著負(fù)相關(guān)。土壤中細(xì)菌綱水平組成中Opitutae和Actinobacteria相對(duì)豐度均與土壤無(wú)機(jī)氮呈極顯著正相關(guān)；土壤中細(xì)菌綱水平 組 成 中Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Spirochaetia相對(duì)豐度，均與土壤無(wú)機(jī)氮呈負(fù)相關(guān)，其中Gammaproteobacteria相對(duì)豐度與土壤無(wú)機(jī)氮呈極顯著負(fù)相關(guān)，Spirochaetia相對(duì)豐度與土壤無(wú)機(jī)氮呈顯著負(fù)相關(guān)。土壤中細(xì)菌目水平組成中Desulfovibrionales和Gallionellales相對(duì)豐度，均與土壤無(wú)機(jī)氮呈顯著負(fù)相關(guān)；土壤中細(xì)菌目水平組成中Opitutales、Burkholderiales、Myxococcales、Frankiales和Methylococcales相對(duì)豐度，均與土壤無(wú)機(jī)氮呈極顯著正相關(guān)，Desulfobacterales相對(duì)豐度與土壤無(wú)機(jī)氮呈顯著正相關(guān)。土壤中細(xì)菌科水平組成中Gallionellaceae、Methylocystaceae和Desulfobulbaceae相對(duì)豐度，均與土壤無(wú)機(jī)氮呈顯著負(fù)相關(guān)；土壤中細(xì)菌科水平組成中Opitutaceae、Anaeromyxobacteraceae、Frankiaceae和Methylococcaceae相對(duì)豐度，均與土壤無(wú)機(jī)氮呈極顯著正相關(guān)。土壤中細(xì)菌屬水平組成中Sideroxydans、zospira、Nostoc、Methylocystis、Desulfobulbus、Spirochaeta和Methylococcus相對(duì)豐度均與土壤無(wú)機(jī)氮呈顯著負(fù)相關(guān)，土壤中細(xì)菌屬水平組成中Anaeromyxobacter和Frankia相對(duì)豐度，均與土壤無(wú)機(jī)氮呈極顯著正相關(guān)。

3 討論

土壤微生物在土壤中參與有機(jī)質(zhì)和各種養(yǎng)分的分解與轉(zhuǎn)化，與土壤肥力高低密切相關(guān)，而土壤細(xì)菌是土壤微生物的主要組成部分[10-11]。長(zhǎng)期施用餅肥并覆蓋稻草，可有效增加土壤養(yǎng)分有效性[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)期稻草回田并施用餅肥有利于提高烤煙土壤無(wú)機(jī)氮含量；而單獨(dú)稻草回田可能因稻草碳/氮比較高，回田后在土壤中分解過(guò)程中還消耗土壤中的氮，導(dǎo)致煙葉采收結(jié)束時(shí)土壤無(wú)機(jī)氮含量較低。

蔣雨洲等[13]研究結(jié)果表明在東北黑土的長(zhǎng)期定位試驗(yàn)條件下，土壤微生物多樣性受施肥類型的影響，與施加有機(jī)肥處理相比，單施化肥處理的土壤微生物多樣性略低。從本研究的各處理獨(dú)有OTU個(gè)數(shù)看，T3處理最高，為34個(gè)，而T1和T2處理分別為18和19個(gè)。由于土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)易受有機(jī)肥料的影響，煙田施入有機(jī)肥導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)和微生物活性改變，從而改變了微生物群落多樣性[14-15]。近年來(lái)，丁建莉等[16]研究結(jié)果表明在東北黑土的長(zhǎng)期定位試驗(yàn)條件下，土壤微生物多樣性受施肥類型的影響，施用有機(jī)肥比單施化肥的土壤微生物多樣性較高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與施用化肥農(nóng)田相比，增施餅肥對(duì)聚類影響較大，與前人研究結(jié)果一致。

生物固氮是指在固氮微生物的作用下將空氣中的氮?dú)膺€原成氨的過(guò)程，是大氣氮素進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的主要途徑之一，土壤中古菌和細(xì)菌等多種類群都有固氮能力[17]。有研究表明，氮肥和有機(jī)肥施用影響土壤固氮微生物的群落組成[18-19]。有研究指出，施肥不會(huì)引起固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著變化[20]。從本研究細(xì)菌nifH基因α多樣性看，在稻草回田基礎(chǔ)上并添加餅肥有利于提高煙田土壤細(xì)菌豐富度和譜系多樣性，這與TIAN等[21]研究結(jié)果較為一致。可能是因?yàn)橛袡C(jī)物料還田為微生物代謝提供更多可供分解的植物殘?bào)w，進(jìn)而促進(jìn)了土壤微生物活性，而且有機(jī)肥物料本身也帶入大量活的微生物，所以增加了土壤微生物的豐富性[22]，但還需進(jìn)一步深入探究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單施化肥相比，稻草回田處理和稻草回田配施餅肥處理，煙田土壤含nifH基因細(xì)菌α 多樣性均有提高，而稻草回田配施餅肥處理最有利于提高煙田土壤中shanoon指數(shù)和實(shí)測(cè)的OTU個(gè)數(shù)。由于稻草回田增加了土壤有機(jī)質(zhì)和有效養(yǎng)分含量[23-24]，能為固氮微生物特別是異養(yǎng)固氮微生物的生長(zhǎng)和代謝提供物質(zhì)和能量來(lái)源，從而有益于固氮微生物的繁殖[25-26]，而稻草回田后并配施餅肥，能進(jìn)一步提供豐富的碳源及其他營(yíng)養(yǎng)元素，進(jìn)而促進(jìn)土壤固氮微生物的大量繁殖[27-28]，而單一施肥會(huì)導(dǎo)致微生物多樣性降低[29]，Zhou等[30]研究長(zhǎng)期單施化肥對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響指出，單施化肥會(huì)減少細(xì)菌種群的豐度，而化肥與有機(jī)肥或綠肥秸稈長(zhǎng)期配合施用，可改良土壤結(jié)構(gòu)，增加土壤微生物的數(shù)量[31]。

Roesch等[32]研究證實(shí)農(nóng)田土壤細(xì)菌多樣性主要為豐度最高的Proteobacteria菌屬，而本研究結(jié)果與之較為一致，但與前人研究所涉及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度相比較，本研究所針對(duì)的微生物組成中，不同的菌種與土壤化學(xué)性質(zhì)有著密切的關(guān)系，土壤中細(xì)菌豐富度受有機(jī)質(zhì)含量的影響[33]，Proteobacteria（變形菌門）與土壤速效養(yǎng)分關(guān)系密切[34]，這可能稻草回田過(guò)程中稻草未徹底腐爛，在煙株生長(zhǎng)期間繼續(xù)分解的過(guò)程中仍然消耗一定的土壤氮，稻草回田處理Proteobacteria的相對(duì)豐度最高，在烤煙移栽前，處理間土壤無(wú)機(jī)氮的含量與Proteobacteria的相對(duì)豐度表現(xiàn)較一致，與前人研究結(jié)果相似，但在烤煙采收后，土壤無(wú)機(jī)氮的含量與Proteobacteria的相對(duì)豐度表現(xiàn)相反，可能是由于采收后烤煙根系分泌物的影響所致[35]，其原因還需進(jìn)一步探究。本研究進(jìn)一步明確Cyanobacteria（藍(lán)細(xì)菌）豐度次之，而且Cyanobacteria與腐殖質(zhì)的形成密切相關(guān)[36]，由于腐殖質(zhì)是土壤有機(jī)質(zhì)重要組分之一，稻草回田及有機(jī)肥的投入都會(huì)增加土壤中有機(jī)質(zhì)含量，從而提高土壤肥力[37]；Verrucomicrobia、Actinobacteria和Spirochaetes的相對(duì)豐度＞0.5%，Verrucomicrobia（疣微菌）是一種纖維素降解菌，有利于植物殘?bào)w在土壤中的分解，提高土壤肥力[38]，因此，本研究中增施餅肥的T3處理Verrucomicrobia的相對(duì)豐度最高；Actinobacteria（放線菌）能夠起到病害生物防治的作用，農(nóng)田施肥可以向土壤中輸入養(yǎng)分，刺激微生物生長(zhǎng)繁殖，從而影響土壤微生物的豐度、活性、微生物量和微生物群落結(jié)構(gòu)[39-40]，而農(nóng)田施入有機(jī)肥還能夠改良土壤理化性質(zhì)，促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)[41]，因此，本研究中隨著有機(jī)肥量的增多呈現(xiàn)出Actinobacteria豐度較高的趨勢(shì)。

本研究通過(guò)LEf Se進(jìn)化分支圖還發(fā)現(xiàn)，在煙田細(xì)菌目水平組間差異相比，各處理中單施化肥、稻草回田和增施餅肥的煙田細(xì)菌目水平組間差異較高的分別是Gallionellales（披毛菌目）、Rhizobiales（根瘤菌目）和Caulobacterales（柄桿菌目）有關(guān)目的物種。由于Gallionellales（披毛菌目）參與Fe的轉(zhuǎn)化[41]，與固氮方面沒(méi)有直接聯(lián)系，而Rhizobiales（根瘤菌目）在土壤中長(zhǎng)期以腐生菌的狀態(tài)存在，起到固氮作用[42]， Caulobacterales（柄桿菌目）有利于物料的分解[43]，且能與根瘤菌協(xié)同作用，聯(lián)合固氮，增強(qiáng)土壤生物固氮，從而提高土壤肥力[44]，而本研究中稻草回田后并配施餅肥的煙田，在烤煙移栽前和采收后的土壤無(wú)機(jī)氮含量均最高，與該理論一致。

4 結(jié)論

（1）不同施肥類型對(duì)植煙土壤無(wú)機(jī)氮含量有著不同的影響，稻草回田和稻草回田并添加餅肥能夠改善植煙土壤無(wú)機(jī)氮含量，稻草回田并添加餅肥更有利于提高土壤無(wú)機(jī)氮含量。

（2）不同施肥類型對(duì)土壤nifH基因細(xì)菌的獨(dú)有OTU 個(gè)數(shù)影響較小，但與單施化肥相比，稻草回田或再增加餅肥有利于提高α 多樣性。

（3）不同施肥類型對(duì)植煙土壤微生物組成的影響，細(xì)菌所占比例較高的主要1個(gè)菌門，Proteobacteria，而Proteobacteria 菌門和菌門下物種的相對(duì)豐度最高，其中與單施化肥相比，稻草回田的植煙土壤 Proteobacteria 菌門相對(duì)豐度高。

（4）不同施肥類型對(duì)植煙土壤微生物 LEf Se 進(jìn)化分支圖有明顯影響，單施化肥的煙田土壤細(xì)菌表現(xiàn)優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌種群主要是Gallionellales（披毛菌目）及其目下的細(xì)菌種群；化肥＋稻草回田處理和化肥＋稻草回田＋餅肥處理的煙田土壤分別是Rhizobiales（根瘤菌目）和Caulobacterales（柄桿菌目）及其目下的細(xì)菌種群。