任書樂，王召軍，閆筱筱，張洪映，李雪君，孫計平，崔紅*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號 450002；

2 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南省許昌市魏都區(qū)青梅路與永昌大道交叉口 461000

煙草腺毛豐富，其分泌物的主要成分為二萜化合物和蔗糖酯[1]，二者都是煙草重要的香氣前體物質(zhì)[2-3]。在不同類型煙草中，香料煙腺毛分泌物含量為最高，其次是雪茄煙，烤煙普遍較低[4]。二萜化合物包括西柏烷化合物和賴百當(dāng)化合物兩大類，西柏烷二萜在不同類型煙草中廣泛存在，賴百當(dāng)二萜則主要存在于香料煙和雪茄煙中[5]。煙草蔗糖酯根據(jù)分子量及酯化位置的不同可以分為六種類型（I-VI），但III-VI型蔗糖酯只在香料煙和雪茄煙中存在，烤煙一般只含有I-II型蔗糖酯[4,6]。可見，腺毛分泌物與煙葉香氣品質(zhì)和風(fēng)味密切相關(guān)。

腺毛分泌物含量由腺毛密度、腺毛類型、分泌能力所共同決定。目前，本氏煙細胞周期蛋白基因NbCycB2對腺毛密度的調(diào)控機制已取得突破性進展[7]，煙草NtCycB2基因?qū)煵菹倜l(fā)生的負向調(diào)控作用也已得到證明，K326中NtCycB2基因敲除可以顯著提高分泌型腺毛的密度和分泌物的含量[8-9]。但是，關(guān)于煙草腺毛類型、腺毛分泌能力的分子機制尚不明確，還無法進行精確的分子定向改良。T.I.1068是美國農(nóng)業(yè)部收集的一份野生煙草種質(zhì)。其腺毛類型為分泌型，腺毛密度高，分泌能力強，分泌物成分齊全，包括西柏烷二萜、賴百當(dāng)二萜及I-VI型蔗糖酯，分泌物可達煙葉干重的16%[10]，是高分泌型煙草品種選育及腺毛發(fā)育及物質(zhì)代謝相關(guān)基因克隆的理想材料。

K326是廣泛栽培的烤煙品種，但因育成年代較早，其煙葉品質(zhì)也需要進一步改良，以適宜煙草行業(yè)發(fā)展及消費者的需求。在不同烤煙品種腺毛分泌物的比較研究中，K326腺毛分泌物含量高于紅大、翠碧1號和中煙100[11]，但仍遠遠低于香料煙和雪茄煙品種[12]。由此推測，進一步提高腺毛分泌物的含量，有可能是K326品質(zhì)改良的新的突破口。為此，本研究以K326為輪回親本、以高分泌型種質(zhì)資源T.I.1068為供體親本進行多代回交，擬通過腺毛形態(tài)、葉面分泌物成分及農(nóng)藝性狀的綜合定向篩選，獲得高分泌型K326近等系，為K326葉面分泌物定向調(diào)控和品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為煙草品種K326和高分泌煙草種質(zhì)T.I.1068。種子由本實驗室和河南省農(nóng)科院煙草研究所提供，品種雜交與回交試驗地點設(shè)置在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所試驗田（河南省許昌市），按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙栽培規(guī)程進行田間管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料的選育過程

以K326為輪回親本，以高分泌型種質(zhì)資源T.I.1068為供體親本，進行雜交和連續(xù)回交，對回交后代進行植株表型及腺毛形態(tài)的篩選，BC5F1與K326的農(nóng)藝性狀已趨于一致。BC5F1自交后，選取長柄分泌型腺毛腺頭增大，羅丹明染色加深的BC5F1單株，進行腺毛分泌物成分的檢測分析，從中獲得了高分泌型K326近等系HSK326（圖1）。

圖1 HSK326選育過程Fig.1 HSK326 selection process

1.2.2 腺毛形態(tài)的觀察

于煙株旺長期取頂部10 cm葉片進行腺毛染色與形態(tài)觀察。試驗操作參考李艷華等[11]使用的方法，將葉片置于0.2%（W/V）的羅丹明B水溶液中浸染60 min，染色結(jié)束后依次放到4個裝有清水的燒杯中，每次5 s，涮去未結(jié)合的染料，用濾紙吸去多余水分，并置于室溫下，自然晾干。用剪刀在葉片中部沿主脈兩側(cè)1 cm處剪取6 mm×8 mm組織塊，置于超景深顯微鏡（VHR-5000，日本基恩士公司）下進行長柄分泌型腺毛腺頭大小以及羅丹明染色的觀察和長柄分泌型、短柄分泌型以及非分泌型腺毛的密度統(tǒng)計。

1.2.3 葉面分泌物檢測

于煙株盛花期取下部5～10葉位葉片進行分泌物的提取和檢測，樣品制備以及前處理參考韓錦峰[13]的方法。每株材料取5片葉，每片葉取直徑為7 cm的葉圓片4片，每株材料共20片葉圓片。將葉圓片在二氯甲烷溶液中浸提，每個葉圓片浸提8次，每次2 s。在浸提液中加入1 mL內(nèi)標（2.020 mg/mL的蔗糖八乙酸酯和2.542 mg/mL的正十七烷醇的混合溶液），混合均勻后進行過濾，過濾后進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，硅烷化處理后，利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀TRACEGCULTRA—DSQ IIMS（美國賽默飛世爾科技公司）進行檢測，色譜參數(shù)檢測參考王霄龍等[14]的方法。采用內(nèi)標定量法（相對校正因子為1）進行定量分析。

1.2.4 qRT-PCR 分析

在五葉一心期，選取生長狀態(tài)一致的K326、T.I.1068及HSK326各一株，取自下往上第三葉位且發(fā)育正常的葉片，采用Trizol法進行RNA的提取。利用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒（美國Invitrogen公司）將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以煙草核糖體蛋白基因L25為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對腺毛中西柏烷二萜和賴百當(dāng)二萜合成基因表達水平進行定量分析，每個材料進行3次技術(shù)重復(fù)，所用引物見表1。qPCR采用LightCycler? 480 SYBR Green Ⅰ Master試劑盒，具體反體系如下：SYBR Green Mix 10.0 μL，上、下游引物（10.0 μmo/L）各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，RNase free H2O 8.0 μL。在LightCycler? 480 Ⅱ型 熒 光 定量PCR儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40次循環(huán)，擴增結(jié)束后，添加溶解曲線程序：95℃，15 s，60℃，15 s，20 min內(nèi)逐步升溫至95℃，最后95℃，15 s。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達水平。

表1 擴增引物序列Tab. 1 Amplification of primer sequences

1.2.5NtCPS2基因測序分析

在八葉一心期取K326、T.I.1068及HSK326發(fā)育正常的葉片，采用CTAB法進行DNA的提取。根據(jù)NtCPS2基因第4外顯子中G/T SNP的側(cè)翼序列設(shè)計特異性引物（F：TGGTGTTTTGATTGGCGAGTG；R：GGGGGCATAAAGGTGTCA）進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：94℃10 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃30 s，35次循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存?；厥諗U增產(chǎn)物進行序列測定，利用BioEdit 7.0 軟件對測序結(jié)果進行序列比對。

1.2.6 SSR分子標記鑒定

在八葉一心期取K326、T.I.1068及HSK326發(fā)育正常的葉片，采用TIANGEN Plant Genomic DNA Kit試劑盒（離心柱型）進行DNA提取。利用BMVSE基因緊密連鎖的分子標記PT30354（F：TCGGTTTCTGCTCCAATTTC；R：TGTTCTACTGCTGG GTCGAA）和PT20315（F：ACACGACTTTTCATCTCCC；R：CGCATGAAATT GTAAGGG-30）對所提DNA進行PCR擴增[18]。取PCR擴增產(chǎn)物1 μL上樣于8%非變性聚丙烯酰胺凝膠單泳道，選用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司DL系列500 bp DNA Markers 作為參照，在1×TBE電泳緩沖液中電泳分離。電泳結(jié)束后，參照任民等[15]改良的NaOH銀染方法快速顯影。試驗所用電泳儀器為DYY-12C 型（北京市六一儀器廠），儀器運行參數(shù)為恒電壓1200 V，電流200 mA，功率60 W，電泳2 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 高分泌型K326的選育和形態(tài)比較分析

圖2 株型及腺毛形態(tài)比較Fig.2 Comparison of botany properties and trichome morphology

K326與T.I.1068的植株表型明顯不同。K326株型為筒形或塔形，葉形為長橢圓形，葉數(shù)24～26片，莖葉夾角較大（圖2-1）；T.I.1068株型為塔形，葉形為披針形，葉數(shù)28～30片，莖葉夾角較?。▓D2-2）。二者葉面腺毛形態(tài)也具有明顯差異。K326腺毛類型為混合型，以長柄分泌型為主，也有部分短柄分泌型和少量的非分泌型；長柄腺毛腺頭較小，經(jīng)羅丹明染色后呈現(xiàn)淺粉色（圖2-4）。T.I.1068腺毛為分泌型，包括長柄分泌型和短柄分泌型，缺少非分泌型；長柄腺毛具有明顯的分泌囊，經(jīng)羅丹明染色后呈現(xiàn)玫紅色（圖2-5）。篩選獲得的高分泌型K326近等系HSK326的株型為塔形，葉形為長橢圓形，葉數(shù)24片，莖葉夾角較大（圖2-3）；HSK326腺毛類型仍為混合型，但非分泌型腺毛比K326比例明顯減少，長柄分泌型腺毛腺頭明顯增大，羅丹明著色加深（圖2-6）。從腺毛密度統(tǒng)計來看，HSK326腺毛總量介于K326與T.I.1068之間。與K326相比，HSK326腺毛密度提高了0.3倍。其中，長柄分泌型腺毛密度提高了0.38倍，而非分泌型腺毛密度有所降低（圖3）。

圖3 腺毛密度比較Fig.3 Comparison analysis of trichome density

2.2 高分泌型K326葉面分泌物比較分析

在盛花期分別取K326、T.I.1068及HSK326的下部葉片，進行葉面分泌物的萃取和GC/MS分析，結(jié)果如圖4所示。從組分上來看，HSK326與K326葉面分泌物組成成分一致，與T.I.1068具有較大差異。T.I.1068腺毛分泌物由西柏烷類二萜、賴百當(dāng)類二萜、烷烴類和I-V型蔗糖酯構(gòu)成；K326和HSK326的腺毛分泌物則只含有西柏烷類二萜、烷烴類以及I-II型糖酯，缺少賴百當(dāng)類二萜和III-V型糖酯。從含量上看，T.I.1068葉面分泌物總量遠遠高于K326，HSK326介于二者之間。HSK326的分泌物總量是K326的1.88倍，其中，西柏烷類二萜提高了0.91倍，蔗糖酯含量提高了1.27倍，烷烴含量并無顯著變化。

2.3 高分泌型K326二萜及蔗糖酯合成基因分析

2.3.1 二萜合成基因表達水平及序列分析

采用qRT-PCR技術(shù)，對K326、T.I.1068以及HSK326中賴百當(dāng)類二萜合成基因NtABS、NtCPS2以及西柏烷類二萜合成基因NtCBT、NtCYP71D的表達水平進行了定量分析，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯?，T.I.1068中二萜合成基因的表達水平普遍高于K326；HSK326中西柏烷二萜合成關(guān)鍵基因NtCBT顯著高于K326，這與其西柏烷類化合物的大量積累相一致。賴百當(dāng)二萜合成關(guān)鍵基因NtCPS2雖在T.I.1068中表達占據(jù)絕對優(yōu)勢，但在HSK326和K326中也有一定的表達量，但二者中并沒有檢測到賴百當(dāng)二萜的積累。

圖4 葉面分泌物檢測分析Fig.4 Chemical Analysis of leaf surface chemicals

圖5 二萜合成基因表達水平分析Fig.5 Analysis of the expression level of diterpene synthesis genes

根據(jù)Sallaud等人的研究結(jié)果[16]，NtCPS2基因第4外顯子中存在一個G/T的SNP，引起翻譯提前終止，是造成大部分烤煙中賴百當(dāng)二萜合成缺陷的主要原因。我們據(jù)此設(shè)計引物，分別對HSK326、K326及T.I.1068中NtCPS2基因目標序列進行PCR擴增和序列測定，結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯觯cT.I.1068相比，HSK326和K326在1542 bp處都發(fā)生了T堿基突變，這可能是二者賴百當(dāng)二萜缺失的主要原因。

圖6 HSK326、K326及T.I.1068 NtCPS2基因及蛋白序列比對分析Fig.6 NtCPS2 gene and protein sequence alignment analysis of HSK326, K326 and T.I.1068

2.3.2 III-VI型蔗糖酯合成連鎖分子標記分析

BMVSE基因與煙草III-VI型蔗糖酯的生物合成密切相關(guān)[17]，但至今該基因的序列和功能還不清楚。Vontimitta等[6]對BMVSE基因進行了遺傳定位，并開發(fā)了一系列與BMVSE連鎖的SSR分子標記。其中PT20315和PT30354兩個標記多態(tài)性穩(wěn)定，且與糖酯類型高度一致[18]。因此，我們選用這兩個標記對HSK326、K326及T.I.1068進行了基因型鑒定，結(jié)果如圖7所示?？梢钥闯?，PT20315和PT30354兩個標記可以把親本K326和T.I.1068區(qū)分開來，而HSK326的帶型均與K326相同，說明HSK326與K326中缺少III-VI型蔗糖酯合成的關(guān)鍵基因。這與蔗糖酯的檢測結(jié)果相一致。

圖7 HSK326、K326及T.I.1068中III-VI型糖酯合成基因分子標記鑒定Fig.7 Molecular marker identification of type III-VI sugar ester synthesis genes in HSK326, K326 and T.I.1068

3 討論

煙草腺毛作為表皮細胞的特化結(jié)構(gòu)，不僅是煙株與環(huán)境間的物理屏障，其分泌物更是天然的化學(xué)防線，與煙株抗性和煙葉品質(zhì)密切相關(guān)[19]。葉面分泌物含量的高低作為品種的遺傳特性，由腺毛密度、腺毛類型、腺毛分泌物合成及分泌能力等因素所共同決定。烤煙腺毛為混合型，分泌型與非分泌型共存。腺毛密度，尤其是長柄分泌型腺毛的密度普遍較低，分泌能力不高，腺頭分泌囊較小，導(dǎo)致了其葉面腺毛分泌物含量在不同類型煙草中處于較低水平[12]。由于煙草腺毛發(fā)育及物質(zhì)代謝的分子調(diào)控機制并不十分清楚，采用常規(guī)選育技術(shù)，將種質(zhì)資源中的高分泌特性導(dǎo)入栽培品種，仍是目前行之有效的途徑之一。T.I.1068作為典型的高分泌型煙草資源，具有腺毛密度高、分泌旺盛、成分齊全等特點，是煙草葉面分泌物研究的典型材料[10]。本研究將T.I.1068作為供體親本與K326進行雜交，經(jīng)過多代回交后，將其高分泌特性成功導(dǎo)入K326，獲得了高分泌型K326改良品系HSK326。

HSK326的一個明顯特征是腺毛密度較高。雖然，HSK326與K326的腺毛類型一致，但分泌型腺毛，包括長柄分泌型和短柄分泌型的密度，比K326都有明顯增加。T.I.1068高腺毛密度的分子機制并不清楚。已有的研究證明，NtCycB2基因的突變會提高長柄分泌型腺毛的密度[8]，但T.I.1068中該基因的序列和表達水平與K326相比，并無明顯差異（未發(fā)表）。從T.I.1068中非分泌型腺毛缺失，推測其控制非分泌型腺毛發(fā)生的基因通路受阻，這或許在某種程度上促進了分泌型腺毛的發(fā)生。HSK326在分泌型腺毛密度提高的同時，非分泌型腺密度有所降低，預(yù)示煙草分泌型腺毛與非分泌型腺毛發(fā)生之間存在某種交叉調(diào)控機制。

腺毛分泌能力強是HSK326的另一個特征。形態(tài)觀察可以看出，HSK326腺頭分泌囊比K326明顯增大，羅丹明著色程度明顯加深，說明其腺毛分泌物，尤其是糖酯的合成和分泌更為旺盛。GC/MS檢測結(jié)果也表明，HSK326腺毛分泌物總量雖然低于T.I.1068，但比K326提高了接近一倍，這與二萜合成關(guān)鍵基因的表達水平普遍提高相一致。腺毛密度的增加可能是導(dǎo)致基因表達水平提高、分泌物含量增加的一個原因。然而HSK326的腺毛密度與K326相比僅提高了38%，但西柏烷二萜含量比K326提高了91%，蔗糖酯含量提高了127%，此外HSK326還表現(xiàn)出腺毛分泌囊增大、著色加深的表型，說明單個腺毛中物質(zhì)合成和分泌能力的增強也促進了腺毛分泌物總量的提高。

采用常規(guī)育種手段對腺毛分泌物含量進行遺傳改良的一個難點是表型鑒定。前人研究表明煙草腺毛分泌物被腺頭細胞分泌出來后會儲存在腺頭部分，形成一個分泌囊[20]，因此分泌囊的大小反應(yīng)了腺毛分泌能力及腺毛分泌物的含量，利用羅丹明B對腺毛染色能夠較為準確的對分泌物中的蔗糖酯進行定量[21]，染色越深，糖酯含量越高。在HSK326選育過程中我們采用了比較腺毛分泌囊的大小結(jié)合化學(xué)染色的方法，有效解決了表型鑒定困難的問題。利用這兩種觀察方法在苗期就可以完成表型觀察及候選單株的確定，從而省去了大群體的田間種植及分泌物提取檢測的過程，有效提高了煙草腺毛分泌能力品種選育的效率，對于煙草高香氣育種工作具有重要的參考意義。

從分泌物組成成分來看，HSK326與K326的二萜組成一致，都只含有西柏烷化合物，缺少冷杉醇、賴百當(dāng)二醇等賴百當(dāng)化合物。雖然，賴百當(dāng)二萜合成途徑關(guān)鍵基因NtCPS2在HSK326與K326中都能正常表達，但序列測定發(fā)現(xiàn)T.I.1068和K326在NtCPS2基因1542 bp處存在一個G/T的SNP，K326中的T堿基能引起翻譯提前終止，造成腺毛分泌物中不含有賴百當(dāng)二萜。HSK326中對應(yīng)位置與K326相同，也為T堿基，使HSK326獲得了K326中賴百當(dāng)化合物缺失的特性。賴百當(dāng)類物質(zhì)會影響烤煙的香氣風(fēng)格，例如含有冷杉醇的“豫煙11”[11]、“大白筋”[22]都具有明顯的晾曬煙風(fēng)味。因此賴百當(dāng)類物質(zhì)的缺失對HSK326保持烤煙的香氣風(fēng)格至關(guān)重要。另外，HSK326與K326都只含有I-II型蔗糖酯，缺少III-VI型蔗糖酯。據(jù)Vontimitta等人報道[6]，III-VI型蔗糖酯合成基因BMVSE與冷杉醇合成基因NtCPS2呈現(xiàn)緊密連鎖狀態(tài)。因而，III-VI型蔗糖酯與冷杉醇常常共存于香料煙、雪茄等晾曬煙中，而在烤煙、白肋煙中則不含這兩類物質(zhì)。蔗糖酯對卷煙具有增香保潤、增加甜感、改善吃味的作用[23]，至于III-VI型蔗糖酯對烤煙風(fēng)格的影響還未見有報道。我們在BC5F2群體的篩選中，也發(fā)現(xiàn)了打破BMVSE與NtCPS2連鎖的材料，不含冷杉醇但含有III-VI型蔗糖酯。對該材料的進一步分析，有望闡明蔗糖酯不同組分對烤煙風(fēng)格的影響。

4 結(jié)論

本研究將K326與T.I.1068進行雜交，以K326為輪回親本進行連續(xù)回交，最終篩選獲得高分泌型K326近等系HSK326。HSK326在保持與K326植物學(xué)性狀基本一致的同時，葉面腺毛密度增加、分泌能力增強、分泌物含量顯著提高；而且，腺毛分泌物組分與K326高度一致，保持典型的烤煙葉面化學(xué)特征，具有較大的應(yīng)用潛力。