翟春賀，王浩，李怡博，蘇夢迪，郭豪，楊永霞，張松濤*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州農(nóng)業(yè)路63號(hào) 450002；

2 廣東煙草韶關(guān)市有限公司，廣東韶關(guān)北江中路27號(hào) 512000

真核翻譯起始因子2（eukaryotic Initiation Factor 2，eIF2）是調(diào)控蛋白翻譯起始階段的關(guān)鍵因子。eIF2的α亞基發(fā)生磷酸化修飾后，可抑制蛋白質(zhì)翻譯起始。目前，在動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)四種可磷酸化eIF2α的蛋白激酶，包括PKR（protein kinase double-stranded RNA-dependent）、HRI（heme-regulated inhibitor）、PERK（PKR-like endoplasmic reticulum kinase） 和GCN2（General Control Non-derepressible 2）。在動(dòng)物和芽殖酵母中，當(dāng)氨基酸缺乏時(shí)，GCN2介導(dǎo)的eIF2α磷酸化可以降低翻譯起始速率，同時(shí)激活氨基酸合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而應(yīng)對(duì)氨基酸缺乏[1-2]。在植物中，目前只發(fā)現(xiàn)GCN2一種蛋白激酶可使eIF2α磷酸化，暗示著GCN2在植物營養(yǎng)缺乏中起重要作用。

植物GCN2在多種組織中均可表達(dá)。在擬南芥和煙草中，AtGCN2和NtGCN2在根、莖、葉、花中均可表達(dá)[3]。其中，NtGCN2在葉片中表達(dá)量最高，在根和莖中表達(dá)量最低。此外，GCN2還參與植物生長發(fā)育的調(diào)控。在擬南芥中，gcn2突變會(huì)導(dǎo)致種子萌發(fā)延遲，葉片變長，葉綠素含量降低[4]。GCN2還可以響應(yīng)多種生物和非生物脅迫[5-10]。紫丁香假單胞菌和黃斑病菌ES4326侵染擬南芥時(shí)，GCN2被激活并磷酸化eIF2α，同時(shí)在侵染前期正調(diào)控ABA生物合成[11]。在煙草中，煙粉虱侵染也可以激活煙草GCN2的表達(dá)[13]。此外，低溫、鹽脅迫、UV輻射、干旱和冷害等非生物脅迫均能激活GCN2的表達(dá)[3,12-13]。

植物激素是由植物自身代謝產(chǎn)生的一類有機(jī)物質(zhì)，在極低的濃度下就對(duì)植物生長發(fā)育有明顯生理效應(yīng)，在植物生長發(fā)育過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，GCN2可被多種植物激素激活，包括壬二酸（AZA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）等[3,12-13]。茉莉酸甲酯和水楊酸均是植物生長發(fā)育及抗逆反應(yīng)中起重要作用的內(nèi)源性激素，其中水楊酸是植物系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic Acquired Resistance，SAR）的重要信號(hào)分子[14-15]，而茉莉酸甲酯參與了植物防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。噴施茉莉酸甲酯和水楊酸可激活A(yù)tGCN2[4,12]，表明GCN2可能在植物防御食草昆蟲中發(fā)揮了重要作用。脫落酸（ABA）是一種應(yīng)激激素，在植物遭受干旱和鹽脅迫時(shí)迅速積累，參與植物逆境響應(yīng)[16]。擬南芥受到病原菌侵染時(shí)，GCN2參與了ABA信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而關(guān)閉氣孔，限制病原體進(jìn)入[11]。AZA是植物生物脅迫和非生物脅迫下脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，它能夠引起植物中SA的積累進(jìn)而引發(fā)防御反應(yīng)[17]。在擬南芥和煙草中，一定濃度的壬二酸處理可激活GCN2[3,12]。這些研究結(jié)果表明GCN2可以響應(yīng)多種植物激素，廣泛參與了植物對(duì)各種脅迫的應(yīng)答。

目前啟動(dòng)子的相關(guān)研究主要集中在組織特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和合成啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用等方面[18-22]。組織特異性啟動(dòng)子如牽牛子綠色組織特異性PNZIP（pharbitis nil leucine zipper）啟動(dòng)子和煙草腺毛特異表達(dá)的TTR1啟動(dòng)子（Transthyretin 1）。前者可以驅(qū)動(dòng)外源基因在綠色組織中高表達(dá)，后者可以在腺毛中特異表達(dá)外源基因。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PR1aP（Pathogenesis-related genes la）具有水楊酸誘導(dǎo)性[23-25]。合成啟動(dòng)子由核心啟動(dòng)子區(qū)和應(yīng)答元件組合而成，也可以通過構(gòu)建啟動(dòng)子文庫合成[21]。研究發(fā)現(xiàn)，根特異性順式作用元件模塊與玉米泛素基因啟動(dòng)子PortUbi882（Porteresia ubiquitin）上86 bp核心序列融合而成的合成啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草的根部特異性表達(dá)[26]。此外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)通過敲除或插入應(yīng)答元件探究啟動(dòng)子功能也是啟動(dòng)子研究的一種重要手段[27]。

目前關(guān)于GCN2的研究大多集中在動(dòng)物和芽殖酵母中[28-29]，植物GCN2的研究主要集中在模式植物擬南芥，但目前有關(guān)GCN2啟動(dòng)子的研究尚未見報(bào)道，其調(diào)控機(jī)制尚不明確。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)煙草NtGCN2包含了NtGCN2-1和NtGCN2-2兩個(gè)拷貝，二者在進(jìn)化上分別來自于其親本林煙草和絨毛狀煙草[12]。本研究從煙草中克隆了NtGCN2-1上游2000 bp的啟動(dòng)子NtGCN2-Nsy-pro2000，構(gòu)建了NtGCN2-Nsy-pro2000驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化煙草后分析煙草NtGCN2啟動(dòng)子在不同植物激素處理下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究GCN2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了資料。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：N. tabacumK326種植在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草栽培生理生化研究基地實(shí)驗(yàn)室。

菌株和載體：pCAMBIA-NPT-GUS載體為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草栽培生理生化研究基地保存，大腸桿菌Escherichia coliDH5α，農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciensEHA105感受態(tài)購于諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 啟動(dòng)子克隆及質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)NtGCN2基因上游2000 bp序列設(shè)計(jì)引物（表1），以煙草K326基因組DNA為模板擴(kuò)增NtGCN2上游啟動(dòng)子序列，將NtGCN2-Nsy-pro2000連接至pCAMBIA-NPT-GUS載體的HindIII和EcoRI位點(diǎn)，替代原有的35S啟動(dòng)子，將獲得的表達(dá)載體pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliDH5α，挑選陽性菌落鑒定后進(jìn)行測序。

表1 本實(shí)驗(yàn)用到的引物Tab. 1 The primers used in this study

1.2.2NtGCN2啟動(dòng)子序列分析

采 用Plant CARE (http//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE數(shù)據(jù)庫（https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace）分 析啟動(dòng)子序列并預(yù)測應(yīng)答元件。

1.2.3 煙草遺傳轉(zhuǎn)化及PCR鑒定

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法[30]將NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS片段轉(zhuǎn)入煙草K326中，獲得轉(zhuǎn)基因株系。

提取轉(zhuǎn)基因植株DNA，采用GUS-F/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.4 激素處理

選取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d的轉(zhuǎn)基因煙苗進(jìn)行處理，將過濾后的激素（1 mmol/L SA、0.1 mmol/L MeJA、0.1 mmol/L ABA、0.1 mmol/L AZA，SA、MeJA、 ABA和AZA購自生工生物工程有限公司）用干凈的噴壺均勻噴灑到煙草幼苗上，分別在噴施0 h、24 h、48 h后取培養(yǎng)基上幼苗8～10棵用于GUS基因分析和GUS酶活性檢測。

1.2.5 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用艾德萊試劑公司植物總RNA快速通用試劑盒提取上述待測樣品總RNA，諾唯贊生物科技有限公司HiScript? II Reverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以轉(zhuǎn)基因煙草cDNA為模板，采用L25和GUS上下游引物對(duì)進(jìn)行定量PCR（表1）。反應(yīng)體系為：2 μL模板，0.5 μL上下游引物，10 μL SYBR Green Mix，7 μL ddH2O。反應(yīng)程序采用95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；70℃-95℃獲得溶解曲線。以L25為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算定量結(jié)果。

1.2.6 GUS組織化學(xué)染色

取待測樣品浸入-20℃預(yù)冷的90%丙酮，冰上靜置15 min。將樣品浸入GUS染液（10 mmol/L Na2EDTA、1 mmol/L K3[Fe(CN)6]、1 mmol/L K4[Fe(CN)6]、0.5% Triton X-100、20%甲醇、pH為7的100 mmol/L磷酸緩沖溶液、1 mg/mL X-Gluc），37℃過夜。采用75%～95%乙醇進(jìn)行梯度脫色至透明，觀察染色情況并拍照。

1.2.7 GUS酶活性分析

取100 mg待測樣品液氮研磨粉碎，置入2 mL離心管，加入1 mL GUS酶提取液（100 mL pH為7的0.1 M 磷酸緩沖液，2 mL 10% SDS溶液，4 mL pH為8的0.5 M EDTA溶液，200 μL Triton X-100溶液，β-巰基乙醇200 μL，混勻后定容至200 mL），混勻后在12000 rpm離心5 min（4℃），將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，-80℃保存待用。

采用Bradford法測定蛋白濃度，取20 μL蛋白上清，加入80 μL 37℃預(yù)熱的GUS酶提取液，再加入100 μL 底物MUG，37℃溫浴30 min。365 nm激發(fā)波長，455 nm發(fā)射波長，狹縫10 nm條件下測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 啟動(dòng)子序列克隆與分析

2.1.1NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

以煙草K326基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1A所示。對(duì)獲得的重組載體進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖1B所示。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為2000 bp，均與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果表明pCAMBIANPT-NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS載體構(gòu)建成功。

圖1 PCR擴(kuò)增NtGCN2-Nsy-pro2000片段與重組載體鑒定Fig.1 PCR amplification of the NtGCN2-Nsy-pro2000 and identification of the recombinant vector

2.1.2NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子序列分析

對(duì)獲得的NtGCN2-Nsy-pro2000序列進(jìn)行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，該序列含有高等植物啟動(dòng)子核心區(qū)域和上游調(diào)控區(qū)。其上游調(diào)控區(qū)分布著多種脅迫響應(yīng)元件，包括干旱誘導(dǎo)元件（MBS）、脫落酸應(yīng)答元件（ABRE）、與茉莉酸甲酯應(yīng)答相關(guān)的基序（TGACG-motif）、乙烯應(yīng)答元件（ERE）、光響應(yīng)元件（AE-box）、厭氧誘導(dǎo)應(yīng)答元件（ARE）以及參與防御和脅迫應(yīng)答的元件（TC-rich repeasts）（表2）。

表2 NtGCN2-Nsy-pro2000順式作用元件預(yù)測Tab. 2 Prediction of NtGCN2-Nsy-pro2000 cis-acting elements

將獲得的NtGCN2-Nsy-pro2000與不同煙草中GCN2啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)分析。BLAST分析結(jié)果顯示NtGCN2-Nsy-pro2000與NsyGCN2-pro相似度高達(dá)98.9%（數(shù)據(jù)未顯示）。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙草GCN2啟動(dòng)子在進(jìn)化上分為兩種類型，其中NtGCN2-Nsy-pro2000、弱毒煙草NatGCN2-pro（N. attenuata）、白肋煙TN90GCN2-X3-pro（N. tabacum TN90 X3）與林煙草NsyGCN2-pro（N. sylvestris）在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近。白肋煙TN90GCN2-pro（N. tabacum TN90）與絨毛狀煙草NtoGCN2-pro（N. tomentosiformis）在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近（圖2）。這些結(jié)果表明NtGCN2-Nsypro2000在進(jìn)化上可能來自林煙草。

圖2 不同品種煙草GCN2啟動(dòng)子的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 The phylogenetic analysis of the GCN2 promoter from different tobacco varieties

2.2 NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS的遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖3所示。未侵染菌液的K326葉片在含有卡那霉素的分化培養(yǎng)基上逐漸發(fā)白死亡（圖3A），而在不含卡那霉素的分化培養(yǎng)基上正常分化（圖3B），NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS轉(zhuǎn)基因葉片分化出不定芽（圖3C），將其移至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因植株（圖3D）。

圖3 NtGCN2-Nsy-pro2000遺傳轉(zhuǎn)化Fig.3 Genetic transformation of NtGCN2-Nsy-pro2000

2.3 轉(zhuǎn)基因株系篩選與鑒定

2.3.1 組織化學(xué)染色分析

對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行GUS化學(xué)染色，結(jié)果如圖4所示。其中，CaMV35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株和NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株葉片均被染上藍(lán)色。該結(jié)果初步表明NtGCN2-Nsy-pro2000具有啟動(dòng)子活性，并在葉片中表達(dá)量最高，該結(jié)果與擬南芥和煙草中的基因表達(dá)結(jié)果相一致[4,12]。

圖4 轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的GUS組織化學(xué)染色Fig.4 The GUS staining of transgenic tobacco seedlings

2.3.2 PCR鑒定

以提取轉(zhuǎn)基因煙草植株的DNA為模板，采用GUS-F/R引物進(jìn)行DNA鑒定，結(jié)果如圖5所示。其中，以質(zhì)粒為模板的陽性對(duì)照擴(kuò)增出250 bp左右的條帶，而以提取的K326植株DNA為模板的陰性對(duì)照未擴(kuò)增出條帶，NtGCN2-Nsy-pro2000轉(zhuǎn)基因株系擴(kuò)增產(chǎn)物與陽性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致。該結(jié)果說明pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS載體成功整合至煙草K326的基因組中。

圖5 轉(zhuǎn)基因煙草的DNA-PCR鑒定Fig.5 DNA-PCR identification of transgenic tobacco

2.4 不同植物激素處理下NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子表達(dá)分析

采用SA處理NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因幼苗后，轉(zhuǎn)基因植株GUS基因表達(dá)和酶活測定結(jié)果如圖6A所示。結(jié)果表明，SA處理后，GUS表達(dá)量和酶活性均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。其中，SA處理24 h后，GUS表達(dá)量和酶活性最高。GUS基因表達(dá)量結(jié)果表明，SA處理24 h和48 h后GUS基因表達(dá)量顯著高于0 h。GUS酶活性分析發(fā)現(xiàn)，SA處理24 h后GUS酶活性提高，48 h后下降。這些結(jié)果表明SA處理24 h激活GCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子的表達(dá)。

MeJA處理NtGCN2-Nsy-pro2000轉(zhuǎn)基因幼苗后，轉(zhuǎn)基因植株GUS基因表達(dá)和酶活性分析如圖6B所示。結(jié)果表明，MeJA處理后GUS基因表達(dá)和酶活性呈下降趨勢。MeJA處理24 h和48 h后，GUS表達(dá)量與0 h相比顯著下降。GUS酶活性測定結(jié)果表明，在處理24 h和48 h后，GUS酶活性顯著下降，與GUS基因表達(dá)結(jié)果一致。這些結(jié)果表明MeJA抑制GCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子的表達(dá)。

ABA處理NtGCN2-Nsy-pro2000轉(zhuǎn)基因幼苗后，轉(zhuǎn)基因植株GUS基因表達(dá)和酶活性分析如圖6C所示。結(jié)果表明，ABA處理后，GUS基因表達(dá)量呈上升趨勢而GUS酶活性呈先上升后下降趨勢。ABA處理24 h和48 h后，GUS基因表達(dá)量持續(xù)增加。GUS酶活性測定在ABA處理24 h后顯著增加，處理48 h后顯著低于對(duì)照0 h。這些結(jié)果表明ABA處理可以激活GCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子的表達(dá)活性。

AZA處理NtGCN2-Nsy-pro2000轉(zhuǎn)基因幼苗后，GUS基因定量表達(dá)和酶活性分析結(jié)果如圖6D所示。結(jié)果表明，AZA處理后GUS基因表達(dá)量呈上升趨勢而酶活性呈先下降后上升趨勢。處理48 h后GUS基因表達(dá)量是0 h的3.27（±0.05）倍，GUS酶活性是0 h的1.14（±0.02）倍。這些結(jié)果表明，NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子的表達(dá)活性在AZA處理48 h達(dá)到最大。

3 討論

在植物中，GCN2廣泛參與了多種生物和非生物脅迫應(yīng)答[3-4]。此外，GCN2也可以被多種植物激素（SA、MeJA、AZA等）所激活[3-4,12]。本研究克隆了煙草NtGCN2基因啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子中存在眾多脅迫應(yīng)答元件，分析了不同植物激素處理下NtGCN2基因啟動(dòng)子的表達(dá)。

圖6 SA、MeJA、ABA及AZA處理對(duì)轉(zhuǎn)基因株系GUS基因表達(dá)量和酶活性的影響Fig.6 Effects of SA, MeJA , ABA and AZA treatments on the expression and enzymatic activity of GUSin transgenic lines

啟動(dòng)子通常位于基因上游，包含典型的核心啟動(dòng)子區(qū)和調(diào)控區(qū)，是基因表達(dá)的重要調(diào)控元件。本研究克隆的NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子有典型的高等植物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，調(diào)控區(qū)域存在諸多順式作用元件，如干旱誘導(dǎo)元件（MBS）、脫落酸應(yīng)答元件（ABRE）、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件（TGACG-motif）、乙烯應(yīng)答元件（ERE）、光響應(yīng)元件（AE-box）、厭氧誘導(dǎo)應(yīng)答元件（ARE）以及參與防御和脅迫應(yīng)答元件（TCrich repeasts）。在擬南芥和煙草中，GCN2可以響應(yīng)干旱和冷害等非生物脅迫應(yīng)答，同時(shí)也參與了SA、ABA、MeJA和AZA等植物激素應(yīng)答[3,12]，這可能與NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子上含有眾多順式作用元件有關(guān)。

在煙草中，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)NtGCN2基因存在兩個(gè)拷貝NtGCN2-1和NtGCN2-2，二者分別來自于其親本林煙草和絨毛狀煙草[4,10]。本實(shí)驗(yàn)克隆了NtGCN2-1基因上游2000 bp的啟動(dòng)子NtGCN2-Nsypro2000，系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子序列與林煙草啟動(dòng)子序列相似度高達(dá)98.9%，這與NtGCN2-1在進(jìn)化上來源于林煙草的結(jié)論一致[4,10]。

在煙草和擬南芥中，GCN2基因在根、莖、葉和花中均有表達(dá)[4,12]。煙草中，葉片中GCN2-1基因表達(dá)量最高，花莖次之，根中最低。本研究發(fā)現(xiàn)NtGCN2-Nsy-pro2000轉(zhuǎn)基因株系幼苗的葉片中GUS染色最深，而在根和莖中未發(fā)現(xiàn)藍(lán)色。該結(jié)果與NtGCN2在煙草中基因表達(dá)量結(jié)果相一致[4,12]。另外，盡管在根中未檢測到染色，但基因表達(dá)結(jié)果表明其在根中有相對(duì)較低的表達(dá)。同時(shí)，擬南芥AtGCN2在根、莖、葉、花和角果中均有表達(dá)[4]，因此推測該啟動(dòng)子可能不具有組織特異性。

GCN2在動(dòng)物和芽殖酵母中能夠被氨基酸等營養(yǎng)缺乏激活，進(jìn)而磷酸化eIF2α調(diào)節(jié)蛋白合成以應(yīng)對(duì)脅迫和維持生存。GCN2在植物逆境脅迫中起重要作用。擬南芥和煙草中，GCN2廣泛參與了各種生物和非生物脅迫（植物激素、干旱、低溫、鹽害和病蟲害等）應(yīng)答[12,14,31]。本研究中，NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)其上含有包括茉莉酸甲酯和脫落酸等植物激素應(yīng)答元件在內(nèi)的諸多順式作用元件。植物激素ABA在植物抗逆中起重要作用，當(dāng)植物受到干旱和鹽脅迫時(shí)，植物體內(nèi)ABA迅速積累以響應(yīng)逆境[32]。在擬南芥和煙草中，GCN2能被ABA激活[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)NtGCN2-Nsy-pro2000序列上存在一個(gè)ABA應(yīng)答元件（-1292 bp～-1298 bp），ABA處理激活了NtGCN2-Nsy-pro2000驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)。因此，推測ABA可能通過與啟動(dòng)子中ABA應(yīng)答元件相互作用激活了GCN2的表達(dá)。茉莉酸甲酯可誘導(dǎo)激活植物防御機(jī)制，外源茉莉酸甲酯可激活植物對(duì)干旱、低溫和鹽脅迫等逆境的響應(yīng)[33-35]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NtGCN2-Nsy-pro2000上含有兩個(gè)MeJA應(yīng)答元件（-131 bp～-135 bp，-840 bp～-844 bp），MeJA激素處理結(jié)果表明MeJA抑制了NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子活性，該結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)MeJA處理抑制了NtGCN2基因表達(dá)的結(jié)論相一致[12]。水楊酸是一種天然的植物激素信號(hào)分子，大量研究表明一定濃度的外源SA可以減輕鹽脅迫對(duì)植物造成的危害[36-41]。在擬南芥和煙草中，SA處理激活了GCN2基因的表達(dá)[12,14]。本研究發(fā)現(xiàn)雖然NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子上未預(yù)測到SA應(yīng)答元件，但是SA處理24 h激活了NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)。該結(jié)果與擬南芥、煙草中SA激活GCN2基因表達(dá)的結(jié)果相一致。AZA是激活植物防御基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑，在系統(tǒng)獲得性抗性防御中起誘導(dǎo)作用[42]。在擬南芥和煙草中，AZA處理均激活了GCN2基因的表達(dá)，這與本研究中AZA處理48 h激活NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)的結(jié)果相一致[12,14]。雖然在NtGCN2-Nsy-pro2000序列上未發(fā)現(xiàn)AZA和SA應(yīng)答元件，但是SA和AZA處理后GCN2基因和NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因均被激活，說明NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子上可能存在著未預(yù)測到的SA和AZA應(yīng)答元件，或者存在其它未知的調(diào)控機(jī)制。此外，缺失突變分析發(fā)現(xiàn)玉米亞硫酸氧化酶基因（ZmSO）啟動(dòng)子上含有的119 bp DNA元件能被ABA和干旱激活[43]；柑橘CsLCYb1（Lycopene β-cyclase）基因啟動(dòng)子含有的增強(qiáng)子元件可區(qū)分不同的柑橘種類[44]；小麥TaSnRK2（sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2）基因啟動(dòng)子TaSnRK2.8區(qū)域存在著莖特異性元件（-1481～-821）、葉特異性元件和根特異性元件（-2631～-1481 之間）[45]。因此，研究將進(jìn)一步對(duì)NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子進(jìn)行5’端缺失突變分析，明確其順式作用元件的功能，為GCN2啟動(dòng)子調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆了NtGCN2上游2000 bp序列，構(gòu)建了NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS啟動(dòng)子表達(dá)載體，并獲得了啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因株系。分析了NtGCN2-Nsypro2000啟動(dòng)子在四種植物激素脅迫下的表達(dá)，初步探究NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子的功能，得出以下結(jié)論：（1）克隆的NtGCN2上游2000 bp基因序列具有啟動(dòng)子活性，在進(jìn)化上可能來源于其親本林煙草。（2）NtGCN2-Nsy-pro2000驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)在四種激素處理下有不同的響應(yīng)模式，AZA、ABA和SA激活NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)，而MeJA抑制了NtGCN2-Nsy-pro2000啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)。本研究從啟動(dòng)子入手探究了GCN2的表達(dá)模式，為GCN2調(diào)控機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。