楊飛，紀(jì)元，劉珊珊*，王穎，范子彥，鄧惠敏，邊照陽，陳曉水，唐綱嶺

1 國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)翠竹街6號 450001；

2 浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，杭州市西湖區(qū)科海路118號 310024

近年來，加熱煙草制品（HTPs）在市場上的占有率逐年上升，而對于加熱煙草制品的研究也逐漸成為當(dāng)前的熱點[1-2]。加熱煙草制品是利用特殊熱源對由煙絲或其它煙草材料制備的煙芯進(jìn)行加熱（150℃～500℃），產(chǎn)生可吸入氣溶膠。加熱煙草制品因其無需高溫燃燒煙草，僅在相對低溫下對煙草原料進(jìn)行加熱，減少了煙草高溫燃燒裂解產(chǎn)生的有害成分，但同時增加了某些農(nóng)藥殘留的轉(zhuǎn)移風(fēng)險[3-5]。

蔬菜、水果及煙草等農(nóng)作物在種植和儲藏期間均會普遍施用農(nóng)藥防治病蟲害，以提高產(chǎn)量并獲得高質(zhì)量的產(chǎn)品。但是，農(nóng)作物中的農(nóng)藥殘留可能對人類健康產(chǎn)生諸多不利影響。由于農(nóng)藥種類多，性質(zhì)差異較大，且農(nóng)藥殘留含量低，很難采用單一的分析方法對多農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測。目前，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC -MS/MS）[6-8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）[9-10]已經(jīng)成為測定多種基質(zhì)中的多種農(nóng)藥殘留的“金標(biāo)準(zhǔn)”。串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）由兩個或更多的質(zhì)譜串接而成，最簡單的串聯(lián)質(zhì)譜由兩個質(zhì)譜串聯(lián)而成。第一級質(zhì)譜使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的母離子，母離子經(jīng)過氮氣、氬氣等碰撞氣碰撞產(chǎn)生碎片離子，碎片離子經(jīng)過第二級質(zhì)譜進(jìn)行質(zhì)量分析。串聯(lián)質(zhì)譜具有高靈敏度和高選擇性，是一種分析復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的有效手段。

煙草基質(zhì)復(fù)雜，色素、脂質(zhì)等含量較高，對樣品中的痕量農(nóng)藥殘留進(jìn)行分析前，需要進(jìn)行前處理去除基質(zhì)干擾以提高方法的靈敏度和特異性?，F(xiàn)有分析方法多采用固相萃?。⊿PE）[6]和QuEChERS[7-10]技術(shù)凈化樣品。但這些方法前處理過程繁瑣，耗時長。PRiME（process，robustness，improvements，matrix effects, ease of use）HLB柱是一種新型親水親脂平衡萃取柱，其特有的親脂基團(tuán)可以有效地吸附煙草中的色素和磷脂類物質(zhì)。與傳統(tǒng)的固相萃取柱相比，PRiME HLB固相萃取柱是一種通過式固相萃取柱，不需要活化/平衡、清洗或洗脫步驟，樣品提取液依靠重力通過PRiME HLB柱并收集，雜質(zhì)被吸附在固相萃取柱上。PRiME HLB通過式固相萃取具有簡單、高效、環(huán)保且易于操作的優(yōu)勢，尤其適用于復(fù)雜樣品中分析物的高通量分析[11-15]。

本方法采用PRiME HLB通過式固相萃取凈化、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測加熱卷煙中的殺菌劑、殺蟲劑和除草劑等53種常見的農(nóng)藥殘留，旨在為加熱卷煙中多農(nóng)殘的檢測提供了準(zhǔn)確、便捷、快速的分析平臺。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

25個不同品牌的加熱卷煙樣品全部采購于國外市場。所有樣品除去濾嘴和卷煙紙后，將煙絲粉碎，并過2 mm（10目）篩后貯存于棕色玻璃瓶中，4℃下保存。

22種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ（100 μg/mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）；31種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ（100 μg/mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）；內(nèi)標(biāo)d4-三唑酮和三苯基磷酸酯（1 mg，純度大于98.0%，德國Augsburg公司）；乙腈、甲苯和甲酸（色譜純，德國Merck公司）；無水硫酸鎂（MgSO4）、氯化鈉（NaCl）、乙二胺基-N-丙基（PSA）（分析純，上海百靈威科技股份有限公司）；水為超純水；高純氮、高純氬、高純氦（純度＞ 99.999%，鄭州源正科技）。PRiME HLB通過式固相萃取柱（60 mg，3 cc，美國Waters公司）。

ACQUITY I class超高效液相色譜儀、Xevo-TQS四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧電離源，美國Waters公司）；Agilent 7890B-5977A氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent科技有限公司）；ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；Turbo Vap氮吹儀（美國Biotage公司）；VX200渦旋振蕩儀（美國Labnet公司）；SG3-30K高速離心機（德國Sigma公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；BSA2245-CW電子天平（感量：0.0001 g，德國Sartorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 LC-MS/MS用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

將1.0 mg內(nèi)標(biāo)d4-三唑酮用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制得內(nèi)標(biāo)工作液Ⅰ（10 μg/mL）。

移取1.0 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，制得的質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液Ⅰ。

分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液Ⅰ 500、200、100、50、20 μL至5個10 mL容量瓶中，并加入100 μL內(nèi)標(biāo)工作液Ⅰ，用超純水定容，制得質(zhì)量濃度分別為500、200、100、50及20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液Ⅰ。

分別移取0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液Ⅰ和0.2 mL空白樣品提取液，混合后用超純水稀釋至1 mL，即得到基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液Ⅰ。所有溶液避光儲存在4℃的冰箱中，使用前將其恢復(fù)至室溫。

1.2.2 GC-MS/MS用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

將1.0 mg內(nèi)標(biāo)三苯基磷酸酯用甲苯溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度，制得內(nèi)標(biāo)工作液Ⅰ（20 μg/mL）。

移取1.0 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ于10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度，制得的質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液Ⅱ。

分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液Ⅱ 500、200、100、50、20 μL至5個10 mL容量瓶中，并加入200 μL內(nèi)標(biāo)工作液Ⅱ，用甲苯定容，制得質(zhì)量濃度分別為500、200、100、50及20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液Ⅱ。

分別取5份空白提取液各1 mL，置于氮吹濃縮儀適用的試管中，在氮吹濃縮儀上濃縮近干，再分別加入1 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液Ⅱ，攪拌復(fù)溶，即得到基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液Ⅱ。

所有溶液避光儲存在4℃的冰箱中，使用前將其恢復(fù)至室溫。

1.2.3 煙絲樣品的提取和凈化

稱取2 g粉碎后的樣品（精確至0.01 g）于50 mL具蓋離心管中，加入10 mL水，振蕩，讓水充分浸潤樣品。移取10 mL乙腈至離心管中，并加入100 μL內(nèi)標(biāo)工作液Ⅰ和200 μL內(nèi)標(biāo)工作液Ⅱ，然后將離心管置于渦漩混合振蕩儀上以2000 r/min的速率振蕩2 min。然后向離心管中加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸二氫鈉，立即于漩渦混合振蕩儀上以2000 r/min振蕩2 min，然后以5000 r/min離心5 min。

移取2.0 mL的上清液到PRiME HLB柱中，且在重力作用下讓其自然通過小柱，收集濾液。濾液經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾后，移取200 μL用乙腈稀釋至1 mL進(jìn)LC-MS/MS檢測。

在上述50 mL的離心管中繼續(xù)加入5 mL甲苯，渦旋混勻2 min，然后以5000 rpm離心5 min。移取2.0 mL的提取液到PRiME HLB柱中，且在重力作用下讓其自然通過小柱，并收集濾液。濾液經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾后進(jìn)GC-MS/MS檢測。

1.2.4 空白樣品的提取

稱取2 g空白樣品于50 mL具蓋離心管中，加入10 mL水和10 mL乙腈至離心管中，然后將離心管置于渦漩混合振蕩儀上以2000 r/min的速率振蕩2 min。然后向離心管中加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸二氫鈉，立即于漩渦混合振蕩儀上以2000 r/min振蕩2 min，然后以5000 r/min離心5 min。

移取2.0 mL的上清液到PRiME HLB柱中，且在重力作用下讓其自然通過小柱，收集濾液。濾液經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾，該溶液用于制備LC-MS/MS用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

在上述50 mL的離心管中繼續(xù)加入5 mL甲苯，渦旋混勻2 min，然后以5000 rpm離心5 min。移取2.0 mL的提取液到PRiME HLB柱中，且在重力作用下讓其自然通過小柱，并收集濾液。濾液經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾，該溶液用于制備GC-MS/MS用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 實驗條件

1.3.1 LC-MS/MS分析條件

ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：A相為乙腈，B相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～0.50 min為10% A，0.50～9.00 min為10% A～100% A，9.00～12.25 min為100% A，12.25～12.35 min為100% A～10% A，12.35～15.00 min為10% A。質(zhì)譜掃描方式：正離子掃描；離子源：電噴霧電離源（ESI）；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔氣流量：60 L/h；毛細(xì)管電壓：2.6 KV；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；質(zhì)譜參數(shù)見表1。內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)為d4-三唑酮。

表1 分析物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Tab. 1 LC-MS/MS parameters for analytes

續(xù)表1

1.3.2 GC-MS/MS分析條件

色譜柱：Agilent HP -5MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；PTV進(jìn)樣口，初始溫度70℃，進(jìn)樣后以4℃/s升至280℃；進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣；載氣：氦氣，恒流模式，流速為1.2 mL/min；柱溫箱升溫程序：初始溫度為90℃，初始時間為5 min；以25℃/min速率由90℃升至180℃，保持15 min；然后以5℃/min升至280℃，保持6.5 min；然后以40℃/min升至300℃，保持5 min；EI電離模式，電離能70 eV；離子源溫度250℃，傳輸線溫度280℃；碰撞氣：氮氣，0.16 MPa；溶劑延遲：5 min；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；質(zhì)譜參數(shù)見表2。內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)為三苯基磷酸酯。

表2 分析物的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Tab. 2 GC-MS/MS parameters for analytes

續(xù)表2

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化效果的比對

為驗證方法優(yōu)越性，將PRiME通過式固相萃取的凈化效果與PSA分散固相萃取的凈化效果[11-12]進(jìn)行了比較，以基質(zhì)效應(yīng)（ME）的大小進(jìn)行表征。其中，基質(zhì)效應(yīng)的計算公式為ME=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率-1）× 100%。ME絕對值越大表明基質(zhì)效應(yīng)越強[13]。部分農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)見表3。結(jié)果顯示，經(jīng)PRiME HLB柱凈化后，大部分農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)與PSA分散固相萃取方法相當(dāng)，個別農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)明顯低于PSA分散固相萃取方法。且經(jīng)PRiME凈化后的提取液較PSA分散固相萃取凈化后的提取液顏色更淺（如圖1）。因此本研究采用PRiME HLB通過式固相萃取柱凈化樣品。該方法僅需樣液上柱，無需活化、淋洗、洗脫等步驟，操作更快捷方便，且PRiME HLB固相萃取柱填料因鍵合特有親脂基團(tuán)，能有效吸附煙草基質(zhì)中的磷脂、脂肪、色素等干擾物，從而實現(xiàn)樣品凈化目的。樣品經(jīng)PRiME HLB固相萃取和PSA分散固相萃取后部分農(nóng)藥的選擇離子色譜圖如圖2所示。

表3 不同凈化方法基質(zhì)效應(yīng)的對比Tab. 3 Comparison of matrix effects of different purification methods

圖1 不同凈化方法凈化效果的對比Fig.1 Comparison of purification effects of different purification methods

2.2 方法對比

為了驗證PRiME通過式固相萃取方法的準(zhǔn)確性，我們采用YC/T 405.1-2011《煙草及煙草制品 多種農(nóng)藥殘留量的測定 第1部分：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、YC/T 405.2-2011《煙草及煙草制品 多種農(nóng)藥殘留量的測定 第2部分：氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和本方法進(jìn)行了對比實驗。煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 405.1-2011、YC/T 405.2-2011采用QuEChERS法對樣品進(jìn)行提取后、使用PSA進(jìn)行分散固相萃取凈化，然后以LC-MS/MS或GC-MS/MS檢測。采用本方法與煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對2019年和2020年Fapas國際能力驗證的4個樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果（表4）顯示，本方法檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果之間無明顯差異，說明兩種方法的一致性較好。

圖2 100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液中部分農(nóng)藥的選擇離子色譜圖（A）PRiME通過式固相萃?。˙）PSA分散固相萃取Fig.2 MRM chromatograms of some pesticides in 100 ng/mL standard solution (A) PRiME pass-through solid phase extraction (B) PSA dispersive solid phase extraction

表4 不同方法的測定結(jié)果對比Tab. 4 Comparison of testing results of different methods

2.3 方法評價

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

由于加熱卷煙的煙芯基本上都是采用的再造煙葉，國內(nèi)外再造煙葉的原料的不同，因此本文分別考察了烤煙、白肋煙和晾曬煙中部分農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)。如表5所示，GC-MS/MS分析時，基質(zhì)對大部分農(nóng)藥有顯著的增強效應(yīng)，LC-MS/MS分析時，基質(zhì)對大部分農(nóng)藥有顯著的抑制效應(yīng)，因此定量分析均需采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

表5 不同種類樣品基質(zhì)效應(yīng)的對比Tab. 5 Comparison of matrix effects of different types of samples

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

在優(yōu)化的色譜、質(zhì)譜條件下，對配制好的基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液Ⅰ和基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液Ⅱ分別進(jìn)行測定，以目標(biāo)物峰面積和內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），對應(yīng)的質(zhì)量濃度值為橫坐標(biāo)（X，ng/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其線性方程及線性相關(guān)系數(shù)（r）見表6?？梢钥闯?，在20～500 ng/mL 濃度范圍內(nèi)，均能呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9977。將加標(biāo)空白基質(zhì)中產(chǎn)生的信噪比（S/N）等于3的濃度定義為檢出限（LOD），信噪比（S/N）等于10時的濃度為定量限（LOQ）。如表6所示，LOD和LOQ范圍分別在0.31～10.88 μg/kg和1.11～36.21 μg/kg之間。

2.3.3 方法回收率及精密度

采用加標(biāo)回收實驗來測試方法的準(zhǔn)確度和精密度，該方法的精密度由重復(fù)性實驗確定，并以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。在空白樣品中加入總量濃度為0.05、1.0、2.0 mg/kg的混合農(nóng)藥，制備得到3個不同濃度的加標(biāo)樣品，按照上述方法對加標(biāo)樣品進(jìn)行處理，每個濃度的樣品重復(fù)測定5次。結(jié)果（表6）顯示，在所有濃度水平下均獲得令人滿意的平均回收率（77.36%～108.28%），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.4%～7.6%。表明該方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可滿足加熱卷煙中多種農(nóng)藥殘留量的檢測需求。

2.4 實際樣品的檢測

應(yīng)用所建立的方法對國外生產(chǎn)的25個不同品牌的加熱卷煙樣品進(jìn)行檢測，所有樣品檢出殺菌劑，主要是霜霉威和甲霜靈，個別樣品檢出有多菌靈。其中霜霉威的檢出值為0.09～0.45 mg/kg。另外，19批次樣品檢出殺蟲劑吡蟲啉，檢出值為0.10～0.22 mg/kg。有機磷和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥未見檢出。所有檢出值均遠(yuǎn)低于Coresta制定的農(nóng)用化學(xué)品指導(dǎo)性殘留限量。

表6 線性系數(shù)，檢出限，定量限和精密度Tab. 6 Correlation coefficient, LODs, LOQs and precisions

續(xù)表6

3 結(jié)論

通過優(yōu)化質(zhì)譜條件、色譜條件及樣品前處理過程等，建立了LC-MS/MS和GC-MS/MS法結(jié)合PRiME HLB通過式固相萃取測定加熱卷煙中53種農(nóng)藥殘留的方法。在優(yōu)化后的實驗條件下，53種農(nóng)藥的回收率在77.36%～108.28%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.4%～7.6%之間。國際能力驗證實驗結(jié)果表明，該方法可以對盲樣進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析。該方法定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，前處理簡單快速、時間短，能滿足加熱卷煙中多種農(nóng)藥殘留分析的要求，可用于加熱卷煙中農(nóng)藥殘留的實際檢測。