肖慶博 郭 霞 吳麗娥 劉 穎 劉美玉 于文龍 白茹玉 禹延雪

內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭市 014010

腦微出血(Cerebral microbleeds，CMBs)作為腦小血管病的重要影像學(xué)分類之一，通常在T2*加權(quán)梯度回波序列和SWI上多表現(xiàn)為散在的直徑2～5mm、偶最大達(dá)1cm的圓形或類圓形低信號影[1]，且無周圍水腫。在臨床中可無任何癥狀和體征，卻可使患者發(fā)生癡呆、認(rèn)知下降等風(fēng)險增加[2]，甚至導(dǎo)致患者死亡，故視為一種亞臨床損害。 血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性肝素結(jié)合生長因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖進(jìn)而促進(jìn)脆弱血管和淋巴管的新生、增加血管通透性等生物學(xué)特性。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF及其基因多態(tài)性與糖尿病腎病、增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變等微血管損害風(fēng)險增加相關(guān)[3-4]。腦部微血管和糖尿病損傷腎臟、視網(wǎng)膜微血管有著相似的血流動力學(xué)，應(yīng)變著心室收縮期高壓、高速血流沖擊，故推測腦微出血的發(fā)生與VEGF及其基因多態(tài)性具有相關(guān)性。國內(nèi)外目前尚無關(guān)于VEGF及其基因多態(tài)性與腦微出血相關(guān)性文獻(xiàn)報道，本研究旨在探討VEGF及VEGF-2578C/A基因多態(tài)性與腦微出血的關(guān)系，為腦微出血防治提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 將2017年12月—2019年12月于我院神經(jīng)內(nèi)二科診治的76例腦微出血患者設(shè)為病例組，同期75例無腦微出血患者為對照組，根據(jù)2015年《中國腦小血管病診治專家共識》CMBs的影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)診斷CMBs：磁共振SWI序列上圓形或卵圓形、質(zhì)地均一，直徑2～5mm 且周圍無水腫的低信號病灶，并除外顱內(nèi)鈣化。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲；(2)入院完善各項抽血化驗且經(jīng)頭顱MRI和SWI檢查確診的CMBs患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)≤14d的急性腦血管病患者；(2)影像學(xué)疑似多發(fā)性硬化、視神經(jīng)脊髓炎等白質(zhì)變性疾??；(3)經(jīng)頭顱CT或MRI證實有毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、動靜脈畸形、海綿狀血管瘤等血管畸形者；(4)有明確腦外傷病史、腦腫瘤患者；(5)有嚴(yán)重多臟器功能衰竭、重癥感染、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫疾病；(6)有心臟起搏器者、惡性腫瘤、糖尿病微血管病者；(7)精神異常、癲癇發(fā)作等不能配合檢查者。

1.2 主要試劑與儀器 VEGF ELISA試劑盒(Jiangsu Yutong Biological TechnologyCo.,Ltd)、血液基因組DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)、PCR酶預(yù)混劑、訂購限制性內(nèi)切酶BglⅡ，查閱相關(guān)文獻(xiàn)及Gegebank數(shù)據(jù)庫，用primer premier5.0設(shè)計VEGF -2578C/A基因位點的引物，并由上海Sangon Biotech公司合成，序列如下：上游引物：5’-GCCTTAGGACACCATACCGATG-3’,下游引物：5’-GCTGCCCCAGGAACAAAGTTG-3’，離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)，PCR儀、凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司)等。

1.3 研究方法 (1)受檢者入院后詳細(xì)登記一般信息，記錄既往史，完善血常規(guī)、尿常規(guī)、血糖、血脂、凝血功能等化驗，完善頭顱核磁、SWI檢查(CMBs由一名影像科專家及兩名高級職稱神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師共同確定)；(2)第2日晨起6時空腹抽血兩管，一管分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清VEGF 濃度；(3)另一管分離白細(xì)胞，使用基因組 DNA 提取試劑盒提取全血DNA；采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測VEGF-2578C/A基因多態(tài)性，PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次，最后72℃延伸7min，擴(kuò)增后使用限制性內(nèi)切酶Bgl Ⅱ?qū)Ξa(chǎn)物進(jìn)行酶切。擴(kuò)增產(chǎn)物及maker行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察片段大小，得出VEGF-2578C/A基因型：CC：285bp，CA：285bp、206bp、79bp，AA：206bp、79bp。見圖1。

圖1 VEGF -2578C/A基因型

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料及VEGF濃度情況 兩組性別、糖尿病與否差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，白細(xì)胞計數(shù)、甘油三酯、高密度脂蛋白、血肌酐差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，未予列出；年齡、高血壓、VEGF差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 二元Logistic回歸分析 以CMBs為應(yīng)變量，將年齡、高血壓病、血清VEGF濃度作為自變量，作多因素非條件Logistic回歸分析后顯示年齡、高血壓仍與CMBs的發(fā)生相關(guān)，且血清VEGF濃度是CMBs發(fā)生的獨立危險因素。見表2。

表2 影響CMBs發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗 應(yīng)用Hardy-Weinberg公式計算兩組VEGF-2578C/A基因型頻率觀察與對照數(shù)，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明本研究對照組資料具有群體代表性。

2.4 基因型分析 兩組VEGF-2578C/A位點等位基因(C/A)和基因型(CC、CA、AA)分布，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。校正混雜因素后行多因素Logistic回歸，與AA基因型相比，CC基因型為CMBs發(fā)生的易感基因(P<0.05，OR=4.714,95%CI：1.611～13.796)；與CC基因型相比，AA基因型為保護(hù)基因(P<0.05，OR=0.212,95%CI：0.072～0.621)。

表3 兩組VEGF基因型和等位基因比較[n(%)]

3 討論

近年來神經(jīng)科對腦小血管病的研究可謂炙手可熱，尤其是微出血。研究表明CMBs在中老年人群患病率為11.1%～15.3%，隨著年齡的增長或合并有阿爾茨海默病、其他腦血管病其患病率均有不同程度的升高[5]；目前關(guān)于CMBs發(fā)病的確切機(jī)制尚不甚明確，普遍認(rèn)為高血壓和腦血管淀粉樣變與CMBs的發(fā)生密切相關(guān)；最新關(guān)于腦小血管病發(fā)病機(jī)制的文獻(xiàn)比較認(rèn)可可能與慢性缺血/低灌注假說、血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)損害及遺傳等因素[6]相關(guān)，與前人研究CMBs發(fā)生的病理機(jī)理基本一致。由于長期缺血，各種炎性因子釋放，血管內(nèi)皮功能破壞，BBB通透性增高等單獨或一系列級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致CMBs發(fā)生。血腦屏障主要由緊密連接的血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元等形成的神經(jīng)血管單元，是腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要結(jié)構(gòu)[7]。VEGF作為一種重要炎癥因子，必然參加了CMBs發(fā)生過程。VEGF是已知的促進(jìn)血管生成最強(qiáng)的因子之一，亦有很強(qiáng)的血管通透誘導(dǎo)作用，VEGF水平升高是BBB通透性增加關(guān)鍵環(huán)節(jié)，國外學(xué)者最新研究通過動物實驗利用高滲鹽水介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞—一氧化氮合酶通路探討改善腦水腫的可能機(jī)制發(fā)現(xiàn)，高滲鹽水通過抑制VEGF及其蛋白表達(dá)水平下調(diào)進(jìn)而阻斷上述通路，使BBB通透性降低從而減輕腦水腫[8]；另一方面，由于缺血缺氧，促進(jìn)VEGF、PDGF等血管生成因子產(chǎn)生，并與內(nèi)皮細(xì)胞膜受體結(jié)合促進(jìn)血管生成，同時此種條件下基質(zhì)金屬蛋白酶等多種內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物[9]相應(yīng)產(chǎn)生，它們之間的不平衡、不協(xié)調(diào)就會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，造成新生血管不成熟、不穩(wěn)定、功能差而促發(fā)CMBs。由此可推測，VEGF必然參與了CMBs的形成。

目前關(guān)于VEGF基因多態(tài)性的研究，國內(nèi)外優(yōu)秀學(xué)者已經(jīng)發(fā)掘到諸多疾病領(lǐng)域，例如糖尿病視網(wǎng)膜病變、腦卒中、癌癥、子宮內(nèi)膜異位癥及多囊卵巢綜合征等婦科疾病。Dai C等[10]發(fā)現(xiàn)VEGF-C基因多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)系密切，同時記載VEGF-C基因多態(tài)性同口腔癌、尿路上皮細(xì)胞癌和冠狀動脈疾病的發(fā)生相關(guān)，且可作為預(yù)測疾病的靶點；外國學(xué)者[11]通過分析玻璃體內(nèi)注射抗VEGF治療年齡相關(guān)黃斑變性效果的不同，測試出VEGF通路中各基因單核苷酸多態(tài)性不同，也不難預(yù)測VEGF與年齡相關(guān)性黃斑變性有關(guān)。

本研究基于前人關(guān)于VEGF及其基因多態(tài)性和糖尿病腎病、視網(wǎng)膜等微血管損傷相關(guān)的研究，考慮腦部微血管與這些微血管生理及解剖的相似性，再次明確了VEGF的升高可能是CMBs發(fā)生的獨立危險因素，證實了VEGF-2578C/A基因有CC、CA、AA三種基因型，運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡檢驗各組基因型，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，證明具有群體代表性。而且校正混雜因素后CC基因型者CMBs發(fā)病率顯著高于AA型，且為AA型的4.714倍，提示C等位基因可能是CMBs的易感基因。有文獻(xiàn)記載Hcy可能也是CMBs的危險因素，本實驗兩組Hcy水平則無明顯差異，可能原因為前人大多研究均是基于腦梗死合并CMBs病例，Hcy水平受腦梗死的影響較大，以及本實驗對象的選擇可能存在入院率偏倚造成，因此本實驗尚不能得出Hcy是CMBs發(fā)生的危險因素的證據(jù)。

血清VEGF濃度及VEGF-2578C/A基因多態(tài)性可能與CMBs的發(fā)生具有相關(guān)性。因本研究尚存在局限之處：研究為單中心的創(chuàng)新性研究，樣本量偏小，針對CMBs復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，不足以說明具體問題；且研究為單調(diào)的VEGF-2578C/A基因位點，難以校正或消除VEGF基因其他位點多態(tài)性、VEGF家族基因甚至機(jī)體各種因子間相互作用產(chǎn)生的可能影響。若將VEGF-2578C/A作為CMBs發(fā)生的預(yù)測指標(biāo)需要后續(xù)進(jìn)行多中心、大樣本量、多基因位點分析更具說服力，但也無疑為CMBs的治療提供了新思路，對傳統(tǒng)危險因素進(jìn)行嚴(yán)格控制或許仍然是治療或預(yù)防CMBs的主要方法，由本研究可知未來CMBs的防治應(yīng)考慮以內(nèi)皮細(xì)胞功能、BBB 和微血管本身功能為靶點。可以大膽想象，未來是否可以采用針對抗VEGF基因多態(tài)性治療，或人為注射消除VEGF因子的“新藥物”治療，但具體注射的部位及量，值得后繼者們長期不懈的艱辛探索。