鞏 楠，趙 琳，常會敏

西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 耳鼻喉科(西安 710077)

鼻咽癌是東南亞地區(qū)及我國南部地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，該腫瘤發(fā)生于鼻咽腔的頂部和側(cè)壁，侵襲性較強，惡性程度高，非常容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，且發(fā)病早期疾病隱蔽不易被發(fā)現(xiàn)，因此病死率相當(dāng)高[1]。當(dāng)前對鼻咽癌治療采取的主要方法為放療和化療，但放射反應(yīng)和化療藥的不良反應(yīng)可嚴重影響治療效果，并導(dǎo)致很多后遺癥發(fā)生，同時放射治療痊愈后的鼻咽癌具有較高復(fù)發(fā)率[2]。近年來，研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，對采取放化療治療的鼻咽癌患者行中藥配合治療，可增加放化療敏感性，從而提升治療效果，并明顯減少不良反應(yīng)的發(fā)生。

迷迭香酸(rosrarinic acid，RA)是迷迭香的主要化學(xué)成分之一，是一種天然的多酚酸，廣泛分布于唇形科、葫蘆科、紫草科等植物中，是多種中成藥如迷迭香的主要成分[5]。近年來，RA以其抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多方面的藥理作用得到廣泛關(guān)注，其各種藥理學(xué)活性在體內(nèi)相互影響，可共同促進疾病的治療[6-7]。不過，RA的部分藥理效應(yīng)仍未完全闡明，有待進一步探索?；A(chǔ)研究[8]提示，RA對鼻咽癌可能發(fā)揮抑制作用，但其機制還需深入研究。自噬是一種溶酶體介導(dǎo)的胞內(nèi)降解途徑，是真核細胞在惡劣環(huán)境(如營養(yǎng)缺乏)威脅時，引發(fā)的降解和細胞內(nèi)容物再循環(huán)的過程。這一途徑對各種應(yīng)激條件進行應(yīng)答，從而在促進細胞內(nèi)環(huán)境平衡、能量平衡和細胞存活上發(fā)揮重要作用[9-10]。更多證據(jù)[11]表明，自噬在代謝應(yīng)激期間尤其活躍，在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色。然而，在鼻咽癌中RA是否通過調(diào)控細胞自噬，從而誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮治療作用還不清楚。本研究以人鼻咽癌CNE-1細胞為對象，研究RA對其增殖、凋亡的影響，并探討自噬在其中的作用，為明確RA作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

CNE-1細胞(武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司)，RA(上海恒斐生物科技有限公司)，10%胎牛血清(美國Gibco公司)，胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液(碧云天公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，CCK-8試劑盒(美國Sigma公司)，Annexin V-PE/ 7-AAD凋亡流式檢測試劑盒(美國BD公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔多抗LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(14/16 kD，美國Affinity公司) ，兔單抗Beclin-1(52 kD，英國Abcam公司)，兔多抗GAPDH(37 kD，杭州賢至生物有限公司)，HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。Cyto-ID?細胞自噬檢測試劑盒(美國Enzo公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

將凍存的CNE-1細胞復(fù)蘇后，置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。其中RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL和鏈霉素100 mg/L。每2～3 d傳代換液1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。將狀態(tài)良好的CNE-1細胞分別用不同濃度RA(0、20、40、80 μmol/L)處理48 h，將細胞分為對照組和低、中、高濃度RA共4組。

1.3 CCK-8檢測細胞增殖

將處于對數(shù)生長期的CNE-1細胞用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞濃度至5×104個/mL，以100 μL/孔將細胞懸液接種于96孔板中，每組細胞設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組，周圍孔加入100 μL PBS，移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入不同濃度RA處理細胞(0、20 、40、80 μmol/L)，37 ℃、5%CO2飽和條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，搖床低速振蕩10 min，用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度值OD。細胞增殖率(%)=[OD(實驗組)-OD(空白組)]/[OD(對照組)-OD(空白組)] ×100%。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

用6孔板培養(yǎng)細胞，待其生長達60%～70%時，根據(jù)“1.2”處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞，離心沉淀，用250 μL 稀釋的Binding Buffer重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106個/mL。取100 μL的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-PE和10 μL 7-AAD溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min。反應(yīng)后，再加入400 μL的PBS，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測分析細胞凋亡。

1.5 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測自噬蛋白表達

收集上述各處理組細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg等量蛋白上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，含5%脫脂奶粉的TBST封閉液室溫封存2 h。然后加入一抗LC3(1∶1 000)、Beclin-1(1∶2 000)和GADPH(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST充分洗膜，加入HRP標記的二抗(1∶50 000)，室溫搖床孵育2 h。凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，以GAPDH為內(nèi)參，分析各組目的蛋白的相對表達量。

1.6 Cyto-ID?試劑盒檢測細胞自噬

收集生長狀態(tài)良好的CNE-1細胞，接種于含有細胞爬片的24孔培養(yǎng)板，待細胞生長達到50%～70%，按“1.2”處理細胞。處理結(jié)束后，去除細胞培養(yǎng)液，加入緩沖液清洗細胞。加入100 μL自噬檢測試劑，置于37 ℃，孵育30 min，加入緩沖液清洗細胞2次。用4%多聚甲醛常溫固定細胞爬片15 min。1×PBS浸洗爬片3次，3 min/次，洗去多余的Hoechst33342染色液。用吸水紙吸干爬片上殘留的PBS，用含抗熒光淬滅劑封片，然后在激光掃描聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RA對CNE-1細胞增殖的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，各處理組細胞培養(yǎng)48 h的增殖率分別為：對照組(99.80±0.58)%，20 μmol/L-RA組(88.35±1.20)%，40 μmol/L-RA組(74.19±0.46)%，80 μmol/L-RA組(53.30±1.21)%。與對照組相比，各濃度RA均能抑制CNE-1細胞增殖，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RA對細胞增殖的抑制作用隨其濃度梯度的增加而增強，且各濃度組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 RA對CNE-1細胞增殖的影響

2.2 RA對CNE-1細胞凋亡的影響

流式檢測細胞凋亡的實驗結(jié)果顯示，各處理組細胞培養(yǎng)48 h的凋亡率分別為：對照組(2.41±0.23)%，20 μmol/L-RA組(7.67±0.30)%，40 μmol/L-RA組(13.30±0.29)%，80 μmol/L-RA組(23.05±0.33)%。與對照組相比，不同濃度RA均能明顯促進CNE-1細胞凋亡，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著藥物濃度的增加，其促細胞凋亡作用也增強，各濃度組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 RA對CNE-1細胞凋亡的影響

2.3 RA對CNE-1細胞自噬的影響

Cyto-ID?自噬檢測試劑盒使用新型染料檢測自噬小泡和監(jiān)控活細胞自噬流，選擇性標記積累的自噬小泡。染料已通過優(yōu)化，不染溶酶體，而在自噬前體、自噬體和自噬溶酶體內(nèi)呈現(xiàn)明亮的熒光。在熒光顯微鏡下，各處理組細胞中均可見到明顯的綠色自噬熒光。對照組綠色熒光最強，隨著RA濃度逐漸增加，各組CNE-1細胞中的綠色熒光逐漸減弱，提示RA對細胞自噬具有一定抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性(圖3)。

圖3 RA對CNE-1細胞自噬的影響(×400)

2.4 RA對CNE-1細胞表達自噬蛋白的影響

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)法檢測各CNE-1細胞自噬蛋白的表達水平顯示，與對照組相比，不同濃度的RA均能明顯抑制CNE-1細胞表達LC3及Beclin-1蛋白，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著RA濃度增加，其抑制細胞表達LC3及Beclin-1蛋白的效應(yīng)也增強，且各濃度組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 RA對CNE-1細胞表達LC3及Beclin-1的影響

3 討論

在中國、新加坡等東方國家，鼻咽癌是頭頸部中常見的惡性腫瘤之一，病例主要集中于東南亞及我國廣東、廣西等地，其惡性程度和侵襲性高，轉(zhuǎn)移較早[12]。鼻咽癌早期癥狀如涕中帶血、鼻塞、耳鳴等，缺乏特異性，因此70%的首診患者處于疾病晚期，局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移率高、生存期短，嚴重威脅人類健康。作為一種化療和放療高度敏感的疾病，前期治療通常包括放療和順鉑聯(lián)合治療[13]。但對放化療不敏感的高?；颊撸枰捎闷渌嗅槍π缘闹委煵呗浴Ｄ壳?，免疫治療和靶向治療還處于實驗階段，因此尋找療效好、無不良反應(yīng)的輔助治療成為了研究熱點[13-14]。RA是一種水溶性的多酚羥基化合物，在低等的厥類植物和高等的單子葉及雙子葉植物中都存在，但其主要分布于迷迭香、紫蘇、丹參等紫草科和唇形科植物中。由于其具有抗氧化、抗炎、抑制增殖和促進凋亡等多種藥理作用[15]，RA在包括癌癥的多種疾病中得到了廣泛研究[16-18]。研究[17-19]顯示，RA對多種癌癥具有明顯抑制作用，如結(jié)直腸癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌等。本研究用人鼻咽癌CNE-1細胞為模型，探討RA對鼻咽癌的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度RA可明顯抑制CNE-1細胞的增殖活性，同時誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，且RA的效應(yīng)呈劑量依賴性。以上研究結(jié)果與文獻[8]報道結(jié)果一致，提示在鼻咽癌中，RA能通過抑制細胞增殖、促進細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，可能成為鼻咽癌治療的一種輔助用藥。

鼻咽癌是由鼻咽部上皮細胞在各種因素刺激下，發(fā)生多種基因和表觀遺傳變異所致，其發(fā)生與常吃腌肉類食物等日常飲食習(xí)慣、生活環(huán)境、EB 病毒感染等因素密切相關(guān)[20]，但其發(fā)病機制尚不明了。自噬是細胞內(nèi)能量代謝和自我更新的經(jīng)典途徑，廣泛存在于人體正常細胞和惡性腫瘤細胞中，在正常細胞的生理功能、誘導(dǎo)細胞癌變過程中發(fā)揮重要作用[21]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3(microtubule associated protein 1 light chain3，MAP1LC3)，簡稱 LC3，是自噬相關(guān)基因(ATG)8的同源蛋白，以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式存在。當(dāng)自噬發(fā)生時，細胞質(zhì)內(nèi)的LC3被剪切為LC3-Ⅰ，然后與磷脂以酰胺共價鍵結(jié)合形成LC3-Ⅱ，聚集于自噬體膜上[22]。LC3-Ⅱ的表達量隨著自噬體形成增多而增加，因LC3活性與自噬水平呈正相關(guān)，故成為自噬的標志物[23]。Beclin-1是酵母 ATG6 的同源物，可調(diào)控ATG 蛋白定位到前自噬體，是參與自噬過程的關(guān)鍵蛋白，上調(diào)Beclin-1 蛋白表達可促進自噬發(fā)生[24]。鼻咽癌化放療敏感性中的研究[25-26]發(fā)現(xiàn)，自噬可提高鼻咽癌細胞的存活率，從而對細胞起到保護作用，在體外抑制自噬后減少細胞存活；而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤能明顯增強鼻咽癌細胞對放療和化療的敏感性。本研究通過檢測不同濃度RA對CNE-1細胞表達自噬標記蛋白LC3和Beclin-1的影響，發(fā)現(xiàn)RA能明顯抑制CNE-1細胞自噬蛋白的表達，且呈劑量依賴性，從而起到抑制自噬的作用。通過熒光示蹤物來選擇性檢測自噬通路中的各種囊泡也是目前觀察自噬的手段，本研究在熒光顯微鏡下對各處理組細胞的自噬小泡進行了觀察，發(fā)現(xiàn)各組的自噬熒光差異與蛋白質(zhì)印跡技術(shù)的結(jié)果一致。

已有研究[27]證實了凋亡機制和自噬蛋白之間存在機制交叉和聯(lián)系，而自噬和凋亡之間可以存在多重關(guān)系，自噬是否直接控制凋亡的過程，或是它們之間僅僅是有一些共同的機制有待進一步研究。在癌癥中，自噬是否為一種細胞死亡機制，以及如何在凋亡中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用仍存在大量爭議[28]。目前研究[29]認為，在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中，自噬可能具有抑癌和促癌的雙重作用。本研究結(jié)果提示，在鼻咽癌中，自噬可能發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用，與普遍認為的自噬通常促進細胞存活相一致[30]。

綜上所述，RA通過抑制細胞增殖、促進凋亡在鼻咽癌中發(fā)揮抑癌作用，且呈劑量依賴性，其作用機制可能與RA抑制細胞自噬有關(guān)。但RA是否通過抑制自噬促進鼻咽癌細胞發(fā)生凋亡還有待進一步驗證。RA對癌癥的發(fā)生發(fā)展有一定抑制作用，使其成為預(yù)防和治療癌癥的一種新型藥物。在RA對各種癌細胞抑制增殖和促進凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，其在不同癌細胞中的作用機制不盡相同。因此，還需對RA在鼻咽癌中的作用及機制開展進一步研究。