楊琴莉 楊多鳳 丁林云 趙 汀 張 軍 梅 歡 黃楚珺 高 陽 葉 莉 高夢濤 嚴孫藝 張?zhí)煺? 胡 艷,,*

棉花花器官突變體的鑒定及候選基因的克隆

楊琴莉1楊多鳳1丁林云1趙 汀2張 軍2梅 歡2黃楚珺2高 陽1葉 莉1高夢濤1嚴孫藝2張?zhí)煺?,2胡 艷1,2,*

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室, 江蘇南京 210095;2浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 浙江杭州 310058

棉花是世界性的重要經(jīng)濟作物, 是天然纖維的主要來源。棉花生殖生長過程現(xiàn)蕾、開花、結(jié)鈴都直接影響棉花主要經(jīng)濟性狀——棉纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究在轉(zhuǎn)基因棉花材料中發(fā)現(xiàn)了1個花器官突變體, 命名為, 其花器官呈現(xiàn)瓣化特征。PCR和Southern雜交證明突變體中的外源基因已整合到基因組中, 且為單拷貝插入。通過基因組重測序進行序列比較發(fā)現(xiàn), 突變體基因組中外源T-DNA插入位點為染色體A11:59086840。PCR和Southern雜交對插入位點進行了進一步驗證。根據(jù)棉花基因組注釋結(jié)果, 在基因組插入位點附近有3個候選基因(、和)。其中為類基因。已有研究證明,類基因為花器官ABC模型中控制萼片和花瓣形成的A類功能基因。qRT-PCR結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)基因受體W0的花瓣、雌蕊和雄蕊3個組織中的表達與突變體中存在顯著性差異。本研究為進一步深入探究棉花花器官發(fā)育的分子機制研究提供了參考。

棉花; 轉(zhuǎn)基因; 花器官; 突變體; 基因克隆

棉花是世界上重要的經(jīng)濟作物和油料作物, 在世界上超過100個國家和地區(qū)種植。棉花纖維是紡織工業(yè)天然纖維的重要來源[1]。纖維由棉花胚珠表皮細胞突起形成[2], 因此棉花花器官的分化和發(fā)育直接影響棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)。在植株的生長發(fā)育過程中, 植物頂端分生組織由發(fā)育成葉原基轉(zhuǎn)變?yōu)殚_始發(fā)育成花原基[3], 是營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變?；ㄆ鞴俚姆只桶l(fā)育是被子植物生命周期的重要階段[4]。典型的花器官分為4個部分, 從外到內(nèi)依次是萼片、花瓣、雄蕊、心皮, 它們組成了花發(fā)育的4個輪回[5-6]。

1991年, Coen和Meyerowitz[7]首次系統(tǒng)地解釋了花發(fā)育相關(guān)基因(主要是MADS盒基因)在不同花器官發(fā)育中的作用。已知MIKC型的MADS-box基因是植物特有的, 它們在開花植物(被子植物)生殖發(fā)育中的作用尤為重要[8]。絕大多數(shù)MIKC型基因?qū)儆诨ㄆ鞴贈Q定基因, 它建立了被子植物花發(fā)育的基本框架, 保障了“AE模型”[9]的保守性, 并參與調(diào)控開花時間、花器官和花分生組織識別、果實發(fā)育、營養(yǎng)器官發(fā)育[10-11]等過程。除了MADS-box基因家族外, 還有一類()基因在花發(fā)育過程中扮演了重要角色?；?qū)儆诨òl(fā)育模型中A類基因。最早發(fā)現(xiàn)擬南芥胚珠和雌配子體發(fā)育所需的基因與花型同源異形基因有關(guān)。編碼的蛋白質(zhì)()屬于相關(guān)基因家族, 是胚珠發(fā)育所必需的[12-13]。已有研究表明, 擬南芥中基因在其子房及雌配子體發(fā)育過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[13-16]。同時為了更好地理解基因在控制胚珠發(fā)育中的作用, 研究人員從擬南芥中分離出1個雌性不育突變體。在該突變體的胚珠中, 胚珠不發(fā)育。當突變體與花同源突變體結(jié)合時, 花器官結(jié)構(gòu)就會完全喪失, 表明這2個基因共同啟動了花發(fā)育[12]。

有關(guān)棉花花器官發(fā)育相關(guān)基因已有報道。Wang等[17]從陸地棉中分別克隆到了1個類似基因和1個開花啟動因子基因, 并在轉(zhuǎn)基因擬南芥中進行了功能驗證。Zhang等[18-19]對和基因家族進行了鑒定和分析, 證實與和基因啟動子結(jié)合以調(diào)節(jié)開花。而后研究確定了和的功能及其調(diào)控機制, 為早期成熟棉花品種發(fā)展提供了有用的信息[19]。研究表明基因?qū)儆赑I亞家族, 為B類功能基因, 基因?qū)儆趤喖易? 行使C類基因功能[20]。煙草植物中導(dǎo)入和基因, 證實了基因在相應(yīng)花器官發(fā)育中的作用[20]。此外,基因在植物的花發(fā)育網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中也扮演了重要角色。了解基因與其他基因的相互作用關(guān)系, 有利于我們更好地理解花發(fā)育調(diào)控的基本框架[21]。已知與同屬于A類功能基因, 它們共同調(diào)控花萼和花瓣的發(fā)育, 且2個基因被證明有一定的疊加效應(yīng), 它們共同影響了花原基的建成[16]。在花的發(fā)育過程中,基因與基因作用最為明顯。已有研究表明, 在突變體中, 很多負調(diào)控因子中的作用最強,將的表達限制在花器官形成的第1、2輪回中[22-23]。miR172對的表達也有一定的調(diào)控作用。由于結(jié)構(gòu)中存在1個miR172的結(jié)合位點, 因此二者結(jié)合之后, miR172在翻譯水平抑制了蛋白質(zhì)的形成[21]?？傊? 在各類基因相互作用下形成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 共同調(diào)節(jié)了植物的花發(fā)育進程。

本研究在轉(zhuǎn)基因棉花中發(fā)現(xiàn)了1個花器官突變體。突變體表現(xiàn)為花器官異常, 萼片相對細長偏大, 花瓣和雄蕊結(jié)構(gòu)異常。Southern雜交表明, T-DNA在基因組中為單拷貝插入。利用基因組重測序數(shù)據(jù)進行比較基因組分析, 鑒定出T-DNA在突變體基因組的插入位點進行了準確定位。插入位點附近存在3個候選基因, 其中包括1個類基因, 在突變花器官中表達量顯著低于正常花器官。推測可能由于T-DNA的插入導(dǎo)致1個類基因的表達發(fā)生差異變化, 從而引起花器官突變表型。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花器官突變體為轉(zhuǎn)基因植株。植物材料種植于浙江大學(xué)農(nóng)生環(huán)9號溫室(培養(yǎng)條件: 溫度22℃, 光照16 h/黑暗8 h, 相對濕度75%~80%)。試驗中轉(zhuǎn)基因載體為GoPGF-RNAi, 載體骨架序列為pBI121載體(圖1)保存于本實驗室。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA合成

采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因受體W0和花器官突變體新鮮葉片DNA。按照EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒(Adlab, 北京)指示說明書, 分別提取W0和的萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊4個組織的RNA。植物材料于液氮中速凍后保存于-80℃超低溫冰箱中備用。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將各組織RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。

1.3 Southern印記雜交

提取葉片DNA后, 取20 μg基因組DNA, 加入150 U的d III內(nèi)切酶和20 μL限制性內(nèi)切酶緩沖液, 加無菌重蒸水至總體積200 μL, 37℃保溫過夜。d III內(nèi)切酶(南京諾唯贊生物科技股份有限公司, 簡稱諾唯贊)酶切后的質(zhì)粒作為陽性對照。以基因擴增產(chǎn)物(約196 bp)和T-DNA擴增產(chǎn)物做探針, 分別檢測外源基因插入的拷貝數(shù)以及插入位點的驗證?；驍U增引物序列為F: 5￠-ACCTGTCCGGT GCCCTGAATGAACTGC-3￠和R: 5￠-GCCATGATGGAT ACTTTCTCGGCAGGAGC-3￠; T-DNA插入片段擴增引物序列為F: 5￠-TGGGTGATGGTTCACGTAGT-3￠和R: 5￠-CATAATCATGTTAAAATGCTTGG-3￠。將酶切后的基因組DNA在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳過夜。通過紙吸印法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上, 參照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche)試劑盒進行探針標記、預(yù)雜交、雜交及檢測。

1.4 T-DNA插入位點鑒定

為明確外源T-DNA插入基因組的準確位點, 本研究對花器官突變體和受體W0進行高深度的Illumina PE150基因組重測序。對所獲得數(shù)據(jù)進行過濾去除低質(zhì)量reads。利用Blastn[24]軟件將高質(zhì)量reads比對pBI121載體序列。提取比對到pBI121載體序列的另一端數(shù)據(jù), 使用軟件hisat2[25]比對陸地棉TM-1參考基因組(V2.1) (cotton.zju.edu.cn), 估算插入位點。

1.5 候選基因的克隆

從本實驗室TM-1基因組(V2.1)數(shù)據(jù)庫中獲取候選基因、和三個基因的CDS序列, 設(shè)計引物對3個基因進行克隆, 引物序列分別為(F: 5￠- ATGAAGTCCATGAGCAATGATG-3￠, R: 5￠-CTAAG CATCTGTCCAGGCAGT-3￠)、(F: 5￠- ATGCAAAAGGAGGCTGCTCTTTT-3￠, R: 5￠-CTATA GCTTACACATGAGC-3￠)、(F: 5￠-ATG GAAGGAAGTATACCCTT-3￠, R: 5￠-CTAGACAAAT TCATGTAAACCACG-3￠)。

1.6 實時熒光定量PCR (RT-PCR)

以棉花基因(Acc. No. AF024716, F: 5￠- GGTGGTGTGAAGAAGCCTCAT-3￠, R: 5￠-AATTTC ACGAACAAGCCTCTGGAA-3￠)為內(nèi)參對表達數(shù)據(jù)進行標準化。使用諾唯贊SYBR Green I kit染料, 在熒光定量RT-PCR儀(ABI 7500)上進行分析, 以最小的樣本閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)和最高的熒光值為標準。反應(yīng)體系與程序按照諾唯贊AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說明書進行。引物序列分別為:-QF: 5￠-ATGGAGGTTAGCAATC AAGG-3￠,-QR: 5￠-AGATGAGATGGT GGAGATGG-3￠;-QF: 5￠-GTTTAGAC GAGTGGAAGCC-3￠,-QR: 5￠-AGTTT GGAGTGTCCTAATGC-3￠;-QF: 5￠-G GCCTATAAAGCGTGTACC-3￠;-QR: 5￠-TAATTCGGAGCTACAAGTGC-3￠。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量, 計算公式如下: 目的基因的相對表達量= 2-ΔΔCt; 而DCt = Ct目的基因-Ct內(nèi)參。

2 結(jié)果與分析

2.1 花器官突變體182-9表型鑒定

本研究以棉花野生型W0為受體, 在轉(zhuǎn)基因材料中發(fā)現(xiàn)1個轉(zhuǎn)基因克隆株系表現(xiàn)為花器官突變體, 命名為。突變體花器官呈現(xiàn)明顯的生理缺陷構(gòu)造, 整個花器官顯著變小, 外圍苞葉相對卷曲窄小, 萼片相對細長偏大, 花瓣和雄蕊結(jié)構(gòu)異常, 失去了花器官四輪結(jié)構(gòu), 均呈現(xiàn)類似細長葉片狀態(tài), 心皮中無胚珠(圖2)。

2.2 突變體182-9的分子檢測

對轉(zhuǎn)基因突變體進行基因PCR檢測發(fā)現(xiàn),為轉(zhuǎn)基因陽性克隆, 外源T-DNA片段已經(jīng)整合到基因組中(圖3)。

2.3 突變體182-9的Southern檢測

為進一步確定T-DNA在突變體中的插入拷貝數(shù), 本研究根據(jù)外源基因設(shè)計探針, 與轉(zhuǎn)基因獲得的不同克隆的基因組DNA (包括突變體)進行Southern雜交。同時, 以質(zhì)粒DNA為陽性對照, 野生型W0為陰性對照。結(jié)果顯示, 突變體中T-DNA已穩(wěn)定整合到基因組中且為單拷貝插入(圖4)。

A: 轉(zhuǎn)基因受體W0花器官整體結(jié)構(gòu)與子房。B: 突變體花器官結(jié)構(gòu)。C: 轉(zhuǎn)基因受體W0苞葉、萼片、花瓣、雌蕊雄蕊結(jié)構(gòu)。D: 突變體苞葉、萼片以及瓣化結(jié)構(gòu)。標尺為1 cm。

A: the whole flower organ and ovary of transgenic receptor W0. B: floral organ of the mutant. C: bract, sepal, petal, pistil stamen of transgenic receptor W0. D: bracts, sepals, and petaloid structure of the mutant. Bar: 1 cm.

2.4 插入位點在參考基因組中的定位

我們對轉(zhuǎn)基因受體W0和突變體進行基因組重測序, 分別產(chǎn)生了70.8 Gb和73.7 Gb的數(shù)據(jù), 覆蓋基因組約30倍(以棉花基因組2.5 Gb計算) (表1)。其中, Sample代表樣品名, Raw Base (bp)表示原始數(shù)據(jù)產(chǎn)量, Clean Base是過濾之后的有效數(shù)據(jù)量, 即過濾后測序序列的個數(shù)乘以測序序列的長度, Q30即Phred 數(shù)值大于30的堿基占總體堿基的百分比。為鑒定T-DNA在受體W0基因組中的插入位點, 本研究將重測序reads分別比對到載體pBI121, 在轉(zhuǎn)基因材料和轉(zhuǎn)基因受體W0重測序reads中, 分別有41條和0條序列和載體具有同源性。使用軟件hisat 2[25]將41條reads的另一端再比對到TM-1的參考基因組上發(fā)現(xiàn), 共有15條reads能唯一匹配到陸地棉TM-1 A11染色體的59,086,746~59,086,947的區(qū)間, 推測位點為外源T-DNA的插入位點。

M: DNA分子量Marker; W0: 陰性對照; 1: 轉(zhuǎn)基因株系182-9; 2: 轉(zhuǎn)基因株系182-36; 3: 轉(zhuǎn)基因株系182-91; 4: 轉(zhuǎn)基因株系182-150; 5: 轉(zhuǎn)基因株系182-172; 6: 轉(zhuǎn)基因株系182-173; 7: 轉(zhuǎn)基因株系182-187。

M: DNA molecular-weight markers; W0: negative control; 1: transgenic line 182-9; 2: transgenic line 182-36; 3: transgenic line 182-91; 4: transgenic line 182-150; 5: transgenic line 182-172; 6: transgenic line 182-173; 7: transgenic line 182-187.

M: DNA marker; 1: 轉(zhuǎn)基因受體W0; C: 質(zhì)粒; 2: 轉(zhuǎn)基因株系182-187; 3: 轉(zhuǎn)基因株系182-36; 4: 轉(zhuǎn)基因株系182-173; 5: 轉(zhuǎn)基因株系182-9 (箭頭所示)。

M: DNA marker; 1: transgenic receptor W0; C: plasmid; 2: transgenic line 182-187; 3: transgenic line 182-36; 4: transgenic line 182-173; 5: transgenic line 182-9 (indicated by the arrow).

表1 重測序數(shù)據(jù)評估

為進一步驗證外源T-DNA的插入位點。根據(jù)重測序分析結(jié)果, 本研究利用SeqHunter1.0提取陸地棉TM-1基因組中該位點上下游2 kb序列, 設(shè)計特異性引物, 分別以突變體和野生型W0的基因組DNA為模板, 擴增序列并測序。PCR擴增結(jié)果顯示, 突變體能擴增出約400 bp的特異性序列(圖5-A)。測序結(jié)果證明, 突變體基因組中T-DNA插入位點在染色體A11上的59,086,840位置, 紅色部分為該位點附近的棉花基因組序列, 前半部分為載體序列(圖5-B)。

A: PCR擴增條帶; B: 擴增序列的測序結(jié)果(紅色部分為棉花基因組序列, 其他為T-DNA序列)。M: DNA marker; W0: 轉(zhuǎn)基因受體;: 轉(zhuǎn)基因株系。

A: diagram of PCR detection; B: the sequencing results of the amplified sequence from(the red part is the cotton genome sequence, and the others are T-DNA sequences). M: DNA marker; W0: transgenic receptor;: transgenic line.

根據(jù)PCR驗證結(jié)果, 本研究以圖5-B中的序列為探針, 與轉(zhuǎn)基因突變體基因組DNA進行Southern雜交。同時, 以探針序列為陽性對照, 轉(zhuǎn)基因株系W0為陰性對照。結(jié)果進一步驗證了基因組中外源T-DNA以單拷貝插入染色體A11上的59,086,840位點(圖6)。

M: DNA marker; C: 陽性質(zhì)粒; 1: 轉(zhuǎn)基因株系; 2: 轉(zhuǎn)基因受體W0。箭頭所示為轉(zhuǎn)基因中特異性條帶。

M: DNA marker; C: positive plasmid; 1: transgenic line; 2: transgenic receptor W0. The specific band ofis shown by an arrow.

2.5 候選基因的篩選和功能預(yù)測

根據(jù)外源T-DNA插入基因組中的定位結(jié)果, 本研究將外源插入T-DNA序列比對到陸地棉TM-1基因組, 根據(jù)陸地棉TM-1參考基因組注釋結(jié)果(表2), 在插入位點400 kb范圍內(nèi)存在、和三個功能基因(圖7)。根據(jù)擬南芥中同源基因的功能注釋發(fā)現(xiàn),為類基因, 已有文獻報道類基因在花器官分化中起著重要作用, 為開花模型中A類基因。

為驗證是否因為候選基因本身序列的突變而產(chǎn)生突變表型, 本研究對3個候選基因在轉(zhuǎn)基因受體W0和花器官突變體中的基因序列進行了比較發(fā)現(xiàn), 3個候選基因CDS序列在和W0之間并無差異(圖8~圖10), 表明T-DNA插入并未造成3個候選基因的堿基序列差異。

選取W0和典型花器官結(jié)構(gòu)進行定量分析。q-PCR分析結(jié)果顯示,在突變體與轉(zhuǎn)基因受體W0相應(yīng)的花瓣(O2)、雄蕊(O3)和雌蕊(O4)中表現(xiàn)顯著性差異, 在花瓣(O2)和雌蕊(O4)突變體表達量顯著低于轉(zhuǎn)基因受體。在2個材料中表達無顯著差異,在轉(zhuǎn)基因受體W0花器官和突變體中幾乎不表達(圖11)。

3 討論

棉纖維為棉花胚珠表皮突起形成, 因此棉花的主要經(jīng)濟性狀——棉纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量與棉花的生殖生長密切相關(guān)。但是, 目前關(guān)于棉花中花器官形成和發(fā)育的分子機制的研究報道并不多。本研究通過轉(zhuǎn)基因得到花器官突變體, 是研究花器官發(fā)育的良好材料。本研究中, 我們鑒定出了準確的外源T-DNA插入位點, 并在插入位點附近發(fā)現(xiàn)了1個類基因家族基因。近年來, 關(guān)于基因直接或間接參與花發(fā)育的某一具體調(diào)控仍存在許多問題,對于其基因家族調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的方式及基因互作也不是十分清楚[21]。本研究中, 雖然T-DNA的插入位置與位置相差243 kb, 但是在DNA的三維空間上, 他們可能是靠近的。這種現(xiàn)象隨著三維基因組研究[26]的發(fā)展, 已經(jīng)有更多的證據(jù)證明了這種現(xiàn)象的存在。調(diào)控元件對基因的遠程調(diào)控也已有報道。比如, 在玉米中, 已有報道證明一個控制光周期的基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游57 kb的Harbinger轉(zhuǎn)座元件CTOR的插入調(diào)控了該基因的表達[27]。這種遠程調(diào)控的作用機制為我們關(guān)于候選基因與突變表型之間的可能關(guān)系提供了一些理論依據(jù)。因此, 我們推測在突變體中, T-DNA的插入可能引起了候選基因區(qū)域空間構(gòu)象上的改變, 從而引起了基因的表達差異。突變體花突變產(chǎn)生與的關(guān)系還需要更進一步的試驗去證明。

表2 候選基因的注釋信息

4 結(jié)論

本研究通過花器官突變體與其野生型W0的表型差異, 為闡明調(diào)控棉花花發(fā)育的基因及突變機制提供了信息。鑒定出了T-DNA在轉(zhuǎn)基因突變體中的準確插入位點A11:59,086,840, 并通過PCR以及Southern雜交進一步驗證了位點鑒定的準確性。并在插入位點附近發(fā)現(xiàn)了一個可能性的功能基因, 在突變體與轉(zhuǎn)基因受體W0的花器官中存在顯著差異表達。

A: W0和組織示意圖; B: 候選基因在突變體及其野生型W0中的表達水平。其中, *表示在0.05水平差異顯著。

A: the schematic diagram of floral organs of W0 and; B: the expression levels of the candidate genes in mutantand wild-type W0. * meanssignificant difference at the 0.05 probability level.

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Identification of a cotton flower organ mutantand cloning of candidate genes

YANG Qin-Li1, YANG Duo-Feng1, DING Lin-Yun1, ZHANG Ting2, ZHANG Jun2, MEI Huan2, HUANG Chu-Jun2, GAO Yang1, YE Li1, GAO Meng-Tao1, YAN Sun-Yi2, ZHANG Tian-Zhen1,2, and HU Yan1,2,*

1State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China;2College of Agricultural & Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310000, Zhejiang, China

Cotton is an important economic crop and the main source of natural fiber in the world. The budding, flowering and bolling during cotton growth and development directly affect the yield and quality of cotton fiber that are the main economic traits of cotton. In this study, we found a flower organ mutant (named) in transgenic cottons, which displayed the floral organ petaloid feature. PCR and Southern blotting confirmed that the foreign T-DNA was integrated into thegenome with a single copy. Comparative analysis of the resequencing data revealed that the exogenic T-DNA was inserted in theon chromosome A11: 59086840. The insertion site was further verified by PCR and southern blot. According to the gene annotation of cotton genome, there were three candidate genes of,, and, near to the insertion site.encodedgenes controlling the formation of sepals and petals in the ABC model of flower organs as previous report. qRT-PCR showed that there were significant differences in the expression level ofin petals, pistil and stamens of transgenic receptor W0 and mutant. Our study provided the basis for further study of molecular mechanism in cotton floral organ development.

cotton; transgenic; floral organ; mutant; gene cloning

10.3724/SP.J.1006.2021.04208

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31970320)和國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2016ZX08009-003)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31970320) and the National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08009-003).

胡艷, E-mail: njauhuyan@njau.edu.cn

E-mail: 739768392@qq.com

2020-09-10;

2021-01-13;

2021-03-11.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210310.1713.002.html