伍少瑩，李旭芳，施 全，劉 磊，蔣鳳菊

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心婦產(chǎn)科部，廣東廣州 510220)

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染可引起腦炎、肝炎等器官功能受損[1]。亦可通過(guò)宮內(nèi)感染或母乳喂養(yǎng)引起母嬰傳播[2]，對(duì)胎兒、嬰幼兒造成發(fā)育遲緩、智力障礙等危害[3]。目前，國(guó)內(nèi)外研究極少關(guān)注HCMV感染對(duì)子代精神行為的影響。本研究擬通過(guò)建立小鼠動(dòng)物模型，探討母代不同孕期CMV感染對(duì)子代精神行為的影響，為疾病診療提供臨床思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2017至2020年期間，選取北京維通利華純種動(dòng)物室出生28天的BALB/c雌鼠36只(體重：10～12g/只)，國(guó)家級(jí)屏蔽環(huán)境內(nèi)12/12h晝夜循環(huán)條件下自由進(jìn)食飼養(yǎng)。

1.1.2小鼠巨細(xì)胞病毒

小鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)Smith毒株由華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院病毒實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)，在BALB/c雌鼠唾液腺組織中傳毒增殖并滴定出半數(shù)組織感染量(TCID50)后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.3主要儀器

①曠場(chǎng)試驗(yàn)儀：廣州飛康生物科技有限公司提供；黑色曠場(chǎng)箱尺寸：50cm×50cm×30cm。②Morris水迷宮試驗(yàn)儀：上海移動(dòng)信息科技有限公司產(chǎn)品；黑色圓桶：直徑150cm×高60cm。③懸尾試驗(yàn)儀：上海欣軟信息科技有限公司產(chǎn)品；隔音避光箱尺寸：50cm×50cm×70cm。④蔗糖：太古糖業(yè)(中國(guó))有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1 MCMV全身播散型感染模型的建立

小鼠腹腔內(nèi)注射TCID50MCMV懸液(1.36×105PFU/mL)0.2mL，建立MCMV全身播散性感染模型。

1.2.2分組及干預(yù)方式

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為12組(A1，A2，A3，B1，B2，B3，C1，C2，C3，D1，D2，D3)，每組3只。

A為孕期再感染組，B為既往感染組，C為孕期原發(fā)感染組，D為正常對(duì)照組；1是孕早期(孕第5天)腹腔注射，2是孕中期(孕第10天)腹腔注射，3是孕晚期(孕第15天)腹腔注射。孕前，A、B組分別腹腔注射MCMV 0.2mL，C、D組分別腹腔注射0.9%無(wú)菌生理鹽水(sterile normal saline，NaCl)0.2mL。孕期，A、C組分別腹腔注射MCMV 0.2mL，B、D組分別腹腔注射0.9%NaCl 0.2mL。

1.2.3實(shí)驗(yàn)過(guò)程

適應(yīng)期后，雌鼠隨機(jī)進(jìn)入不同實(shí)驗(yàn)組，根據(jù)組別要求行第1次腹腔注射。1周后，小鼠按雌∶雄3∶1合籠24h，分籠后檢查雌鼠陰栓情況。有陰栓者單獨(dú)飼養(yǎng)并在不同孕期分別腹腔注射MCMV或0.9%NaCl 0.2mL，產(chǎn)仔后母、仔鼠同籠合養(yǎng)到產(chǎn)后21天。產(chǎn)后第22天，母、仔鼠分籠飼養(yǎng)，每組隨機(jī)抽取6只仔鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。仔鼠出生第1天(定為0周)，記錄出生體重，并記錄第3周(定為3周)及第6周(定為6周)的一般情況及行為學(xué)特征。第6周行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)處死仔鼠3只，測(cè)量腦臟器重量系數(shù)及唾液腺中MCMV表達(dá)水平。

1.2.4小鼠一般習(xí)性觀察

觀察并記錄小鼠體重(稱重3次后求均值作為當(dāng)時(shí)體重)、毛發(fā)(稀疏、濃密)、食欲(每5天記錄1次飼料及水量的減少量)、活動(dòng)(減少、增多、攻擊行為)、對(duì)刺激反應(yīng)(遲鈍、活躍)。

1.2.5小鼠行為學(xué)試驗(yàn)

①曠場(chǎng)試驗(yàn)(open field test，OFT)記錄仔鼠放入曠場(chǎng)箱正中格后5min內(nèi)行為變化，計(jì)算“水平運(yùn)動(dòng)總距離”和“直立運(yùn)動(dòng)次數(shù)”。仔鼠4只爪子進(jìn)入1格記錄為水平運(yùn)動(dòng)，雙前爪騰空或攀附墻壁記錄為直立運(yùn)動(dòng)。②Morris水迷宮試驗(yàn)(water maze test，WMT)第1～6天是空間學(xué)習(xí)記憶能力試驗(yàn)，每天4次，同一時(shí)間開(kāi)始，分次將仔鼠面向池壁，隨機(jī)從4個(gè)象限不同入水點(diǎn)放入水池，記錄仔鼠從入水到找出水下隱蔽平臺(tái)并站立其上所需時(shí)間，記錄“逃避潛伏時(shí)間”；第7天移掉平臺(tái)，做空間探索試驗(yàn)，記錄60s內(nèi)仔鼠“穿越原平臺(tái)位置次數(shù)”。③懸尾試驗(yàn)(tail suspension test，TST)仔鼠頭部離地40cm向下懸掛，遠(yuǎn)端尾部固定。試驗(yàn)6min，觀察最后4min內(nèi)仔鼠不動(dòng)時(shí)間(指無(wú)晃動(dòng)及掙扎的時(shí)間)，記錄“懸尾不動(dòng)時(shí)間”。④糖水偏好試驗(yàn)(sucrose preference test，SPT)訓(xùn)練仔鼠適應(yīng)飲糖水后開(kāi)始試驗(yàn)。禁食禁水24h后給等重的2瓶水(1瓶2%蔗糖水，1瓶純凈水)，8h交換1次瓶子位置，16h后取走2水瓶，計(jì)算“糖水偏好指數(shù)”[糖水偏好指數(shù)(%)=糖水?dāng)z入量(g)/[糖水消耗量(g)+純水消耗量(g)]×100%]。

1.2.6組織學(xué)評(píng)價(jià)

無(wú)菌分離被處死仔鼠的腦組織，計(jì)算腦臟器重量系數(shù)[臟器重量系數(shù)(%)=臟器重量/體重×100]。腦組織常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色、光鏡檢查病理?yè)p害情況。

1.2.7 Real time PCR法檢測(cè)MCMV定量

無(wú)菌分離被處死仔鼠的唾液腺，Real time PCR法測(cè)量組織中MCMV DNA定量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組仔鼠體重變化

每組6只。出生體重：A組、C組均低于D組(td值分別為2.42、3.34，P<0.05)。3周時(shí)體重：A3組、C1組、C2組、C3組均低于D組(td值分別為2.57、2.63、3.46、5.08，P<0.05)；C2組、C3組低于C1組(td值分別為2.98、3.05，P<0.05)。6周時(shí)體重：僅C3組低于D組(td=6.77，P<0.01)，提示C3組仔鼠發(fā)育持續(xù)滯后于正常組。實(shí)驗(yàn)中，C2、C3組表現(xiàn)出不同程度的皮毛稀松、食欲差、活動(dòng)少、對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍等。

2.2各組仔鼠唾液腺組織中MCMV定量

除D組外，其他組別唾液腺組織中均檢測(cè)出MCMV。其中，A、C組高于B組(td值分別為2.75、2.94，P<0.05)。說(shuō)明母鼠有MCMV接觸史的仔鼠，都有MCMV感染情況，假如孕期有新接觸感染，仔鼠的病毒量會(huì)更高。

2.3各組仔鼠腦組織病理情況

2.3.1各組仔鼠腦臟器重量系數(shù)情況

腦臟器重量A1、C1組均高于D1組(td值分別為2.88、4.17，P<0.05)，且C1組高于A1組(td=3.06，P<0.05)；提示母鼠孕早期MCMV暴露對(duì)仔鼠腦組織有影響，母鼠孕早期原發(fā)感染的仔鼠受害更嚴(yán)重。B組與D組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(td=0.46，P>0.05)，提示母鼠既往MCMV暴露對(duì)仔鼠腦組織影響很少。

2.3.2各組仔鼠腦組織病理情況

每組3只。B、D組仔鼠腦組織病理未見(jiàn)明顯異常。A1、C1組仔鼠腦組織病理見(jiàn)明顯異常情況，C1組較A1組嚴(yán)重。C1組仔鼠腦組織鏡下可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞明顯水腫，排列紊亂擁擠，部分細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞核消失，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)嗜酸性包涵體，間質(zhì)水腫并淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)。(見(jiàn)圖1、圖2)

圖1 C1組(MCMV感染)仔鼠腦組織病理表現(xiàn)Fig.1 The pathological features of brain tissue of offspring mice in C1 group (with MCMV infection)

圖2 D1組(無(wú)MCMV感染)仔鼠腦組織病理表現(xiàn)Fig.2 The pathological features of brain tissue of offspring mice in D1 group (without MCMV infection)

2.4各組仔鼠的行為學(xué)試驗(yàn)情況

3周時(shí)，與D組相比，A3、C1、C2和C3組仔鼠的水平運(yùn)動(dòng)總距離縮短(F值分別為11.4、9.03、10.95、19.04，P<0.05)，直立次數(shù)減少(F值分別為6.28、5.87、7.72、11.57，P<0.05)，懸尾不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)(F值分別為9.14、13.37、14.45、23.26，P<0.05)，糖水偏好指數(shù)降低(F值分別為5.10、6.73、7.73、9.04，P<0.05)；A1、C1、C2和C3組仔鼠的逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)(F值分別為19.22、28.02、21.77、23.43，P<0.05)，穿越原平臺(tái)位置次數(shù)減少(F值分別為22.10、26.87、20.56、27.32，P<0.05)。

6周時(shí)，與D組相比，C3組仔鼠的水平運(yùn)動(dòng)總距離縮短(F=23.44，P<0.05)，直立次數(shù)減少(F=16.25，P<0.05)，懸尾不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)(F=14.03，P<0.05)，糖水偏好指數(shù)降低(F=9.98，P<0.05)，提示C3組仔鼠的快感缺失及退縮行為的提升由嬰幼期持續(xù)至成年期；A1、C1組仔鼠的逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)(F值分別為15.33、23.78，P<0.05)，穿越原平臺(tái)位置次數(shù)減少(F值分別為14.12、22.21，P<0.05)，提示A1、C1組仔鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力持續(xù)低于正常對(duì)照組。

表1 母鼠孕早期腹腔注射的各組仔鼠的情況Table 1 Situations of offspring mice in each group after maternal intraperitoneal injection in the first

(續(xù)上表)

表2 母鼠孕中期腹腔注射的各組仔鼠的情況Table 2 Situations of offspring mice in each group after maternal intraperitoneal injection in the second trimester

表3 母鼠孕晚期腹腔注射的各組仔鼠的情況Table 3 Situations of offspring mice in each group after maternal intraperitoneal injection in the third

3討論

3.1研究CMV感染者子代行為學(xué)表現(xiàn)有重要臨床意義

HCMV屬皰疹病毒β亞科，人群感染率高，我國(guó)孕婦HCMV抗體陽(yáng)性率約95%[4]，兒童感染率為83.2%～87.3%[5]。由于HCMV有親神經(jīng)特性，人孕期感染可導(dǎo)致胎兒腦積水、小頭畸形、嬰幼兒神經(jīng)功能受損等情況[6]；目前無(wú)明確有效的孕期防治方案，先天感染的新生兒療效較差，嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷難以逆轉(zhuǎn)。因此，本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)側(cè)面反映這類兒童在成長(zhǎng)中可能存在的精神行為學(xué)變化特征及危害程度，為改進(jìn)婦幼保健工作提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.2母代孕期MCMV感染直接影響子代出生體重

仔鼠出生體重結(jié)果顯示：A、C組均低于D組(P<0.05)，B組與D組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；提示母鼠單純既往感染(B組)對(duì)仔鼠出生體重影響不大，而孕期MCMV暴露(A組、C組)可對(duì)仔鼠出生體重產(chǎn)生一定影響，無(wú)論其是否有既往感染史。其原因可能是母鼠孕期免疫力低下，MCMV損害母鼠臟器功能直接影響妊娠結(jié)局[7]。

3.3母代孕期MCMV感染可能影響子代成年期體重

A組仔鼠體重變化顯示：A1、A2組3周時(shí)正常(P>0.05)；A3組3周時(shí)低于正常(P<0.05)，6周時(shí)正常(P>0.05)。提示孕早、中期MCMV再感染的母鼠體內(nèi)可能存在一定的免疫功能，該功能削弱了MCMV對(duì)母鼠機(jī)體的損害，使A1、A2組母鼠身體有充裕的康復(fù)時(shí)間，產(chǎn)后可正常撫養(yǎng)仔鼠。而孕晚期MCMV再感染的A3組母鼠，可能產(chǎn)后身體未能立即康復(fù)，出現(xiàn)短期消極撫養(yǎng)行為，導(dǎo)致A3組仔鼠體重恢復(fù)慢于A1、A2組。預(yù)示不良撫養(yǎng)行為可能是影響子代體重增長(zhǎng)的因素之一[8]。

C組仔鼠體重變化顯示：C1、C2組3周時(shí)低于正常(P<0.05)，6周時(shí)正常(P>0.05)；C3組3周及6周時(shí)均低于正常(P<0.05)。提示母鼠孕晚期原發(fā)感染(C3組)的仔鼠體重增長(zhǎng)持續(xù)滯后。原因可能是母鼠孕期免疫低下，MCMV原發(fā)感染嚴(yán)重?fù)p害母鼠心、肝、腦等器官功能[7]，孕晚期原發(fā)感染的母鼠，身體未能康復(fù)就要接受分娩勞累及產(chǎn)后激素水平急劇變化的影響，還要承擔(dān)撫養(yǎng)后代重任，導(dǎo)致母鼠身心疲憊，出現(xiàn)持續(xù)不良情緒及消極撫養(yǎng)行為，致使C3組仔鼠體重持續(xù)滯后。而孕早、中期原發(fā)感染的母鼠(C1組、C2組)可能因?yàn)橛懈嗟臅r(shí)間讓身體康復(fù)，得以在后期撫養(yǎng)過(guò)程中為仔鼠提供良性撫養(yǎng)，該良性支持有可能是C1、C2組仔鼠成年期體重恢復(fù)正常的原因[8]。

3.4母代體內(nèi)的MCMV可通過(guò)多種途徑感染子代

仔鼠唾液腺組織MCMV檢測(cè)結(jié)果顯示：6周時(shí)，A、B、C組仔鼠均有MCMV感染。提示母鼠不同時(shí)期MCMV感染，都有可能通過(guò)宮內(nèi)、分娩、母乳喂養(yǎng)或同伴生活等途徑感染仔鼠[9]。A、C組仔鼠的MCMV定量均高于B組，提示母鼠孕期MCMV暴露比既往感染的危害更大。

3.5孕早期MCMV暴露可影響子代一生的認(rèn)知學(xué)習(xí)能力

WMT評(píng)估仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的結(jié)果顯示：3周時(shí)，A1、C1、C2、C3組仔鼠的能力均低于正常(P<0.05)；6周時(shí)，C2、C3組仔鼠的能力恢復(fù)正常(P>0.05)，而A1、C1組仔鼠的能力仍低于正常(P<0.05)。結(jié)合6周齡仔鼠腦組織病理情況：A1、C1組仔鼠腦組織明顯異常，揭示母鼠孕早期MCMV暴露可影響仔鼠一生的學(xué)習(xí)記憶能力。原因可能是孕早期缺乏胎盤(pán)屏障，MCMV感染母鼠后，在胎兒新生神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)高度聚集，損害仔鼠的腦功能，該不良影響持續(xù)至其成年[10]。而孕中、晚期MCMV暴露的C2、C3組仔鼠，有胎盤(pán)屏障保護(hù)，其不良影響僅在短期內(nèi)表現(xiàn)：3周齡時(shí)認(rèn)知學(xué)習(xí)能力下降，可能是受母鼠撫養(yǎng)期不良行為影響而出現(xiàn)的暫時(shí)現(xiàn)象，成年群居生活可改善該不良影響。

3.6子代嬰幼期的行為學(xué)特征受母代撫養(yǎng)行為影響

OFT、TST、SPT結(jié)果顯示：3周時(shí)，A3、C1、C2、C3組仔鼠有明顯退縮行為(P<0.05)。提示孕期有MCMV暴露的A、C組母鼠身體機(jī)能受MCMV損害，從而影響母鼠的撫養(yǎng)行為及質(zhì)量，導(dǎo)致仔鼠嬰幼期的行為出現(xiàn)異常。

3.7子代成年期的行為學(xué)特征可能仍受母代不良撫養(yǎng)行為影響

OFT、TST、SPT結(jié)果顯示：6周時(shí)，僅C3組仔鼠有明顯退縮行為(P<0.05)。原因可能是C3組母鼠孕期初次感染MCMV，缺乏既往感染帶來(lái)的免疫保護(hù)(如A組或B組)，母鼠各器官功能受損更嚴(yán)重，加上孕晚期感染，身體尚未康復(fù)就要承受分娩勞累及產(chǎn)后激素變化的影響，使C3組母鼠身心疲憊，出現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的不良情緒及消極撫養(yǎng)行為，甚至可能貫穿整個(gè)撫養(yǎng)期，對(duì)仔鼠精神及行為的影響更加深遠(yuǎn)。這一發(fā)現(xiàn)與Jensen等[8]的研究報(bào)告相似，嬰幼兒期長(zhǎng)期缺乏關(guān)愛(ài)與照顧，不僅會(huì)影響子代的身體健康狀態(tài)，而且會(huì)導(dǎo)致其出現(xiàn)與母代類似的不良情緒及行為；若考慮同組群體效應(yīng)，情況可能更為嚴(yán)重。

綜上所述，CMV傳染性強(qiáng)，感染后可對(duì)宿主多器官造成不良影響，母代孕期感染可直接/間接影響子代身心健康成長(zhǎng)。因此，建議女性在計(jì)劃懷孕前至少3個(gè)月內(nèi)確認(rèn)既往HCMV感染的康復(fù)情況，以保證身體可承受妊娠及產(chǎn)后撫養(yǎng)的相關(guān)重任。對(duì)于無(wú)既往感染史者，建議其在孕早期及孕晚期也進(jìn)行HCMV的檢測(cè)，防治孕期原發(fā)感染的危害，保障母嬰身心健康。