馮曉慧，關 鑫，畢海丹，呂 慧，張立華，金 婷*

（棗莊學院 食品科學與制藥工程學院，山東 棗莊 277160）

黑莓酒是以黑莓為原料經(jīng)過微生物發(fā)酵而成的低度飲料酒，其最大限度地保留了黑莓果實中的營養(yǎng)成分和保健功能因子，長期飲用具有美容養(yǎng)顏、降血壓、降血脂、保護血管、減緩衰老等功效[1]。黑莓渣是黑莓酒加工的主要副產(chǎn)物，常被作為廢物丟棄造成浪費。黑莓渣中含有花色苷[2]、多糖[3]、抗氧化物質(zhì)[4]、原花青素[5]、黃酮與多酚類[6]及黑莓籽油[7]等成分。其中黑莓籽約占黑莓渣的80%左右，而油脂含量占其干質(zhì)量的15%～23%。黑莓籽油中富含亞油酸，油酸和棕櫚酸等不飽和脂肪酸[8]，具有較高的藥用價值及保健作用。目前對新鮮的黑莓籽油成分檢測較多，對于酒渣黑莓籽油檢測研究較少。

提取黑莓籽油常用的方法有壓榨法[9]、溶劑浸提法[10]、超聲波輔助溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法等[11]。壓榨溶劑浸提等傳統(tǒng)方法物耗高、時間長、收率低、勞動強度大；超聲波輔助提取所需時間較長，而超臨界流體萃取由于設備復雜、運行成本高、提取范圍有限等缺點使其應用受到限制。微波萃取利用微波快速加熱的特性[12]，并結合傳統(tǒng)溶劑提取法而形成的一種針對固體樣品成分提取的新萃取技術，具有快速、節(jié)省溶劑、加熱均勻，能量利用率高等優(yōu)點[13]。

本試驗采用微波輔助提取法提取黑莓渣中的油脂，運用主成分分析（principal component analysis，PCA）與響應面試驗相結合，對黑莓籽油提取工藝條件進行綜合研究，并利用氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）對所提取的黑莓籽油中脂肪酸的種類和含量進行測定，分析酒渣黑莓籽中所提取的油脂與跟新鮮黑莓籽油的差別，為黑莓酒釀造副產(chǎn)物再利用的研究提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒渣黑莓籽：釀造黑莓酒剩余酒渣中的黑莓籽；新鮮黑莓籽：新鮮黑莓用原汁機去除果汁，取果渣中的黑莓籽；

石油醚（30～60 ℃）、甲醇、氫氧化鉀、苯（均為分析純），無水硫酸鈉（分析純）：德州潤昕實驗儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

XH-200A微波萃取儀：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；TDL-40B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司；V82原汁機：九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑莓籽油的制備工藝流程及操作要點

黑莓籽清洗→干燥→粉碎→稱取→與有機溶劑混合→微波萃取→離心取濾液→旋轉蒸發(fā)→干燥→黑莓籽油

操作要點：將黑莓籽洗凈，放入40～45 ℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定后粉碎、過篩，稱取5 g黑莓籽粉于錐形瓶中，加入一定比例的石油醚，于微波萃取儀中進行微波輔助萃取。萃取后以4 000 r/min離心分離上清與殘渣，洗滌殘渣2～3次，合并上清液，于旋轉蒸發(fā)儀中減壓蒸餾，100 ℃干燥至質(zhì)量恒定，得到黑莓籽油，每組試驗重復3次，取平均值。

1.3.2 黑莓籽油提取率的計算

黑莓籽油提取率計算公式如下：

式中：m1為圓底燒瓶和黑莓籽油的質(zhì)量，g；m2為圓底燒瓶的質(zhì)量，g；m為干燥黑莓籽粉的質(zhì)量，g。

1.3.3 微波輔助提取單黑莓籽油因素試驗

設定料液比1∶10（g∶mL）、提取溫度60 ℃、提取時間5 min、微波功率500 W、提取次數(shù)3次、粉碎粒度60目為微波提取條件，分別考察提取溶劑（石油醚、乙醇、乙醚、正己烷）、料液比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）（g∶mL）、提取溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）、提取時間（4 min、5 min、6 min、7min、8min）、微波功率（300W、400W、500W、600W、700W）、提取次數(shù)（1次、2次、3次、4次、5次）、過篩目數(shù)（30目、40目、50目、60目、70目）對黑莓籽油提取率的影響，并通過主成分分析選出3個主要成分進行響應面試驗。

1.3.4 響應面法優(yōu)化黑莓籽油提取條件

在單因素試驗基礎上，結合主成分分析所得結果，選擇提取時間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）3個因素為自變量，以提取率為響應值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，設計響應面試驗，試驗各因素編碼取值見表1。

表1 黑莓籽油提取條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis for blackberryseed oil extraction conditions optimziation

1.3.5 脂肪酸成分分析

（1）脂肪酸的甲基化

取黑莓籽油30 μL置于10 mL容量瓶內(nèi)，加入石油醚與苯體積比為1∶1的混合液，振搖使油脂溶解后，再加入1 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，混勻后在室溫條件下靜置30 min[14]，加入蒸餾水，靜置取上清液，加少量無水硫酸鈉干燥，取干燥后的上層清液用0.22 μm有機濾膜過濾，濾液進行GC-MS分析。

（2）氣相色譜條件

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱。升溫程序：由室溫升至100 ℃保持5 min，然后以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min；進樣量0.2 μL；載氣：氦氣（He），流速：1 mL/min。分流比：20∶1；溶劑延遲3 min。

（3）質(zhì)譜條件

離子源：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源掃描溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；倍增器電壓：1 376 V；電子能量：70 eV，發(fā)射電流：34.6 μA；接口溫度：230 ℃；質(zhì)量掃描范圍：50～550 m/z。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗結果運用SPSS19.0軟件進行主成分分析。利用Design Expert 8.0.6設計響應面試驗，從而優(yōu)化得到超聲波輔助提取黑莓籽油的最佳工藝條件。脂肪酸組成分析采用美國國家標準與技術研究院（national institute of standards andtechnology，NIST）14數(shù)據(jù)庫檢索，與標準譜圖對照、比較，確認黑莓籽油的化學成分，并按峰面積歸一化計算各峰面積的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 微波輔助提取條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 溶劑對黑莓籽油提取率的影響

本試驗分別以石油醚、乙醇、乙醚、正己烷為萃取劑，考察不同溶劑萃取對黑莓籽油提取率的影響，結果見圖1。

由圖1可知，石油醚和正己烷提取率相對較高，無水乙醇和乙醚相對較低。由于正己烷的市場價格相對于石油醚偏高，在允許條件下，本試驗采用石油醚為萃取劑。

圖1 溶劑對黑莓籽油提取率的影響Fig.1 Effect of different solvents on the extraction rate of blackberry seed oil

2.1.2 工藝條件對黑莓籽油提取率的影響

不同工藝條件對新鮮黑莓籽油提取率的影響見圖2。由圖2A可知，當料液比為1∶4～1∶8（g∶mL）時，隨著萃取劑用量的增加，料液接觸面的濃度差增大，油脂易于浸出，提取率顯著增加，料液比在1∶10（g∶mL）時達到16.90%，此后原料大部分油脂已經(jīng)提出，提取率趨于穩(wěn)定。由圖2B可知，溫度的升高會降低提取劑的表面張力和黏性，提高對樣品的溶解力，故提取溫度在30～60 ℃之間時，黑莓籽油提取率顯著增加，在60 ℃時提取率最高達到17.14%，但溫度過高會引起溶劑揮發(fā)，降低提取率。由圖2C可知，隨著時間的增加，微波輻射能加快油脂向溶劑中擴散，提取率顯著增加，提取時間為5 min時達到17.23%，當溶解度達到飽和后，溶劑的揮發(fā)導致提取率降低。由圖2D可知，微波功率的增加會加快油脂分子運動速率，使得提取率增加，功率到達500 W時提取率最高為16.92%，但微波功率過高，可能導致部分油脂氧化分解發(fā)生副作用，溶劑揮發(fā)導致提取率降低[15]。由圖2E可知，提取率在提取次數(shù)為3次時提取率最高為16.84%，提取次數(shù)的增加可以使物料中的油脂更好更全面的被提取出來，但隨著提取次數(shù)的增加，溶劑揮發(fā)現(xiàn)象嚴重，導致提取率下降。由圖2F可知，通常物料粉碎粒徑越小，料液接觸的面積越大，提取率越高，在過篩目數(shù)為30～60目時，提取率隨著目數(shù)增加達到17.25%，但隨著物料粒徑不斷減小，液體表面張力作用又抑制溶劑浸入，降低油脂浸出量，因此出油率增幅減緩[16]。因此選擇最佳工藝條件為料液比1∶10（g∶mL），提取溫度60 ℃，提取時間5 min，微波功率500 W，提取次數(shù)3次，過篩目數(shù)60目。

圖2 工藝條件對黑莓籽油提取率的影響Fig.2 Effect of technological conditions on the extraction rate of blackberry seed oil

2.2 黑莓籽油提取單因素試驗結果主成分分析

主成分分析對多個單因素的綜合考量有幫助，可以確定各因素在某一試驗結果中所占比例的大小[17]。根據(jù)影響黑莓籽油提取的6個單因素指標，利用SPSS 19.0軟件進行主成分分析，相關矩陣的主成分分析結果見表2、表3。

表2 主成分的特征值、方差貢獻率和累計方差貢獻率Table 2 Eigenvalue,variance contribution rate and cumulative variance contribution rate of principal components

表3 主要質(zhì)地參數(shù)相關矩陣的規(guī)格化特征向量Table 3 Normalized eigenvectors of the correlation matrix of major texture parameters

經(jīng)分析，共抽取了4個主成分，第一成分累計方差貢獻率達到80.637%。綜合影響黑莓籽油提取率指標的大部分信息，選用第一成分中前3個主成分（物料比、提取時間、提取溫度）對黑莓籽油提取率進行分析。

2.3 響應面法優(yōu)化微波輔助提取黑莓籽油工藝

2.3.1 黑莓籽油提取條件優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗基礎上，結合主成分分析的結果，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）原理，選擇提取時間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）3個因素為自變量，以提取率為響應值，按照Design-Expert 8.0.6軟件設計響應面試驗，試驗結果見表4。

表4 黑莓籽油提取條件優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 4 Design and results of response surface experiments for blackberry oil extraction condition optimization

2.3.2 響應面模型的建立及顯著性分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多項式擬合回歸，以黑莓籽油的提取率（Y）為因變量，提取時間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）為自變量，建立回歸方程如下：

采用Design-Expert對試驗結果進行方差分析，分析結果見表5。

表5 響應面試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of response surface experiments results

由表5可知，一次項C，交互項AB對Y值的影響顯著（P＜0.05），一次項A、B、二次項A2、B2對Y值的影響極顯著（P＜0.01）；由各因素F值的大小得出對提取率影響最大的因素為提取時間（A）和溫度（B），其次是料液比（C）。響應面優(yōu)化擬合出的方程回歸項極顯著（P＜0.000 1），且失擬項P值0.744 2＞0.05，說明本試驗所得二次回歸方程高度顯著，能夠很好地對響應值進行預測。根據(jù)表5分析結果，作出提取溫度和提取時間交互作用對于響應值影響的響應面及等高線見圖3。

圖3 提取溫度和提取時間交互作用對黑莓籽油提取率影響的響應面和等高線Fig.3 Response surface plot and contour line of effects of interaction between extraction temperature and time on extraction efficiency of blackberry seed oil

由圖3可知，提取溫度和提取時間交互作用對結果影響顯著（P＜0.05）。

2.3.3 最優(yōu)條件的求證及驗證

最后通過軟件Design-Expert 8.0.6求解，得優(yōu)化的黑莓籽油提取條件為料液比1∶11.56（g∶mL）、提取溫度65.55 ℃、提取時間5.54 min，在此條件下黑莓籽油的理論提取率17.40%。為了方便試驗操作，將提取條件改為料液比1∶11（g∶mL）、提取溫度65 ℃、提取時間5 min，微波功率500 W，過篩目數(shù)60目，提取次數(shù)為3次。在此優(yōu)化條件下，進行3次驗證試驗，結果取平均值，提取率實際值為17.32%，與理論值相差0.08%。最后，使用優(yōu)化后的試驗方案重新制備黑莓籽油。

2.4 新鮮黑莓籽油與酒渣黑莓籽油成分分析結果

進行微波提取后的黑莓籽油甲酯化后進行GC-MS分析，其脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖見圖4。經(jīng)NIST14數(shù)據(jù)庫檢索，與標準譜圖對照、比較，確認黑莓籽油的化學成分，并按峰面積歸一化計算各峰面積的相對含量，結果見表6。

圖4 酒渣黑莓籽油（A）、新鮮黑莓籽油（B）GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of blackberry seed oil extracted from wine residue (A) and from fresh blackberry (B) by GC-MS analysis

表6 黑莓籽精油化學成分分析結果Table 6 Analysis results of chemical components of blackberry seed oil

由表6可見，新鮮黑莓籽油中脂肪酸含量及種類（92.91%，11種）均高于酒渣黑莓籽油（83.47%，7種），朱紅葉等[18]檢測出酒渣黑莓籽油中含有4種脂肪酸。葉華[19]分析黑莓酒中香氣成分時發(fā)現(xiàn)，其中含有21種酯類成分，嚴蕊等[20]在黑莓酒中檢測出了9種酯類成分。因此，酒渣黑莓籽油中的一些小含量脂肪酸很可能已經(jīng)融入黑莓酒中。

本實驗所檢出的脂肪酸，除了甲酯化產(chǎn)物外還有一部分乙酯化產(chǎn)物，酒渣黑莓籽油中亞油酸乙酯（14.95%）和油酸乙酯（9.44%）的含量遠大于新鮮黑莓籽油（1.99%和1.12%）?？赡芤驗樵诤谳频纳a(chǎn)過程中，黑莓籽與發(fā)酵產(chǎn)物乙醇接觸，部分發(fā)生酯化反應[21]。劉麗娜等[22]在對新鮮紅樹莓籽油的研究中也發(fā)現(xiàn)部分乙酯的存在，但脂肪酸乙酯的含量比甲酯的含量低，可能是一些其他反應造成的。亞油酸乙酯主要用作防治動脈粥樣硬化癥的藥物原料，油酸乙酯、硬脂酸乙酯和棕櫚酸乙酯都有特殊的香氣，可以為黑莓酒提供香氣來源[23]。因此，乙酯的存在不僅不會對酒渣黑莓籽油的營養(yǎng)成分造成影響，反而會增加籽油的香味[24]。

新鮮黑莓籽油與酒渣黑莓籽油中脂肪酸均以不飽和脂肪酸為主，分別占總脂肪酸的73.13%和85.36%；其中亞油酸含量最高，其次為α-亞麻酸，二者在釀酒前后黑莓籽油中占總脂肪酸比例分別為67.70%和72.00%。雖然酒渣黑莓籽油中總脂肪酸含量相對減少了，但是不飽和脂肪酸總相對含量及亞油酸和α-亞麻酸含量卻有所增加，且釀酒前后亞油酸與α-亞麻酸比值相近（2.76∶1和2.42∶1），均低于4∶1[25]，符合國內(nèi)外營養(yǎng)學規(guī)定，具有很好的食用價值及保健作用。綜上所述，酒渣黑莓籽油雖脂肪酸種類及含量低于新鮮黑莓籽油，但亞油酸和α-亞麻酸的相對含量都有所增加，且乙酯含量明顯大于新鮮黑莓籽油。

3 結論

本試驗通過響應面法確定黑莓籽油的最佳提取工藝為料液比1∶11（g∶mL）、提取溫度65 ℃、提取時間5 min，此條件下黑莓籽油提油率為17.32%。采用氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測出酒渣黑莓籽油中脂肪酸的總含量及種類均低于新鮮黑莓籽油，但其不飽和脂肪酸總相對含量及亞油酸和α-亞麻酸的相對含量都有所增加。此外，酒渣黑莓籽油中亞油酸乙酯（14.95%）和油酸乙酯（9.44%）的含量遠大于新鮮黑莓籽油（1.99%和1.12%）。通過對釀酒前后黑莓籽油成分差異的研究，為黑莓酒渣的綜合利用提供參考。