張 杰，游新俠，陳彥彥，段秋虹*

（鄭州科技學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450064）

黑米屬于糯米類(lèi)，呈黑色或者褐色，營(yíng)養(yǎng)豐富，自古有“藥米”、“貢米”、“壽米”之稱(chēng)[1]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，黑米具有預(yù)防心腦血管疾病，降低甘油三酯、膽固醇，滋陰養(yǎng)腎，健脾開(kāi)胃，促進(jìn)兒童骨骼增長(zhǎng)，大腦發(fā)育等功效[2-3]。

蜂蜜酒是以蜂蜜和水為原料釀制而成的飲料酒，按生產(chǎn)工藝可以分為發(fā)酵型蜂蜜酒和蒸餾型蜂蜜酒[4-5]。因蜂蜜價(jià)格高昂，蜂蜜酒被稱(chēng)為貴族酒[6]。近年來(lái)關(guān)于傳統(tǒng)蜂蜜酒的工藝優(yōu)化及新型蜂蜜酒的研制多參照米酒、露酒和發(fā)酵酒的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[7-11]，直到2020年，陶樹(shù)興等[4]起草并通過(guò)了QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了蜂蜜酒的術(shù)語(yǔ)和定義、技術(shù)要求、分析方法、檢驗(yàn)規(guī)則和標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸和儲(chǔ)存，使得蜂蜜酒的研制、生產(chǎn)、檢驗(yàn)和銷(xiāo)售得以正規(guī)化。

我國(guó)對(duì)蜂蜜酒的研究較少，目前研究主要集中在純蜂蜜酒[12-15]、中草藥蜂蜜酒[16-19]和水果蜂蜜酒[20-23]等幾個(gè)方面，對(duì)谷物蜂蜜酒的研制鮮有研究報(bào)道。杜剛等[15]從云南文山蜂蜜中分離純化出5株酵母菌，以菌株Y3作為發(fā)酵菌株對(duì)蜂蜜稀釋液進(jìn)行發(fā)酵，制得的純蜂蜜酒酒香和果香濃郁，其中含有41種揮發(fā)性成分。鄧加聰?shù)萚16]以南平野花蜂蜜、百合酶解液和紅曲作為原輔料，制得一款色澤清亮、酒香純正、具有營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值的紅曲百合蜂蜜酒。鄒璐[22]以紅棗、蜂蜜和水為原材料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化紅棗汁的浸提工藝和蜂蜜酒的發(fā)酵工藝，制得一款酒體協(xié)調(diào)、香味濃郁、酒精度為17.9%vol的發(fā)酵型紅棗蜂蜜酒。國(guó)外KOGUCHI M等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)，黑米和精白米能夠顯著提高蜂蜜酒的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力，但未對(duì)谷物類(lèi)蜂蜜酒加工工藝進(jìn)行優(yōu)化。因此，本研究以黑米和蜂蜜為試驗(yàn)材料，以感官評(píng)價(jià)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化黑米蜂蜜酒發(fā)酵工藝，旨在得到黑米蜂蜜酒的最佳發(fā)酵工藝條件，既能提高酒精度，又能保留蜂蜜酒特有的風(fēng)味，為谷物類(lèi)蜂蜜酒的多樣化發(fā)展提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米：延壽縣李氏米業(yè)有限公司；深山百花蜜（白利度≥42°Bx）：山東歸農(nóng)養(yǎng)蜂股份有限公司；甜酒曲、高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；純凈水：華潤(rùn)怡寶飲料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KFS-A1型電子稱(chēng)：浙江凱豐集團(tuán)有限公司；CFXB40BE型電飯煲：廣東浩特電器有限公司；LRH-150F型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQ-50A型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SN-HWS-26型恒溫水浴鍋：上海尚儀儀器設(shè)備有限公司；RHB-32ATC型糖度計(jì)：上海天壘儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑米蜂蜜酒釀造工藝流程[13]

1.3.2 操作要點(diǎn)

選米：稱(chēng)取適量的黑米，去除黑米中的雜質(zhì)、塵土、碎米與細(xì)糠。

浸泡：將黑米洗凈放置于潔凈容器中，加入清水沒(méi)過(guò)黑米浸泡12 h。

蒸煮：黑米瀝干水分后放置于蒸鍋中，按照液料比6∶1（mL∶g）加入冷水，表面打出小孔，常壓蒸煮40 min左右。

淋飯冷卻：把蒸好的黑米倒入潔凈容器中，用涼開(kāi)水沖淋黑米表面至易攪拌，再用筷子攤勻，使米飯內(nèi)外溫度冷卻至30 ℃左右。

拌曲糖化：選取適量的安琪酒曲，少量多次的灑在黑米上并攪拌均勻，用手輕輕壓實(shí)，再在表面加入少量的酒曲，黑米中間挖出酒窩，增大與空氣的接觸面積。

發(fā)酵：糖化結(jié)束后，接入適量活性干酵母以及與黑米質(zhì)量比1∶1的純凈水，置于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃發(fā)酵72 h，至發(fā)出濃厚的酒香。

過(guò)濾澄清：發(fā)酵好的蜂蜜酒用滅菌過(guò)的多層紗布過(guò)濾3次，靜置澄清。

滅菌：取澄清液的上清液，于80 ℃的條件下滅菌15～20 min，得到黑米蜂蜜酒。

1.3.3 黑米蜂蜜酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在前人研究的基礎(chǔ)上[24-25]，以100 g黑米為基準(zhǔn)，蜂蜜與黑米質(zhì)量比分別為4∶100、6∶100、8∶100、10∶100、12∶100（g∶g），酒曲添加量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（均以100 g黑米質(zhì)量計(jì)），發(fā)酵溫度分別為26℃、29℃、32℃、35℃、38℃，發(fā)酵時(shí)間分別為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，探究蜂蜜與黑米質(zhì)量比、酒曲添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響，以感官評(píng)價(jià)為主要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4 黑米蜂蜜酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，選取對(duì)結(jié)果影響較大的蜂蜜與黑米質(zhì)量比（A）、酒曲添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）為自變量，以感官評(píng)分為響應(yīng)值（Y），采用4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 黑米蜂蜜酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of black rice mead

1.3.5 黑米蜂蜜酒感官評(píng)價(jià)

黑米蜂蜜酒感官評(píng)分參照中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》，取50 g樣品于干凈的透明玻璃杯中，在自然光亮處，由10人組成評(píng)價(jià)小組，對(duì)酒液進(jìn)行評(píng)價(jià)，主要從色澤（10分）、香味（30分）、滋味（50分）、外觀（10分）四個(gè)方面依次對(duì)成品進(jìn)行評(píng)分，總分為100分，黑米蜂蜜酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 黑米蜂蜜酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of black rice mead

1.3.6 分析檢測(cè)

酒精度的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》的酒精計(jì)法測(cè)定；總酸、揮發(fā)性酸和總糖按國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Excel 2019和Design Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 蜂蜜與黑米質(zhì)量比對(duì)黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響

蜂蜜與黑米質(zhì)量比對(duì)黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響見(jiàn)圖1。由圖1 可知，當(dāng)原料比處于4∶100～6∶100（g∶g）時(shí)，蜂蜜酒中的蜂蜜風(fēng)味較淡，酒精度較低；當(dāng)蜂蜜與黑米質(zhì)量比在6∶100時(shí)，酒體風(fēng)味協(xié)調(diào)，口味較好，酒精度較高，為11.4%vol，此時(shí)蜂蜜酒感官評(píng)分最高，為82.3分；隨著蜂蜜與黑米質(zhì)量比的不斷增加，初始糖度逐漸增大，當(dāng)蜂蜜與黑米質(zhì)量比＞8∶100（g∶g）時(shí)，酒液開(kāi)始變渾濁，高滲透壓抑制了部分釀酒酵母的生物活性[5，14]，酒精度有所下降，蜂蜜味較濃，感官評(píng)分有所降低。綜合考慮，最佳蜂蜜與黑米質(zhì)量比為6∶100。

圖1 蜂蜜與黑米質(zhì)量比對(duì)黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響Fig.1 Effects of mass ratio of honey and black rice on alcohol content and sensory evaluation of black rice mead

2.1.2 酒曲添加量對(duì)黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響

酒曲添加量對(duì)黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著酒曲添加量在0.2%～1.0%范圍內(nèi)的增加，蜂蜜酒的酒精度與感官評(píng)分呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)酒曲添加量在0.2%～0.6%時(shí)，蜂蜜酒的酒精度與感官評(píng)分隨酒曲添加量增加而增高；當(dāng)酒曲添加量在0.6%時(shí)，蜂蜜酒的酒精度與感官評(píng)分最高，分別為11.4%vol、80.4分；當(dāng)酒曲添加量＞0.6%之后，過(guò)量的酵母會(huì)額外消耗掉蜂蜜酒中的糖分用于生長(zhǎng)繁殖，不利于酒精發(fā)酵，酒精度有所下降，導(dǎo)致黑米蜂蜜酒整體風(fēng)味有所下降[13]。綜合考慮，酒曲的最佳添加量為0.6%。

圖2 酒曲添加量對(duì)黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響Fig.2 Effects of Jiuqu addition on alcohol content and sensory evaluation of black rice mead

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響

發(fā)酵溫度對(duì)黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)品質(zhì)的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，當(dāng)蜂蜜酒發(fā)酵溫度為26～32 ℃時(shí)，黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)隨發(fā)酵溫度增加而逐漸提高，由于溫度偏低導(dǎo)致微生物發(fā)酵不完全，酒香味低，黑米風(fēng)味不明顯；當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到32 ℃時(shí)，發(fā)酵速度明顯加快，微生物代謝旺盛，酒香味明顯，此時(shí)酒精度及感官評(píng)分最高，分別為11.4%vol、82.7分；當(dāng)發(fā)酵溫度高于32 ℃之后，微生物生長(zhǎng)繁殖加快，容易造成酵母菌早衰，而雜菌代謝旺盛[26]，酒精度降低，蜂蜜酒品質(zhì)迅速變差，同時(shí)酒體開(kāi)始渾濁，導(dǎo)致感官評(píng)價(jià)值偏低。綜合考慮，最佳發(fā)酵溫度為32 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on alcohol content and sensory evaluation of black rice mead

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在24～120 h范圍內(nèi)的增加，蜂蜜酒的感官評(píng)分呈現(xiàn)先迅速增加后緩慢降低的趨勢(shì)，酒精度呈現(xiàn)先迅速升高后趨于不變的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24～72 h時(shí)，黑米蜂蜜酒酒精度與感官評(píng)價(jià)隨發(fā)酵時(shí)間增加而逐漸提高，由于發(fā)酵時(shí)間較短，大部分釀酒酵母處于增殖階段，酒精產(chǎn)量較少，酒精度較低，導(dǎo)致風(fēng)味相對(duì)不明顯；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在72 h時(shí)，蜂蜜酒感官評(píng)分最高，為81.9分，酒精度為11.5%vol；而當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞72 h之后，由于發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，酒精度雖然仍緩慢升高，但由于菌體開(kāi)始出現(xiàn)衰亡自溶，口感會(huì)呈現(xiàn)出苦味，酒體不協(xié)調(diào)，導(dǎo)致感官評(píng)分較低[18]。綜合考慮，最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑米蜂蜜酒產(chǎn)品酒精度與感官評(píng)價(jià)的影響Fig.4 Effects of fermentation time on alcohol content and sensory evaluation of black rice mead

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以感官評(píng)分作為響應(yīng)值（Y），蜂蜜與黑米質(zhì)量比（A）、酒曲添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）為自變量，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，篩選出黑米蜂蜜酒的最佳發(fā)酵工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 黑米蜂蜜酒的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for black rice mead

續(xù)表

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

采用Design Expert.V8.0.6軟件對(duì)表3中的結(jié)果進(jìn)行回歸擬合和方差分析，得到模型的二次多項(xiàng)回歸方程為：

根據(jù)表4可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.720 0＞0.05），表明理論和實(shí)際值偏差很小，擬合度較高，得到的方程可以很好地預(yù)測(cè)結(jié)果。一次項(xiàng)A、B、D對(duì)黑米蜂蜜酒感官評(píng)分的影響極顯著（P＜0.01）。決定系數(shù)R2=0.970 4，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.940 9，可知此模型中的94.09%黑米蜂蜜酒的感官評(píng)分變化來(lái)自于自變量A、B、C、D。通過(guò)F值和顯著水平得到影響感官評(píng)分的各因素順序?yàn)榫魄砑恿浚˙）＞發(fā)酵時(shí)間（D）＞原料比（A）＞發(fā)酵溫度（C）。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用

各因素交互作用對(duì)黑米蜂蜜酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面及等高線見(jiàn)圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)黑米蜂蜜酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the sensory score of black rice mead

由圖5可知，當(dāng)原料比（A）、酒曲添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）兩兩交互作用時(shí)，對(duì)黑米蜂蜜酒感官評(píng)價(jià)均有影響，但影響不夠顯著，各響應(yīng)曲面陡峭程度存在一定差異。AB坡面上感官評(píng)分隨著A、B的增加呈現(xiàn)先快速升高后緩慢降低的趨勢(shì)，AC、AD、BC、BD、CD坡面上感官評(píng)分隨著A、B、C、D的增加均呈現(xiàn)先緩慢升高后快速降低的趨勢(shì)，能夠說(shuō)明存在感官評(píng)分的最大值點(diǎn)。

由Design Expert.V8.0.6軟件預(yù)測(cè)得出黑米蜂蜜酒最佳發(fā)酵工藝為：蜂蜜與黑米質(zhì)量比6∶100（g∶g）、酒曲添加量0.56%、發(fā)酵溫度32.50 ℃、發(fā)酵時(shí)間78.11 h，此時(shí)感官評(píng)分理論值為85.7分。為了便于實(shí)際操作，將發(fā)酵工藝修正為蜂蜜與黑米質(zhì)量比6∶100（g∶g）、酒曲添加量0.6%、發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時(shí)間78 h。在此優(yōu)化發(fā)酵工藝下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，感官評(píng)分實(shí)際值為87.1分，與預(yù)測(cè)值相差不大，表明該工藝可行。

2.3 產(chǎn)品理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

將優(yōu)化工藝釀制出的黑米蜂蜜酒進(jìn)行理化指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 黑米蜂蜜酒理化檢測(cè)結(jié)果Table 5 Physical and chemical test results of black rice mead

3 結(jié)論

通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)得到黑米蜂蜜酒最佳發(fā)酵工藝條件為蜂蜜與黑米質(zhì)量比6∶100、酒曲添加量0.6%、發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時(shí)間78 h。在此優(yōu)化條件下，感官評(píng)分為85.7分，酒精度為12.7%vol，總酸（以乙酸計(jì)）為4.5 g/L，揮發(fā)性酸（以乙酸計(jì)）為0.8 g/L，總糖為57.2 g/L。黑米蜂蜜酒呈酒紅色，酒體協(xié)調(diào)，色澤均勻，底部無(wú)明顯沉淀物，酒味濃郁無(wú)明顯酸味和苦澀味，兼有黑米和蜂蜜特殊風(fēng)格，口感更為爽口。本研究可為我國(guó)蜂蜜酒大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。