母應(yīng)春，姜 麗，蘇 偉

（貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

米酒一直以營養(yǎng)物質(zhì)含量高、保健養(yǎng)生而著稱，作為我國傳統(tǒng)的低度發(fā)酵酒，在制酒過程中微生物代謝不僅賦予其獨特的風(fēng)味和口感，還具有豐富的營養(yǎng)成分和特殊的食療功效[1]。酒曲是在特定的生態(tài)環(huán)境中，用成曲作為種子培養(yǎng)制作而成，含有細菌和真菌在內(nèi)的大量微生物，對米酒品質(zhì)的形成起著決定性作用[2]，因而有“曲是酒之骨”之稱。酒曲在米酒釀造過程中起糖化發(fā)酵的作用，酒曲中富集的微生物種類及產(chǎn)生的酶可直接影響發(fā)酵酒的品質(zhì)[3]。因此，不同酒曲發(fā)酵的米酒品質(zhì)會存在差異。

盤州彝族米酒采用特色的自制彝族酒曲釀制而成，酒曲中加入多種僅當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的中草藥及其他材料混合制成，酒曲中微生物種類繁多。酒曲的微生物種類、數(shù)量和相互作用對于米酒的正常發(fā)酵非常重要，這決定了米酒的出酒率和風(fēng)味品質(zhì)[4]。HUANG Z R等[5]研究了武夷紅曲糯米酒釀造過程中酒曲微生物與風(fēng)味形成的關(guān)系，最后確定酒曲中的葡糖醋酸桿菌、乳酸桿菌，乳球菌3種細菌屬和畢赤酵母、威克漢姆西弗酵母、釀酒酵母3種真菌屬對風(fēng)味貢獻最大。仲楨玉等[6]研究了5種不同酒曲發(fā)酵葛根酒中的揮發(fā)性物質(zhì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同酒曲發(fā)酵的葛根酒所產(chǎn)生的揮發(fā)性氣味差異較大。目前關(guān)于彝族酒曲的報道尚且較少。本研究主要采用兩種酒曲發(fā)酵米酒，檢測發(fā)酵期間米酒基本品質(zhì)的變化及成品米酒風(fēng)味物質(zhì)成分，為穩(wěn)定米酒特有風(fēng)味物質(zhì)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純凈水：市售；糯米：貴陽市花溪區(qū)的優(yōu)質(zhì)糯米；酒曲1：貴州省盤州市淤泥河某酒廠提供；酒曲2：酒曲1與純種根霉曲（Rhizopus oryzae）（貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所）按1∶1比例混合。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-420恒溫培養(yǎng)箱：天津天泰儀器有限公司；FW100粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-D循壞水式多用真空泵：鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司；酒精計：河北省武強縣同輝儀表廠；HH-S6電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；pHS25pH酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3方法

1.3.1 米酒的加工工藝流程及操作要點

（1）浸米：糯米需清洗2～3次，去除雜質(zhì)后瀝干水分，加水浸泡5 h左右，根據(jù)環(huán)境的溫度可適當(dāng)調(diào)整浸泡時間的長短，浸泡到米粒中心有明顯的裂紋，用手指能輕易碾碎即可。

（2）蒸飯：把浸泡后的米瀝干，放在蒸屜上大火蒸至米粒尚有白心后改小火蒸至米粒白心消失。

（3）冷卻：糯米蒸煮結(jié)束后，取出待溫度降到30～35℃左右。

（4）拌曲：按照實驗設(shè)計分別加入3.2%的酒曲1和酒曲2，邊加邊攪拌，盡量使每一粒米上都附著酒曲。

（5）前發(fā)酵：用紗布分別將兩組拌好酒曲的米粒放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待24 h左右，附著酒曲的米粒松散開并長了白毛即可用消毒滅菌好的發(fā)酵罐裝罐，并按照熟米∶水（1∶2）的比例加入涼開水。蓋好發(fā)酵膜，貼好組別標(biāo)簽。放入26℃恒溫條件下持續(xù)發(fā)酵。

（6）后發(fā)酵：待發(fā)酵罐中的米粒漂浮在酒液表面上，一般是裝罐后24 h左右，用保鮮膜密封發(fā)酵罐，使醪液密封發(fā)酵。

（7）檢測：在裝罐后發(fā)酵的第5、10、15、20、25、30天分別取出兩組發(fā)酵酒樣測定各項基礎(chǔ)性指標(biāo)，每個指標(biāo)三組平行，并記錄其數(shù)據(jù)。

1.3.2 酒曲液化能力的測定

酒曲液化力的測定方法參考傅金泉[7]的方法，液化力是指每克干曲在30℃溫度條件下經(jīng)過1 h液化淀粉的克數(shù)[g（/g·h）]。

1.3.3 酒曲糖化能力的測定

酒曲糖化力的測定參考傅金泉的檢測方法，采用菲林試劑法[8]。

1.3.4 酒精度的測定

酒精度的檢測采用GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》中蒸餾法，米酒經(jīng)過蒸餾以后，用酒精計來測定最終餾出液中酒精度[9]。

1.3.5 氨基酸態(tài)氮和總酸含量的測定

用酸堿中和法對氨基酸態(tài)氮和總酸含量進行測定，氨基酸是一種兩性化合物，甲醛可與氨基酸分子上的氨基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)后氨基失去堿性，而使羧基呈現(xiàn)酸性?？捎脷溲趸c的溶液來滴定羧基，計算氨基酸態(tài)氮含量[10]。

1.3.6 總糖的測定

根據(jù)黃酒的國家標(biāo)準(zhǔn)利用亞鐵氰化鉀滴定法測定總糖的含量[10]。

1.3.7 可溶性固形物的測定

可溶固形物的測定方法按照折光計法進行測定[11]。

1.3.8 米酒風(fēng)味物質(zhì)的測定

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技術(shù)對兩種米酒進行主要成分的檢測[12]。本研究采集的數(shù)據(jù)由貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測檢驗中心進行，自動生成色譜峰后進行質(zhì)譜庫比對，所有比對將結(jié)果自動生成“峰表”。根據(jù)“峰表”中獲得各主要風(fēng)味物質(zhì)的含量原始數(shù)據(jù)，進行數(shù)據(jù)的提取和數(shù)據(jù)的預(yù)處理，用氣質(zhì)聯(lián)用儀對其進行分離和鑒定。

揮發(fā)性成分提?。焊鶕?jù)尚柯等[13]采用的方法，量取5 mL酒樣加入0.5mL乙酸丁酯內(nèi)標(biāo)溶液，充分混勻后用于GC-MS分析，且在同等條件下測定并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

氣相色譜條件：樣品通過HP-FFAP色譜柱（50m×200μm，0.33 μm）進行分離；程序升溫：50℃（1 min）；以6℃/min升溫至80℃（2 min）；再以6℃/min升溫至200℃（5 min）；再以20℃/min升溫至220℃（5 min）；進樣口溫度250℃；載氣：氦氣（He）；流速：1.0 mL/min；樣液進樣量：1.0 μL。

質(zhì)譜條件：離子源溫度：250℃；電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量：70 eV；單離子監(jiān)測（single ion monitoring，SIM）模式掃描。對采集得到的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，核對Nist2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，用峰面積歸一化法測定了各化學(xué)成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酒曲酶活力比較結(jié)果

糖化、液化能力是衡量酒曲發(fā)酵能力的重要指標(biāo)，兩種酒曲的酶活力測定結(jié)果見表1。由表1可知，兩種酒曲的糖化力、液化力的變化趨勢均是酒曲2＞酒曲1，說明混合曲能夠有效提高酶活力，因此，混合酒曲的效果更好。

表1 酒曲酶活力測定結(jié)果Table1 Determination results forJiuquenzyme activity

2.2 不同酒曲發(fā)酵米酒的pH比較

米酒pH隨時間的變化趨勢見圖1。由圖1可知，兩種酒曲發(fā)酵的米酒在發(fā)酵過程中pH都是隨著發(fā)酵的時間延長呈穩(wěn)步上升的趨勢，發(fā)酵20d后大致呈平穩(wěn)趨勢，pH分別為3.8和3.9左右。剛開始時各種微生物快速生長繁殖，因細菌的傳代時間比酵母要短得多，所以快速生長繁殖酒產(chǎn)生乳酸和乳酸桿菌素，使得pH值較低。隨著發(fā)酵時間的增長，酒精的積累和大分子物質(zhì)的分解和弱堿性物質(zhì)的大量增加，pH值開始升高。酒曲2發(fā)酵酒的pH在各階段都比酒曲1發(fā)酵酒的pH高。兩種酒的pH變化趨勢與閻文飛等[14]對黃酒發(fā)酵過程中pH的變化趨勢基本一致。

圖1 不同酒曲對發(fā)酵米酒pH值的影響Fig.1 Effect of differentJiuquon pH value of fermented rice wine

2.3 不同酒曲發(fā)酵酒的總酸比較

不同酒曲發(fā)酵酒的總酸隨時間的變化見圖2，由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，兩種酒的總酸含量都呈現(xiàn)上升趨勢，酒曲1發(fā)酵酒的總酸含量最高達到4.52 g/L，酒曲2發(fā)酵酒的總酸含量最高達到3.58 g/L。從整個發(fā)酵過程來看酒曲1發(fā)酵酒的總酸含量均高于酒曲2發(fā)酵的酒。這可能與酒曲中微生物種類及發(fā)酵特性有關(guān)。

圖2 不同酒曲對發(fā)酵米酒總酸含量的影響Fig.2 Effect of differentJiuquon total acid contents in fermented rice wine

2.4 不同酒曲發(fā)酵酒的氨基酸態(tài)氮比較

不同酒曲發(fā)酵酒的氨基酸態(tài)氮含量隨時間的變化見圖3。由圖3可知，兩種酒的氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵過程中均呈上升趨勢。酒曲1發(fā)酵酒的氨基酸態(tài)氮含量變化沒有酒曲2發(fā)酵酒的穩(wěn)定，酒曲2發(fā)酵酒的氨基酸含量總體呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，到25 d時達到最大0.3 g/L。這可能是在發(fā)酵初期原料及酒曲中的蛋白質(zhì)被酵母菌和霉菌等微生物代謝的多種蛋白酶快速的分解成低分子氨基酸、肽，促使酒液中氨基酸的含量快速增加[15]。結(jié)果表明酒曲2發(fā)酵的酒的品質(zhì)和風(fēng)味都要高于酒曲1發(fā)酵的酒。

圖3 不同酒曲對發(fā)酵米酒的氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of differentJiuquon amino acid nitrogen contents in fermented rice wine

2.5 不同酒曲發(fā)酵米酒的可溶性固形物比較

不同酒曲發(fā)酵酒的可溶性固形物隨時間的變化見圖4。由圖4可知，酒曲1發(fā)酵酒和酒曲2發(fā)酵酒的可溶性固形物含量均呈先下降后又緩慢上升的趨勢，在15～20 d時最低，總體是酒曲2發(fā)酵酒中的可溶性固形物多于酒曲1發(fā)酵酒，可能是因為酒曲2是混合酒曲，微生物含量相對較多。

圖4 不同酒曲對發(fā)酵米酒的可溶性固形物含量的影響Fig.4 Effects of differentJiuquon soluble solids contents in fermented rice wine

2.6 不同酒曲發(fā)酵米酒的酒精度比較

不同酒曲發(fā)酵酒的酒精度隨時間的變化趨勢見圖5。由圖5可知，兩種酒曲釀造的米酒在發(fā)酵過程中，酒精度呈現(xiàn)上升趨勢，在25 d時達到最高，分別為8%vol和10%vol，但酒曲2發(fā)酵的酒的酒精度明顯高于酒曲1發(fā)酵的酒。原因是酒曲2是采用盤州酒曲與根霉曲按1∶1比例混合的，而盤州酒曲中含有較多根霉與酵母，糖化酶活力和液化酶活力較高，糖類物質(zhì)在酵母的作用下更多的轉(zhuǎn)化為乙醇，使米酒中的酒精度含量增高。

圖5 不同酒曲對發(fā)酵米酒的酒精度的影響Fig.5 Effect of differentJiuquon the alcohol contents of fermented rice wine

2.7 不同酒曲發(fā)酵米酒的總糖比較

不同酒曲對發(fā)酵酒總糖含量的影響見圖6。由圖6可知，整個發(fā)酵過程中酒曲2發(fā)酵米酒的總糖含量高于曲1發(fā)酵的米酒，因為酒曲2的糖化力高，微生物分解淀粉為糖的能力強，提高了酒液的總糖含量。酒液中的總糖含量隨著發(fā)酵時間的延長，呈現(xiàn)遞減且趨于平穩(wěn)，主要是由于酒曲中的多種霉菌在大量繁殖生長，產(chǎn)生的多種酶將原料淀粉中的糖苷鍵快速的水解，轉(zhuǎn)化為葡萄糖等多種單糖、低聚糖，使得總糖含量降低[16]。

圖6 不同酒曲對發(fā)酵米酒的總糖含量影響Fig.6 Effect of differentJiuquon the total sugar contents in fermented rice wine

2.8 不同酒曲發(fā)酵米酒的風(fēng)味物質(zhì)比較分析

發(fā)酵酒中風(fēng)味成分非常豐富復(fù)雜，主要的成分有酸、酯、醇、氨基酸、揮發(fā)性酚、烯、脂肪酸、醛和酮等，其化學(xué)特性有一定的差異，在米酒中的含量也不盡相同。這些物質(zhì)有著自身獨特的氣味，在經(jīng)過互相協(xié)同累加、抑制分離等作用，使米酒擁有自成一格的風(fēng)味，呈現(xiàn)出與眾不同的酒香[17-18]。使用GC-MS技術(shù)對兩種酒曲發(fā)酵30d的米酒進行主要風(fēng)味成分的檢測，兩種酒曲主要風(fēng)味成分的GC-MS色譜圖見圖7，其種類及相對含量分別見表2和表3。

圖7 酒曲1（A）和酒曲2（B）發(fā)酵米酒主要風(fēng)味成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.7 Total ion chromatogram of the main flavor components in rice wine fermented byJiuqu1(A)andJiuqu2(B)analysis by GC-MS

表2 酒曲1發(fā)酵米酒主要風(fēng)味成分種類及相對含量Table2 Types and relative contents of main flavor components in rice wine fermented byJiuqu1

表3 酒曲2發(fā)酵米酒主要風(fēng)味成分種類及相對含量Table3 Types and relative contents of main flavor components in rice wine fermented byJiuqu2

由表2可知，使用GC-MS技術(shù)檢測到酒曲1發(fā)酵米酒中共有24種物質(zhì)，主要為醇類、酯類、酸類和醛類物質(zhì)。其中醇類5種；酯類6種；酸類10種；醛類3種。由表3可知，酒曲2發(fā)酵酒中共檢測出23種成分。其中醇類5種、酯類5種、酸類10種、醛類3種。兩種酒曲發(fā)酵米酒中主要風(fēng)味成分組成種類上基本相同，檢測出的揮發(fā)性化合物質(zhì)都是酸類物質(zhì)的種類及含量最多。

兩種發(fā)酵米酒中含量最高的醇類物質(zhì)都是甲醇，正乙醇和β-苯乙醇，其中酒曲1發(fā)酵米酒中甲醇、正乙醇、β-苯乙醇含量分別為1.32%，1.51%，0.54%；酒曲2發(fā)酵米酒中含量為1.73%，1.65%，0.86%?？芍褂镁魄?發(fā)酵米酒中的甲醇，正乙醇和β-苯乙醇含量都大于酒曲1發(fā)酵米酒。β-苯乙醇具有蜜香玫瑰味的清雅香氣，落口有綿甜清爽之感[19]，是米酒標(biāo)準(zhǔn)中質(zhì)量指標(biāo)之一，其在酒中的含量直接影響酒的品質(zhì)。由此可知酒曲2發(fā)酵米酒的品質(zhì)要高于酒曲1發(fā)酵米酒。

酯類是具有芳香的化合物，是形成酒體香氣濃郁的主要因素，其中乳酸乙酯和乙酸乙酯以及己酸乙酯是酒的重要香味成分，能夠產(chǎn)生果香，花香，脂肪香和奶油香[20-22]，如乙酸乙酯有果味和甜味[23]。兩種酒中酯類物質(zhì)含量最高的是戊酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯。其中酒曲1發(fā)酵米酒中戊酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯含量分別為1.14%，0.95%，1.01%；酒曲2發(fā)酵米酒中含量為4.06%，0.78%，0.76%。酒曲2發(fā)酵米酒中戊酸乙酯的含量明顯大于酒曲1發(fā)酵米酒中戊酸乙酯的含量。酒曲1中乳酸乙酯的含量高于酒曲2，有研究報道，乳酸乙酯香弱味甜，適量使酒體有濃厚感，多則帶苦味[23]。其中酒曲1中比酒曲2發(fā)酵米酒多一種辛酸乙酯化合物，微量的辛酸乙酯在濃香型白酒中具有比較明顯的水果香；適量的辛酸乙酯含量對酒體復(fù)合香有較好的促進作用，但過多的含量會對酒體中其他香味成分表現(xiàn)出抑制作用[24]。

兩種酒中含量最高的酸類物質(zhì)都是丙酸和乙酸，其中酒曲1發(fā)酵米酒中丙酸和乙酸含量分別為41.85%，31.49%；酒曲2發(fā)酵米酒中含量為65.86%，酒曲1中為17.68%。酒曲2發(fā)酵米酒中丙酸含量為65.86%大于酒曲1，丙酸刺激性強，不易代謝；而酒曲1發(fā)酵米酒乙酸的含量為31.84%高于酒曲2，乙酸具有醋酸氣味，爽口帶甜，聞之有刺激性酸味，兩者都會對酒的感官品質(zhì)會造成負(fù)面影響[25]。

白酒中醛類物質(zhì)是構(gòu)成酒香不可缺少的重要成份之一。醛類的香味最為強烈，與醛相對應(yīng)的酸、醇和酯的香味僅有醛的數(shù)十分之一到數(shù)百分之一[26]。兩種酒中主要醛類物質(zhì)是糠醛和乙醛，酒曲1發(fā)酵米酒中糠醛和乙醛的含量分別為9.99%、6.90%，酒曲2含量分別為3.46%、0.66%。兩種酒曲發(fā)酵米酒中明顯酒曲1發(fā)酵米酒中的糠醛和乙醛含量高于酒曲2。乙醛和糠醛是醬香、濃香等白酒中香味成份的骨干，尤其在醬香型白酒的呋喃類組份中，糠醛的含量最高，并且遠遠高于其他香型白酒。因此，糠醛已成為醬香型白酒的一個標(biāo)志組份，是區(qū)別于其他香型白酒的主要特征[27]。乙醛是糖代謝的中間產(chǎn)物，有酸味，對米酒的風(fēng)味也有重要影響。

3 結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)酒曲2的糖化酶、液化酶能力均高于酒曲1；發(fā)酵過程中酒曲2發(fā)酵米酒的pH、可溶性固形物、酒精度以及總糖含量整體上都均高于酒曲1發(fā)酵米酒，但發(fā)酵過程中酒曲1發(fā)酵米酒的總酸和氨基酸態(tài)氮含量整體上要高于酒曲2發(fā)酵米酒。采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用分析方法對兩種不同酒曲發(fā)酵米酒中揮發(fā)性物質(zhì)進行檢測，鑒定出酒曲1發(fā)酵米酒中共有24種物質(zhì)；酒曲2發(fā)酵米酒中共檢測出23種成分，主要為醇類、酯類、酸類和醛類。兩種酒曲發(fā)酵酒主要風(fēng)味成分組成種類基本相同，差異主要表現(xiàn)在成分相對含量上。酒曲1發(fā)酵米酒主要揮發(fā)性物質(zhì)有丙酸（41.85%）、乙酸（31.48%）、糠醛（9.99%）、乙醛（6.90%），酒曲2發(fā)酵米酒主要揮發(fā)性物質(zhì)有丙酸（65.86%）、乙酸（17.68%）、戊酸乙酯（4.06%）、乙醛（3.46%）。