吳再節(jié)，方 焰，孫 偉，崔 磊，蔣 超，董思文，李劍峰，常 強

(安徽文王釀酒股份有限公司，安徽臨泉236400)

文王貢酒經過幾百年的歷史文化積淀，形成了獨特個性風格特點?！扒蔷浦恰钡莱隽司魄诰频闹匾?主要利用相關物料進行微生物生長繁殖、代謝而產生，酒曲質量越優(yōu)，白酒的質量越好。在酒曲中有豐富的物系、菌系與酶系等，酒曲培養(yǎng)過程是酒曲微生物菌群演變和物質間生化反應的生態(tài)變化過程。酒曲作為釀酒過程中的糖化、發(fā)酵、生酸、生香劑，從而直接或間接影響文王貢酒的產量、質量及特色。本研究從文王貢酒的酒曲培養(yǎng)入手，采集不同培養(yǎng)時期酒曲，進行相關跟蹤調查、檢測分析等，考察不同培養(yǎng)時期酒曲有關規(guī)律，旨在為文王貢酒更加高效合理地推動酒曲培養(yǎng)達到優(yōu)化可控等。

1 材料與方法

1.1 材料

選用不同培養(yǎng)時期（料醅、揭房、中火、頂火、后火、退火和出房）酒曲開展分析。分析的酒曲均由文王酒業(yè)制曲車間提供，工藝操作按文王酒業(yè)制曲標準工藝執(zhí)行。

1.2 方法

從培養(yǎng)時間0 d開始，每間隔5 d左右從不同培養(yǎng)時期酒曲的曲房中隨機選取酒曲7個樣品，樣品名分別為Wjq05-0、Wjq05-1、Wjq05-2、Wjq05-3、Wjq05-4、Wjq05-5、Wjq05-6。放于事先準備好已經做好標識的密封袋中，置于冰箱低溫保存待用。分別進行理化分析與生物分析等。相關理化、生物指標分別按1.3及1.4中的方法測定。

1.3 酒曲理化分析方法

1.3.1 水分測定

采用烘干恒重法測量酒曲水分含量。

1.3.2 酸度測定

根據(jù)酸堿中和反應，用中和法測定酸度，其反應式為：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O，以100 g酒曲消耗NaOH的毫摩爾數(shù)表示。即每100 g酒曲消耗1 mmol NaOH為1度酸度。

1.3.3 淀粉測定

準確稱取曲粉1.00 g，置于250 mL錐形瓶中，加1∶4 HCl液100 mL，安裝好冷凝器，沸水浴中轉化30 min，用NaOH溶液中和、過濾，加水定容至250 mL，采用斐林試劑法進行測定。

1.3.4 糖化力測定

采用斐林溶液滴定快速法測定。按照QB/T 4257—2011標準中糖化力的測定方法進行。

1.3.5 發(fā)酵力測定

酒曲是糖化發(fā)酵劑,其中的酵母能使酒醅中還原糖發(fā)酵，生成CH3CH2OH和CO2。測定發(fā)酵過程中生成的CO2量，以衡量酒曲的發(fā)酵力。當滅菌冷卻后的糖化液在無菌條件下，加入酒曲樣品1.00 g，發(fā)酵栓中加入2.5 mol/L的H2SO4。然后放入25℃保溫箱中發(fā)酵72 h，取出發(fā)酵瓶，輕輕搖動，使CO2全部逸出，稱量CO2生成量。

1.4 酒曲生物分析方法

高通量測序實驗流程：微生物組總DNA提取→目標片段PCR擴增→擴增產物回收純化→擴增產物熒光定量→測序文庫制備→上機進行高通量測序。

2 結果與分析

2.1 酒曲理化指標分析

選取不同培養(yǎng)時期的酒曲，通過理化指標分析，結果見表1。

表1 各時期酒曲理化指標

從表1可知，不同培養(yǎng)時期酒曲的水分含量在12.1%～34.6%之間、酸度介于0.4～1.4 mL/g之間、淀粉則在52.09%～67.10%之間、糖化力則分布在972～1074 mg/g·h之間、發(fā)酵力則分布在29～241 g[CO2]/100 g·72 h之間?？梢钥闯觯煌囵B(yǎng)時期酒曲的水分含量與淀粉含量有逐漸降低趨勢，同邢鋼等[1]的研究中水分和淀粉含量一直在下降較為一致，酒曲酸度為逐漸增加趨勢，說明了培養(yǎng)微生物需要消耗淀粉等，酒曲糖化力與發(fā)酵力高低起伏，說明穩(wěn)定性不佳等,酒曲剛入房時，糖化力就很高,因小麥等原料本身帶有糖化酶等，結果與楊代永等人的研究相一致[2]。

2.2 酒曲高通量測序生物分析

選取不同培養(yǎng)時期酒曲，通過高通量測序分析，結果如下。

2.2.1 細菌菌群結構分析

對253043條片段的分析結果見圖1，圖1表明，絕大部分的樣品長度在385～398之間，77.5%的片段長度為393或394。

7個樣品中，用于測序結果分析的片段數(shù)量分別為：Wjq05-0樣品（35734），Wjq05-1樣品（33456），Wjq05-2樣品（31051），Wjq05-3樣品（30955），Wjq05-4樣品（45291），Wjq05-5樣品（32645），Wjq05-6樣品（43911）。其中Wjq05-6與Wjq05-4樣用來測序的片段數(shù)量相對較多，但總的說來片段數(shù)量大致相同，分析均一性較好。

圖1 細菌菌群結構分析圖

表2及圖2為各個樣品中所檢測到的微生物種類的數(shù)量。由表2和圖2可知，在酒曲的制作過程中，細菌結構經歷了從相對簡單的菌群變?yōu)閺碗s菌群，最后回到相對簡單菌群的過程（制作酒曲的原料中細菌種類很豐富，但很多微生物由于相對數(shù)量較小，在菌群中的比例較低而無法被檢測到）。

表2 各分類水平的細菌類群數(shù)統(tǒng)計表

圖2 各個樣品中所檢測到的細菌種類的數(shù)量

在不同的分類等級下，酒曲中細菌菌群的結構及主要微生物分別如圖3所示，圖3中最底部的黑色部分為目前無法被鑒定的微生物。在門水平上未鑒定的微生物較少，而從目等級開始未鑒定的微生物比較明顯，說明部分微生物可以確定屬于哪個門，但無法確定屬于哪個目。

圖3 酒曲中細菌菌群的結構及主要微生物門類

2.2.2 真菌菌群結構分析

對344253條片段的分析結果見圖4，圖4表明絕大部分的樣品長度在370～405之間，71.5%的片段長度為398。

7個樣品中，用于測序結果分析的片段數(shù)量分別為：Wjq05-0樣品（39435），Wjq05-1樣品（39431），Wjq05-2樣品（39442），Wjq05-3樣品（39431），Wjq05-4樣品（39426），Wjq05-5樣品（39421），Wjq05-6樣品（39438）。片段數(shù)量基本相同，分析均一性很好。

表3和圖5為各個樣品中所檢測到的真菌微生物種類的數(shù)量。由表3和圖5可知，在酒曲的制作過程中，真菌結構同樣經歷了從相對簡單菌群變?yōu)閺碗s菌群，最后回到相對簡單菌群的過程（制作酒曲的原料中真菌種類很豐富，但很多微生物由于相對數(shù)量較小，在菌群中的比例較低而無法被檢測到）。

圖4 真菌菌群結構分析圖

表3 各分類水平的真菌類群數(shù)統(tǒng)計表

圖5 各個樣品中所檢測到的真菌種類的數(shù)量

在不同的分類等級下，酒曲中真菌菌群的結構及主要微生物見圖6。

圖6 酒曲中真菌菌群的結構及主要微生物

3 結論

(1)通過不同培養(yǎng)時期酒曲樣品分析對比發(fā)現(xiàn)，隨培養(yǎng)時間的延長，酒曲培養(yǎng)過程中水分含量變化為遞減趨勢，前期減少速度較快，后期減少速度放緩，且微生物前期生長旺盛，后期生長減緩。說明微生物的生長需要適宜水分，水分是培養(yǎng)酒曲的重要影響因素之一。

(2)酒曲培養(yǎng)過程中酒曲酸度變化為遞增趨勢，可能是因為培養(yǎng)前期因微生物代謝旺盛，產酸速度較快。通過分析對比，培養(yǎng)后期由于酒曲溫度的升高,水分的減少，細菌數(shù)量減少，酸度升幅也隨之降低。酸度的大小和細菌數(shù)量變化密切相關。

(3)酒曲培養(yǎng)過程中酒曲淀粉變化有降低趨勢，淀粉含量由最高67.10%到最低52.09%，相差約15%，這些淀粉應該被微生物所分解利用等。酒曲中淀粉含量與其液化酶和糖化酶活性關系密切，一般優(yōu)級曲淀粉含量相對較低，液化酶和糖化酶活性相對要高些。

(4)通過不同培養(yǎng)時期酒曲樣品分析對比，隨培養(yǎng)時間的延長,酒曲糖化力不穩(wěn)定偏向遞減趨勢，因小麥等原料本身帶有糖化酶等，曲醅剛入房時糖化力就很高，隨著微生物大量繁殖代謝，酒曲醅溫度的升高，霉菌的代謝受到抑制，糖化力下降；進入后火排潮期后，隨著酒曲溫度逐漸降到室溫，糖化酶發(fā)生變化，酒曲培養(yǎng)過程中糖化力變化與溫度變化較大。糖化力是糖化型淀粉酶將淀粉糖化生成葡萄糖的能力。糖化力的變化趨勢與酒曲霉菌變化的趨勢不一致，且前期壓料成型后,用QB/T 4257—2011標準中糖化力的測定方法檢測的料醅曲樣品糖化力很高,加酵母糖化發(fā)酵后也基本不產酒,此糖化力測定方法不能有效反映出霉菌等生長狀況及其糖化酶糖化能力等,應改進檢測方法為妥。

(5)發(fā)酵力是酒曲發(fā)酵糖生成酒精和產生二氧化碳的能力強弱的評價。酒曲發(fā)酵力變化趨勢與酒曲中的酵母數(shù)量變化趨勢較為一致，呈現(xiàn)出先增后減，再增加，然后維持在一個相對穩(wěn)定的水平的趨勢。由于原料中酵母很少，料醅發(fā)酵力測定結果最小，隨著酒曲培養(yǎng),曲溫的升高，酵母數(shù)量迅速增多，發(fā)酵力隨之迅速增大；之后隨著品溫的繼續(xù)升高和酒曲水分的不斷降低，環(huán)境條件不再有利于酵母在酒曲上生長繁殖，發(fā)酵力隨之降低；經過高溫后，隨著品溫的逐漸降低，酒曲發(fā)酵力又稍有回升等。通過分析對比，酒曲培養(yǎng)過程中發(fā)酵力變化與酵母量變化關系較為密切。

通過對不同培養(yǎng)時期酒曲理化指標與微生物菌群變化規(guī)律研究認為：水、酸度、淀粉、發(fā)酵力等理化指標變化規(guī)律與酒曲中的微生物菌群變化相關，可得到不同培養(yǎng)時期酒曲的群落變化規(guī)律，為制曲標準化與專業(yè)化提供了理論依據(jù)。

[1]邢鋼,敖宗華,王松濤,等.不同溫度大曲制曲過程理化指標變化分析研究[J].釀酒科技,2014(6)：20-23.

[2]楊代永,范光先,汪地強,等.高溫大曲中的微生物研究[J].釀酒科技,2007(5)：37-41.