曹國磊， 何麗麗， 馬榮輝， 唐 樂， 曹嘉瑞， 牛海文， 羅 琴

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸與神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊 830011

肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism，PTE)是呼吸系統(tǒng)疾病中比較常見的一種血管疾病，是由于各種原因?qū)е碌难ㄋㄗ佣氯蝿用}干或其分支，引起肺循環(huán)障礙的臨床、病理生理綜合征[1-2]。研究顯示，近年來國內(nèi)PTE的患病率、疾病構(gòu)成比均顯著增長[3]。高達15%的PTE患者在患病后1月內(nèi)死亡，30%的患者在未來10年內(nèi)復(fù)發(fā)[4]。

DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMT)的催化作用下，二核苷酸中C核苷酸上第5個碳原子發(fā)生甲基化轉(zhuǎn)變，成為甲基化的胞嘧啶[5]。研究證明，DNA的異常甲基化在惡性腫瘤、自身免疫性疾病及心血管疾病中發(fā)揮著重要作用[6]，但關(guān)于其與PTE關(guān)系的研究卻罕見報道。本研究擬通過Illumina Infinium Methylation EPIC Bead Chip芯片(850K芯片)甲基化檢測平臺在全基因組水平檢測PTE患者與正常對照者每個CpG位點的甲基化水平，并對比分析PTE患者與正常對照組之間差異甲基化位點、區(qū)域及其目的基因，進一步揭示PTE的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

納入標準：經(jīng)肺動脈CT血管造影確診肺動脈存在血栓，無心腦血管疾病史，無內(nèi)分泌疾病史。對照組選取標準：選取與PTE組性別比例、年齡相當(dāng)，既往無心腦血管、血液、內(nèi)分泌、肝腎疾病，且無慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘等病史的相同地區(qū)人群作為正常對照組。所有入組人員均簽署相關(guān)知情同意書，并經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(倫理審批號為：2019BC007)。收取2019年1月至2019年12月就診的肺栓塞患者和正常對照人群外周血標本各10例，進行DNA提取。

1.2 甲基化檢測

采用Illumina Infinium Methylation EPIC Bead Chip芯片(850K芯片)甲基化檢測平臺檢測分析各樣本中每個CpG位點的甲基化水平并行差異位點、區(qū)域分析。

1.2.1 DNA的提取及樣品質(zhì)檢 使用試劑盒(北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品)提取外周血中的基因組DNA，用分光光度計定量，并將樣品調(diào)到標準濃度50 ng/μL，共計20 μL，然后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳。樣品電泳主帶清晰，通常不小于10 kb，沒有明顯降解，總量5 μg以上，可進行下游的甲基化芯片實驗。

1.2.2 亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及DNA擴增 根據(jù)Illumina官方推薦的Zymo EZ DNA Methylation Kit優(yōu)化方法進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。

1.2.3 制備MSA3板 在樣本中加入0.1 mol/L NaOH使DNA變性為單鏈，經(jīng)中和后加入全基因組擴增試劑，在37℃恒溫條件下過夜孵育。

1.2.4 DNA的片段化、沉淀、重懸 擴增后產(chǎn)物經(jīng)過酶解處理，得到片段化DNA。DNA片段加入異丙醇在4℃下離心沉淀。沉淀后的DNA在空氣中干燥后，加入雜交緩沖試劑使DNA沉淀重新溶解。

1.2.5 DNA芯片制備 將重懸后的DNA樣本與準備好的芯片雜交，置于雜交爐內(nèi)過夜。在雜交過程中，片段化后的DNA經(jīng)過變性，與特異位點的50個堿基(連接在芯片的微珠上)退火。洗去未雜交和非特異雜交的DNA，以捕獲到的DNA為模板，在芯片上進行單堿基的延伸反應(yīng)，在芯片上加上可檢測的熒光基團，從而區(qū)分樣本的甲基化狀況。將反應(yīng)完成的芯片放入XC4試劑中，使其表面包裹上一層粘性透明液體，再將其放入真空環(huán)境下干燥1 h，從而將芯片包被，以使其信號穩(wěn)定較長的時間。

1.2.6 芯片掃描和數(shù)據(jù)提取 提前下載相應(yīng)的manifest文件，將處理好的芯片放入掃描儀，利用激光激發(fā)芯片上單堿基延伸產(chǎn)物的熒光基團，掃描儀獲取由熒光基團發(fā)出的熒光，并生成原始數(shù)據(jù)，記錄掃描結(jié)果存放的位置。由此所得的數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入R包Champ軟件進行分析，從而得到每個樣本每個位點的甲基化水平數(shù)據(jù)。

1.2.7 差異甲基化位點分析 將芯片原始掃描數(shù)據(jù)idat文件直接導(dǎo)入R包Champ進行分析，得到每個樣品每個CpG位點的原始信號值、樣品分組等信息。然后使用一系列R軟件包計算出每個樣品每個CpG位點的甲基化水平，進行甲基化差異分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.8 差異甲基化區(qū)域分析 采用Bumphunter的方法尋找差異甲基化區(qū)域(differentially methylated regions，DMR)，該方法首先根據(jù)位點距離信息來聚簇(cluster)，然后再在每個cluster中篩選出甲基化水平一致的連續(xù)候選區(qū)段，并根據(jù)候選區(qū)段構(gòu)建線性統(tǒng)計模型，篩選出明顯差異的區(qū)段(P<0.05)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用R包Limma 3.32.10進行差異甲基化分析，然后根據(jù)P值篩選差異位點(P<0.05)。采用Limma moderatedt-statistics和empirical Bayes方法檢驗差異位點的顯著性。采用Bumphunter的方法根據(jù)候選區(qū)段構(gòu)建線性統(tǒng)計模型，篩選出明顯差異的區(qū)段(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 差異甲基化位點分析

將PTE與正常對照組所有甲基化位點進行對比分析，在全基因組水平共篩選到95286個有意義的差異CpG位點(P<0.05)，其中37983個為高甲基化，57303個為低甲基化(圖1)。對應(yīng)28273個目的基因，其中13785個為高甲基化，14488個為低甲基化。我們分別列出兩組差異最大的高甲基化與低甲基化CpG位點各10個(表1)，顯著差異CpG位點在CpG島的分布情況為：CpG島29%(27483)、Shore 18%(16700)、Shelf 6%(6011)、Open sea 47%(45092)。

圖中標注為紅色的是高甲基化位點，標注為藍色的是低甲基化位點，標注為灰色的是無顯著差異位點。圖1 差異CpG位點分布火山圖Fig.1 Volcano map of the distribution of differential CpG sites

表1 PTE組與正常對照組差異甲基化位點對比Table 1 Comparison of differential methylation sites between the PTE group and the normal control group

2.2 差異甲基化區(qū)域分析

采用Bumphunter的方法尋找PTE與正常對照組差異甲基化區(qū)域，結(jié)果篩選出兩組差異甲基化區(qū)域DMR-1、DMR-2，分別位于3號染色體(195489708-195490309)和6號染色體(49681178-49681774)上(均P<0.05)。DMR-1寬度601 bp，DMR-2寬度596 bp，DMR-1包含8個CpG位點，其所屬的簇包含8個CpG位點，DMR-2包含11個CpG位點，其所屬的簇包含11個CpG位點，且PTE組DMR-1與DMR-2所有CpG位點甲基化水平均較正常對照組高(表2)。DMR-1所含CpG位點為cg23170091、cg18918831、cg16034541等，目的基因為MUC4；DMR-2所含CpG位點為cg01706515、cg14997592、cg26715042等，目的基因為CRISP2(表3)。

表2 PTE組與正常對照組差異甲基化區(qū)域?qū)Ρ萒able 2 Comparison of differentially methylated areas between the PTE group and the normal control group

表3 PTE組與正常對照組差異甲基化區(qū)域所含甲基化位點及目的基因Table 3 Methylation sites and target genes contained in the differentially methylated regions of the PTE group and the normal control group

3 討論

已有許多研究證據(jù)表明DNA異常甲基化在慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、肺癌、特發(fā)性肺纖維化等肺部疾病中的重要作用。如Sundar等[7]研究發(fā)現(xiàn)，吸煙者和慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中BID和NOS1AP基因的表達與DNA甲基化狀態(tài)的改變關(guān)系顯著，繼而影響細胞的衰老、凋亡等。而Yokoyama等[8]研究證明，TET1所介導(dǎo)的DNA低甲基化可調(diào)控肺腺癌MUC4基因的表達，但關(guān)于PTE與DNA甲基化的關(guān)系目前尚未見報道。

本研究利用甲基化檢測平臺在全基因組水平檢測PTE組患者及正常對照組人群CpG位點甲基化水平，對比分析PTE組與正常對照組差異甲基化位點及區(qū)域。結(jié)果在全基因組水平共篩選到95286個有意義的差異CpG位點(P<0.05)，其中高甲基化的位點cg11738485，cg06417478，cg04657146等差異較大，低甲基化的位點cg06758191、cg18105134、cg21790413等差異較大，對應(yīng)目的基因分別為HOOK2(cg06417478)、PROZ(cg18105134)。HOOK2(微管系連蛋白2)是一種蛋白質(zhì)編碼基因，有研究表明2型糖尿病和肥胖患者HOOK2基因的甲基化與2型糖尿病的發(fā)生相關(guān)[9]，其在血栓性疾病中的作用目前未見報道。而PROZ(蛋白質(zhì)Z)是一種維生素K依賴的蛋白質(zhì)，具有促凝與抗凝雙向調(diào)節(jié)作用，Santacroce等[10]對197例深部靜脈血栓(DVT)和197例健康人群的研究表明低PROZ血漿水平與DVT相關(guān)。這種關(guān)系是否建立在PROZ基因甲基化的基礎(chǔ)之上有待我們進一步研究證實。

眾所周知，基因的轉(zhuǎn)錄過程有賴于CpG島的甲基化狀態(tài)，若是甲基化狀態(tài)出現(xiàn)了異常，便會影響到基因的轉(zhuǎn)錄過程。然而，DNA異常甲基化不僅發(fā)生在CpG島，也可能發(fā)生在CpG Shore、CpG Shelf等區(qū)域。本研究發(fā)現(xiàn)，顯著差異的CpG位點在CpG島的分布情況為：CpG島29%(27483)、CpG Shore18%(16700)、CpG Shelf 6%(6011)、Open sea 47%(45092)。除廣闊的Open sea區(qū)域之外，發(fā)生在CpG島的差異CpG位點依然是最多的，達到了29%，遠高于CpG Shore和CpG Shelf。這與Dudziec等[11]有關(guān)CpG島和CpG shores的研究結(jié)果相一致。

差異甲基化區(qū)域(DMR)指基因組上不同組間甲基化值有明顯差異的一個片段。本研究篩選出2組差異甲基化區(qū)域DMR-1，DMR-2，發(fā)現(xiàn)PTE組DMR-1與DMR-2所有CpG位點甲基化水平均較正常對照組高。DMR-1所對應(yīng)目的基因為MUC4，DMR-2所對應(yīng)目的基因為CRISP2。關(guān)于MUC4基因，研究主要集中在與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，并可作為腫瘤發(fā)展過程的標記物。在表觀遺傳學(xué)方面，曾有學(xué)者報道MUC4的表觀遺傳學(xué)有賴于5′-末端的2個CpG島，在某些腫瘤中這種調(diào)節(jié)顯得尤為重要[12]。而腫瘤患者因其體內(nèi)血液高凝狀態(tài)等本身便是血栓高危因素，有研究顯示，肺癌患者發(fā)生靜脈血栓的風(fēng)險是普通人群的22倍，并使患者病死率增加2～8倍[13]。據(jù)此，我們推測，或許是由于MUC4基因的異常甲基化導(dǎo)致了惡性腫瘤的發(fā)生，繼而引起了血栓的形成；抑或是MUC4基因的異常甲基化本身便與肺栓塞有著直接的關(guān)系。無論是哪種可能，DMR-1中的這些差異CpG位點都值得我們?nèi)リP(guān)注并繼續(xù)研究。關(guān)于CRISP2基因，目前研究主要集中在其與弱精癥之間的關(guān)系，但本研究卻發(fā)現(xiàn)了CRISP2基因的高甲基化與肺栓塞的關(guān)系，為廣大學(xué)者提供了新的思路。

綜上所述，肺栓塞患者CpG位點的高甲基化可能參與了肺栓塞的發(fā)生，差異較大的CpG位點cg06417478、cg18105134及其目的基因HOOK2、PROZ和DMR-1、DMR-2中包含的差異CpG位點及其目的基因MUC4、CRISP2的異常甲基化或許在肺栓塞的發(fā)生中起到重要的作用。課題組擬進一步擴大樣本量，同時對以上基因相關(guān)mRNA、蛋白等進行驗證，以期深入揭示表觀遺傳學(xué)機制在肺栓塞發(fā)生、發(fā)展中的作用，為肺栓塞的研究提供新的思路。