孔岳鋒， 喻漢華， 劉沛武

1長(zhǎng)江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院放射科，荊州 434020 2武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院放射科，武漢 430032

微小RNAs(miRNAs)是一類被證實(shí)與包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，與靶基因3′UTR區(qū)特異性結(jié)合從而調(diào)控mRNA的表達(dá)是其主要作用機(jī)制[1-2]。研究表明，miR-98-3p在肺癌、肝癌等多種腫瘤組織或細(xì)胞中低表達(dá)，并在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，但其在食管癌細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不明確[3-4]。本研究首先檢測(cè)了食管癌組織及細(xì)胞系中miR-98-3p的表達(dá)水平，其次以KYSE-30為細(xì)胞模型研究miR-98-3p對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響，最后進(jìn)行靶基因驗(yàn)證并探討其作用機(jī)制，以期為食管癌的治療提供一個(gè)新的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 食管癌標(biāo)本

收集2016年1月～2017年12月在武漢市第四醫(yī)院暨華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院經(jīng)病理確診的35例食管鱗狀細(xì)胞癌患者的組織標(biāo)本，其中男性21例、女性14例，平均年齡(56.34±9.42)歲，所有患者均由病理確診，術(shù)前未進(jìn)行放化療。手術(shù)切取瘤體區(qū)域及癌旁組織，并迅速置于液氮罐中臨時(shí)存儲(chǔ)，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。本研究符合作者所在單位人體試驗(yàn)倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：PH20150903)，且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

人食管癌細(xì)胞系(TE-1、Eca-109、KYSE-30)、人食管上皮細(xì)胞系HEEC均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；miR-98-3p模擬物(miR-98-3p mimics)、miR-98-3p抑制物(miR-98-3p inhibitors)及陰性對(duì)照物miR-NC均由上海吉瑪生物科技公司設(shè)計(jì)及合成；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；miRNA反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染凋亡試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；兔抗人β-catenin、兔抗人Cyclin D1、兔抗人Bax、兔抗人β-actin多克隆抗體以及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)GE公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

所有細(xì)胞均使用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE-30細(xì)胞，按照1×106/孔的數(shù)量接種至6孔板，待細(xì)胞融合度為60%左右時(shí)采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-98-3p mimics、miR-98-3p inhibitors及miR-NC轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，8 h后更換新鮮培養(yǎng)液，48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)

TRIzol法提取食管癌組織或細(xì)胞總RNA。miR-98-3p特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)cDNA，隨后進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；95℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。以U6基因?yàn)閮?nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

利用CCK-8比色法測(cè)定細(xì)胞的增殖能力。將轉(zhuǎn)染miR-98-3p mimics、miR-98-3p inhibitors和miR-NC的KYSE-30細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板上，分別在0、24、48、72 h加入10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組樣品在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖倍數(shù)=各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞A值/0 h細(xì)胞A值。

1.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡率。收集轉(zhuǎn)染miR-98-3p mimics、miR-98-3p inhibitors和miR-NC的KYSE-30細(xì)胞，預(yù)冷PBS清洗2次后離心去上清。按照說(shuō)明書首先加入100 μL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨后加入5 μL的Annexin-FITC和10 μL的PI輕搖混勻，避光孵育10 min，加入400 μL的結(jié)合緩沖液混勻后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

采用miRDB軟件預(yù)測(cè)miR-98-3p與β-catenin 3′UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)序列，并分別構(gòu)建β-catenin 3′UTR野生型(WT)和突變型(MUT)的雙熒光素酶報(bào)告載體質(zhì)粒。用LipofectamineTM2000試劑將miR-98-3p mimic和β-catenin野生質(zhì)?；蛲蛔冑|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染KYSE-30細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染海腎質(zhì)粒作為內(nèi)參對(duì)照。利用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)各組的熒光素酶的相對(duì)活性(相對(duì)活性=每組螢火蟲熒光素酶檢測(cè)值/海腎熒光素酶檢測(cè)值)。

1.8 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)PVDF膜，經(jīng)洗滌封閉后加入1∶1000稀釋的β-catenin、Bcl-2、Bax及β-actin一抗孵育過(guò)夜，隨后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌后ECL進(jìn)行顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光并對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-98-3p在食管癌組織及細(xì)胞中表達(dá)降低

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與癌旁組織相比，miR-98-3p在食管癌組織中的表達(dá)明顯降低(P<0.05)(圖1A)；與HEEC細(xì)胞相比，食管癌細(xì)胞TE-1、Eca-109和KYSE-30中miR-98-3p的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖1B)。

A：食管癌組織及相應(yīng)癌旁組織中miR-98-3p的表達(dá)水平，與癌旁組織比較，**P<0.01；B：食管癌細(xì)胞中miR-98-3p的表達(dá)水平，與HEEC細(xì)胞比較，**P<0.01圖1 miR-98-3p在食管癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 The expression level of miR-98-3p in esophageal cancer tissues and cell lines

選取miR-98-3p表達(dá)量最低的KYSE-30細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.2 miR-98-3p對(duì)食管癌KYSE-30細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-98-3p mimics的KYSE-30細(xì)胞在培養(yǎng)48 h和72 h后細(xì)胞增殖能力顯著降低，而轉(zhuǎn)染miR-98-3p inhibitors的KYSE-30細(xì)胞在24、48和72 h細(xì)胞增殖能力顯著升高，見圖2。

與miR-NC組比較，*P<0.05 **P<0.01圖2 miR-98-3p對(duì)食管癌細(xì)胞KYSE-30增殖的影響Fig.2 Effect of miR-98-3p on the proliferation of KYSE-30 cells

2.3 miR-98-3p對(duì)食管癌KYSE-30細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明：與對(duì)照組miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-98-3p mimics的KYSE-30細(xì)胞凋亡率顯著升高，而轉(zhuǎn)染miR-98-3p inhibitors的KYSE-30細(xì)胞顯著降低(圖3)。

1：miR-NC；2：miR-98-3p mimics；3：miR-98-3p inhibitors；與miR-NC比較，*P<0.05 **P<0.01圖3 miR-98-3p對(duì)食管癌KYSE-30細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-98-3p on the apoptosis of KYSE-30 cells

2.4 miR-98-3p靶向調(diào)控β-catenin基因

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-98-3p可以靶向結(jié)合β-catenin的3′UTR區(qū)域(圖4A)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示：miR-98-3p mimics與β-catenin 3′UTR-WT(野生型)共轉(zhuǎn)染組的熒光強(qiáng)度顯著低于miR-NC與β-catenin 3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，而miR-98-3p mimics與β-catenin 3′UTR-MUT(突變型)共轉(zhuǎn)染組的熒光強(qiáng)度和miR-NC與β-catenin 3′UTR-MUT共轉(zhuǎn)染組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4B。

A：miR-98-3p與β-catenin 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)；B：雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果，與miR-NC比較，**P<0.01圖4 miR-98-3p靶基因驗(yàn)證Fig.4 Detection of target gene of miR-98-3p

2.5 miR-98-3p對(duì)β-catenin下游通路中蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-98-3p mimics后KYSE-30中β-catenin和Cyclin D1蛋白水平顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高，而轉(zhuǎn)染miR-98-3p inhibitors起到相反的作用(圖5)，推測(cè)miR-98-3p可能通過(guò)靶向抑制β-catenin從而調(diào)控下游Cyclin D1和Bax蛋白水平。

圖5 miR-98-3p對(duì)食管癌KYSE-30細(xì)胞中β-catenin、Cyclin D1和Bax表達(dá)的影響Fig.5 Effect of miR-98-3p on the expression of β-catenin，Cyclin D1 and Bax in KYSE-30 cells

3 討論

食管癌是第6大惡性腫瘤性疾病，每年全球食管癌新發(fā)病例約45.6萬(wàn)例，導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過(guò)40萬(wàn)人[5]。我國(guó)每年食管癌新發(fā)病例約占全球病例總數(shù)的50%，是繼肺癌、胃癌和肝癌之后的第4大惡性腫瘤疾病[6]。盡管診斷方法和治療策略的完善大大提高了食管癌患者的生存期，但5年生存率依舊不到10%，中位生存期僅為1.5年[7]。因此，加強(qiáng)食管癌發(fā)病機(jī)制的研究，有針對(duì)性進(jìn)行靶向預(yù)防和治療是目前食管癌研究的一個(gè)趨勢(shì)。

miRNA是一類由18～25堿基組成的非編碼RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)方式與靶基因3′UTR區(qū)結(jié)合，從而降解靶基因mRNA或抑制其蛋白翻譯[1]。研究表明，大約50%的miRNA位于與腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著癌基因或抑癌基因的作用[2]。目前，已經(jīng)確定多種miRNA分子不僅在食管癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、轉(zhuǎn)移及血管生成過(guò)程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，而且還可以作為食管癌進(jìn)展和預(yù)后的有效標(biāo)志物[8]。miR-98-3p屬于let-7/miR-98家族的重要成員，在多種腫瘤組織中低表達(dá)[9]。miR-98-3p通過(guò)調(diào)控LIN28A、p53、Ang-1、FGF-1等凋亡或遷移相關(guān)基因，參與了肺癌和肝癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程[3-4]。此外，miR-98-3p也和肝癌細(xì)胞的多重耐藥性密切相關(guān)[10]，并且可以作為肺癌診斷的重要標(biāo)志物[11]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-98-3p在食管癌組織及細(xì)胞中表達(dá)均降低，并且在食管癌KYSE-30細(xì)胞中主要發(fā)揮抑癌基因的作用，其作用機(jī)制可能和靶向調(diào)控β-catenin相關(guān)。

研究表明，β-catenin在細(xì)胞內(nèi)主要有兩方面的功能：一是通過(guò)與細(xì)胞膜上的鈣粘蛋白相互作用，參與細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)間的粘附[12]；另一作用是作為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，通過(guò)調(diào)控Cyclin D1、Bax、Survivin等基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡[13]。正常食管鱗狀上皮僅細(xì)胞膜有β-catenin表達(dá)，胞質(zhì)及胞核中很少表達(dá)或不表達(dá)，而癌變的食管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中β-catenin表達(dá)升高，同時(shí)伴有在胞膜部位的表達(dá)減少或缺失[14]。研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin不僅參與食管癌細(xì)胞的增殖及凋亡，并且β-catenin的表達(dá)程度與腫瘤惡性程度及患者預(yù)后生存期密切相關(guān)[15]。在本研究中，通過(guò)生物信息學(xué)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)miR-98-3p在KYSE-30細(xì)胞內(nèi)可以靶向調(diào)控β-catenin，因此我們猜測(cè)miR-98-3p對(duì)食管癌細(xì)胞的抑制作用可能是通過(guò)調(diào)控β-catenin來(lái)實(shí)現(xiàn)的，隨后通過(guò)檢測(cè)Wnt通路中和增殖、凋亡相關(guān)的靶蛋白水平進(jìn)行了驗(yàn)證。

綜上所述，miR-98-3p可能通過(guò)靶向調(diào)控β-catenin的表達(dá)，從而影響下游效應(yīng)分子Cyclin D1和Bax表達(dá)水平，進(jìn)而抑制食管癌KYSE-30細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究的不足之處是缺少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也缺少對(duì)臨床病例的隨訪調(diào)查，這需要在后續(xù)的研究中繼續(xù)完善。