綦 艷，李錦清，陳滿英，伍尚森，唐楚林，劉德群

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東 順德 528300）

生活用紙及紙制品在生產(chǎn)加工和貯藏過程中常會使用有機抗菌劑，以抑制和殺滅細菌、霉菌、藻類等，達到防腐、抑菌效果，增加紙制品的貯藏和使用壽命［1］。常用的有機抗菌劑有對羥基苯甲酸酯類、季銨鹽類（如苯扎氯銨等）、異噻唑啉酮類等，由于缺乏完善的檢測標準，某些有機抗菌劑并未列入監(jiān)管項目，可能會導致生活用紙質(zhì)量存在安全隱患。有機抗菌劑在短期內(nèi)對環(huán)境和人體的危害不明顯，但長期積蓄達到一定含量后，對人體和環(huán)境產(chǎn)生的危害不能忽視。氯苯酚類物質(zhì)常用作木材防腐劑，起到抗菌防腐作用，也是制漿造紙行業(yè)中氯化消毒和漂白過程中的主要副產(chǎn)物之一。這些物質(zhì)若殘留于紙中或作為廢液排放至環(huán)境中，被人體吸收后對肝、腎、肺會有損傷，特別是經(jīng)生物和環(huán)境的富集和累積效應，毒性大大增強，被列為疑似致癌物質(zhì)［2］，許多國家對氯苯酚類物質(zhì)的使用有嚴格限制。因此，建立生活用紙及紙制品中對羥基苯甲酸酯類、季銨鹽類、氯苯酚類等有機抗菌劑的檢測方法具有十分重要的意義。

目前有機抗菌劑的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［3－5］、氣相色譜法（GC）［6］、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC－MS/MS）［7－11］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GC－MS）［12－14］以及超高效液相色譜－靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法［15］。其中HPLC－MS/MS法和GC－MS法靈敏度高，適用于低含量有機抗菌劑檢測，但儀器昂貴，維護成本高，在生產(chǎn)企業(yè)中難推廣；GC法測定氯苯酚類抗菌劑通常需要繁瑣的衍生步驟。HPLC法無需衍生即可同時檢測多種有機抗菌劑，普適性強，維護成本低，具有在企業(yè)中推廣應用的潛力，可為企業(yè)的紙制品質(zhì)量控制提供可靠的技術支撐。

關于紙制品中有機抗菌劑檢測的文獻報道主要集中在食品接觸類紙制品方面［16－18］，而生活用紙及紙制品的報道較少。生活用紙及紙制品中可能添加的有機抗菌劑種類較多，若對每一類抗菌劑進行檢測，則存在效率低、成本高等不足。針對氯苯酚類、季銨鹽類、對羥基苯甲酸酯類等多種有機抗菌劑同時檢測的方法尚未見文獻報道。本文采用高效液相色譜建立了生活用紙及紙制品中19種有機抗菌劑（包括7種氯苯酚類、6種季銨鹽類和6種對羥基苯甲酸酯類化合物）的分析方法，并將其用于實際樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀，配Waters 2998光電二極管陣列（PDAD）檢測器（美國Waters公司）；SIGMA 3-18K高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；IKA渦旋混合器（德國IKA公司）；EYELA旋轉蒸發(fā)儀（日本東京理化公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）；DT-502A電子天平（常熟市金羊砝碼儀器有限公司）；JP-C300超聲波清洗機（廣州吉普超聲波電子設備有限公司）。

乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；磷酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；四丁基硫酸氫銨（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

7種氯苯酚類化合物標準品：對氯間二甲苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4，6-三氯苯酚、2，3，4，5-四氯苯酚、2，3，4，6-四氯苯酚、2，3，5，6-四氯苯酚、五氯苯酚（純度均不低于97%，Dr．Ehrenstorfer公司）。6種季銨鹽類化合物標準品：苯扎氯銨、西吡氯銨、勞拉氯銨、芐索氯銨、地喹氯銨、西他氯銨（純度均不低于97%，北京曼哈格生物科技有限公司）。6種對羥基苯甲酸酯類化合物標準品：對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸異丁酯（純度均不低于99%，Dr．Ehrenstorfer公司）。

1.2 標準溶液的制備

準確稱取上述標準品10 mg（精確至0．01 mg）分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻后配得質(zhì)量濃度為1 000μg/mL的標準品儲備液，于－20℃保存。分別精密移取適量上述標準品儲備液，用甲醇－水溶液（1∶1，體積比）稀釋成系列混合標準工作溶液，使氯苯酚類、季銨鹽類和對羥基苯甲酸酯類化合物的質(zhì)量濃度分別在0．05～20 mg/L、0．1～20 mg/L、0．02～50 mg/L之間。

1.3 樣品前處理

取代表性樣品，剪碎至5 mm×5 mm以下，混勻，稱取2．0 g（精確至0．01 g）試樣置于50 mL離心管中，加入20 mL 0．5%甲酸－甲醇溶液，室溫超聲提取20 min，9 000 r/min離心3 min，用布氏漏斗抽濾，濾液轉移至雞心瓶中。從布氏漏斗中取出殘渣，再用20 mL 0．5%甲酸－甲醇溶液超聲提取10 min，9 000 r/min離心3 min后，用布氏漏斗抽濾，濾液合并于同一雞心瓶中，45℃水浴條件下旋轉蒸發(fā)濃縮至約1 mL，氮氣吹干，用2．0 mL甲醇－水溶液（1∶1，體積比）溶解，過0．22μm有機系濾膜，待測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate AQ C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；柱溫：25℃；流動相：A為乙腈，B為甲醇，C為0．05%磷酸水溶液（含0．475 3 g四丁基硫酸氫銨），梯度洗脫程序見表1；進樣體積：50μL；檢測波長：PDAD檢測器，波長范圍為191～400 nm。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

將19種有機抗菌劑的標準品儲備液分別用甲醇－水溶液（1∶1）稀釋100倍后，在191～400 nm范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描。結果顯示，氯苯酚類化合物在210 nm和230 nm處均有較強吸收；季銨鹽類化合物僅在210 nm有較強吸收，其他波長的吸收很弱；對羥基苯甲酸酯類化合物在210 nm和256 nm處均有較強的特征吸收峰。由于210 nm波長易受雜質(zhì)干擾，通常應避免作為檢測波長，但本實驗中季銨鹽類化合物在C18色譜柱上的保留能力較強，出峰時間較遲，保留時間均在45 min后，與雜質(zhì)分離充分，不易受到雜質(zhì)峰干擾。因此，綜合考慮19種有機抗菌劑的響應值和干擾情況，氯苯酚類、季銨鹽類和對羥基苯甲酸酯類化合物分別以230、210、256 nm為檢測波長。采用PDAD檢測器在191～400 nm范圍進行監(jiān)測，提取特定波長進行定量，其他特征吸收光譜圖輔助定性。

2.2 流動相的選擇

氯苯酚類、季銨鹽類和對羥基苯甲酸酯類化合物的性質(zhì)差異較大，其中氯苯酚類化合物包含三氯苯酚同分異構體（2，4，5-三氯苯酚與2，4，6-三氯苯酚）和四氯苯酚同分異構體（2，3，4，5-四氯苯酚、2，3，4，6-四氯苯酚與2，3，5，6-四氯苯酚），這些同分異構體的物理化學性質(zhì)差別不大，色譜行為相似，因此建立一種完全分離19種有機抗菌劑的液相色譜法難度較大。本研究采用流動相中添加離子對試劑，磷酸調(diào)節(jié)pH值，再結合梯度改變流動相比例和流速的方式，使19種有機抗菌劑的色譜峰完全分離。

氯苯酚類和對羥基苯甲酸酯類化合物均為弱酸性化合物，較易電離，在流動相中添加少量酸可抑制電離，使其形成中性分子，改善其在C18色譜柱上的分離度和色譜峰形。季銨鹽類為弱堿性化合物，前期實驗發(fā)現(xiàn)酸性流動相條件下該類化合物在C18色譜柱上也具有較好的分離度和色譜峰形。考察了乙腈、甲醇分別與0．05%甲酸水溶液、0．05%乙酸水溶液和0．05%磷酸水溶液組合作為流動相體系對19種有機抗菌劑的分離效果。結果表明，上述流動相組合均不能使19種有機抗菌劑的色譜峰完全分離，部分季銨鹽類和氯苯酚類化合物的色譜峰重疊，但以乙腈－0．05%磷酸水溶液為流動相時，達到基線分離的色譜峰最多，峰形最好。在流動相中添加適量四丁基硫酸氫銨，可提高結構特殊、不易分離化合物的分離效果；由于甲醇的粘度比乙腈大，且兩者極性存在差異，適量加入甲醇可調(diào)整流動相的極性，提高分離度。因此，實驗以乙腈和0．05%磷酸水溶液流動相為基礎，在乙腈中加入甲醇，在0．05%磷酸水溶液中加入四丁基硫酸氫銨離子對試劑，以進一步提高色譜分離度。通過比較甲醇、四丁基硫酸氫銨、磷酸的加入量，并結合流速的變化，確定優(yōu)化的流動相及梯度洗脫程序如“1．4”所示。

2.3 色譜柱的選擇

分別考察了Phenomenex Luna C18（250 mm×4．6 mm，5μm）、Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4．6 mm，5μm）、Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4．6 mm，5μm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4．6 mm，5μm）和Welch Ultimate AQ C18（250 mm×4．6 mm，5μm）5種色譜柱對19種有機抗菌劑的分離效果。結果表明，耐100%水相的Welch Ultimate AQ C18色譜柱在優(yōu)化色譜條件下能使19種有機抗菌劑的色譜峰完全分離，其他4種C18色譜柱均存在部分色譜峰重疊，分離效果較差。因此，選擇Welch Ultimate AQ C18（250 mm×4．6 mm，5μm）作為分離色譜柱。優(yōu)化條件下，19種有機抗菌劑標準溶液（5 mg/L）在210 nm檢測波長下的色譜圖見圖1。

圖1 19種有機抗菌劑標準溶液的色譜圖（5 mg/L）Fig．1 Chromatogram of 19 organic antibacterial agents standard solution（5 mg/L）the peak numbers denoted were the same as those in Table 2

2.4 提取溶劑的選擇

根據(jù)待測化合物性質(zhì)，比較了甲醇作為提取溶劑時不加酸和加入少量甲酸的提取效果。結果顯示，加入少量甲酸的提取溶劑能使氯苯酚類化合物的回收率提高約10%，對其他物質(zhì)無影響，因此在提取溶劑中加入少量甲酸。氯苯酚類和對羥基苯甲酸酯類化合物的分子結構均含有羥基，具有一定極性，與季銨鹽類化合物均易溶于甲醇、乙腈、丙酮等有機溶劑。本研究分別以甲酸酸化的甲醇、乙腈、丙酮作為提取溶劑，在相同實驗條件下對自制的添加19種有機抗菌劑標準品的樣品進行檢測，比較提取效果。結果表明，甲酸酸化的丙酮作為提取試劑時，提取液雜質(zhì)最多，干擾目標物的測定；甲酸酸化的乙腈對氯苯酚類化合物的提取效果較差，回收率低；甲酸酸化的甲醇作為提取溶劑時，雜質(zhì)較少，因此選擇甲酸酸化的甲醇作為提取溶劑。進一步比較了甲酸添加量對提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)甲酸的最佳添加量為0．5%，此時19種有機抗菌劑的提取回收率均達到70%以上，繼續(xù)增加甲酸比例，回收率變化不明顯。因此，本研究以0．5%甲酸－甲醇溶液作為提取溶劑。

2.5 提取次數(shù)的優(yōu)化

采用0．5%甲酸－甲醇溶液作為提取溶劑，以濕紙巾、紙巾、紙杯作為基質(zhì)對提取次數(shù)進行了優(yōu)化。由于紙制品對提取溶劑的吸附作用很強，即使離心后也不能使樣品與提取溶劑完全分離，本研究采用布氏漏斗抽濾以充分回收被紙制品吸附的提取溶劑，提高目標物的回收率。實驗結果顯示，采用布氏漏斗抽濾，樣品提取2次即可達到充分提取，上述3種基質(zhì)中19種有機抗菌劑的回收率均大于70%，因此選擇提取2次。

2.6 線性關系與檢出限

在優(yōu)化的條件下，對19種有機抗菌劑的混合標準工作溶液進行測定，以目標化合物的峰面積為縱坐標（y），對應質(zhì)量濃度為橫坐標（x，mg/L）作線性回歸方程。結果顯示，氯苯酚類、季銨鹽類和對羥基苯甲酸酯類化合物分別在0．05～20 mg/L、0．1～20 mg/L、0．02～50 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關系，相關系數(shù)r≥0．996 0；按信噪比（S/N）不低于3時計算檢出限（LOD），五氯苯酚的檢出限為0．1 mg/kg，其他6種氯苯酚類化合物的檢出限均為0．2 mg/kg；季銨鹽類化合物的檢出限均為0．3 mg/kg；對羥基苯甲酸酯類化合物的檢出限均為0．05 mg/kg（見表2）。

表2 19種有機抗菌劑的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)（r）及檢出限Table 2 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients（r）and limits of detection（LOD）of 19 organic antibacterial agents

2.7 回收率與相對標準偏差

在優(yōu)化實驗條件下，選擇經(jīng)測定不含待測物質(zhì)的濕紙巾、紙巾、紙杯為代表樣品，分別進行3個濃度水平的加標回收實驗，其中對羥基苯甲酸酯類化合物的加標水平為0．2、0．4、2．0 mg/kg；氯苯酚類和季銨鹽類化合物的加標水平為1．0、2．0、10．0 mg/kg；每個濃度水平平行測定6次，平均回收率及相對標準偏差（RSD）見表3。結果顯示，19種有機抗菌劑的平均回收率為74．8%～101%，RSD為2．2%～5．6%，具有較好的準確度和精密度，滿足生活用紙及紙制品中19種有機抗菌劑的分析要求。

表3 19種有機抗菌劑的平均回收率及相對標準偏差（n=6）Table 3 Mean recoveries and relative standard deviations（RSD）of 19 organic antibacterial agents（n=6）

（續(xù)表3）

2.8 實際樣品檢測

從市場上購買濕紙巾、紙巾、紙杯各10批次，采用本方法進行測定。結果顯示，紙巾和紙杯中均未檢出19種有機抗菌劑；濕紙巾中未檢出氯苯酚類化合物，但有2批次濕紙巾檢出對羥基苯甲酸甲酯，含量分別為11．3、15．4 mg/kg；1批次濕紙巾檢出芐索氯銨，含量為132．3 mg/kg；1批次濕紙巾同時檢出芐索氯銨和西吡氯銨，含量分別為152．2、246．5 mg/kg。圖2為代表性濕紙巾陽性樣品的色譜圖。

圖2 濕紙巾陽性樣品的色譜圖Fig．2 Chromatograms of positive wet tissue samplesA：wet tissue containing benzethonium chloride and cetylpyridinium chloride；B：wet tissue containing methyl 4-hydroxybenzoate

3 結 論

本文通過對色譜分析條件和樣品前處理條件進行優(yōu)化，建立了同時測定生活用紙及紙制品中19種有機抗菌劑（包括7種氯苯酚類化合物、6種季銨鹽類化合物和6種對羥基苯甲酸酯類化合物）含量的高效液相色譜法，方法檢出限為0．05～0．3 mg/kg；樣品加標回收率為74．8%～101%，RSD為2．2%～5．6%。該方法簡單、快速、準確可靠，適用于生活用紙及紙制品中19種有機抗菌劑的同時檢測。