胡汝慧 李薇 王昊 梅文莉 米承能 袁靖喆 戴好富

摘 ?要：為進一步研究國產(chǎn)人工打洞法所結(jié)沉香中的化學成分，本研究采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20、半制備高效液相等色譜方法從其乙酸乙酯萃取物中分離純化得到2個單體化合物。根據(jù)核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）等波譜數(shù)據(jù)分別鑒定為2-（2-苯乙基）色酮二聚體（+）-3′，3′′′-dihydroxy-4′，4′′′-dimethoxyaquisinenone G （1）和aquilasinenone F （2），其中化合物1為新化合物。抗氧化活性測試結(jié)果表明，化合物1和2都對DPPH自由基具有一定的清除能力，其中化合物2的IC50 值為（64.6±1.6）mol/L，陽性對照為L（+）-抗壞血酸。

關(guān)鍵詞：國產(chǎn)人工打洞沉香;2-（2-苯乙基）色酮二聚體;DPPH;分離鑒定

Abstract： In order to further study the chemical constituents of Chinese agarwood induced by artificial holing， two compounds were isolated from the ethyl acetate extract of the agarwood by silica gel column chromatography， Sephadex LH-20， semi-preparative HPLC column chromatography and other methods in this study. According to NMR， MS and other spectral data， they were identified as dimeric 2-（2-phenethyl） chromones， （+）-3′，3′′′-dihydroxy-4′，4′′′- dimethoxyaquisinenone G （1） and aquilasinenone F （2）. Compound 1 is a new compound. The results of activity measurement showed that both compounds had certain scavenging ability to 2，2-Diphenyl- 1-picrylhydrazyl （DPPH） radicals. The IC50 value of compound 2 was （64.6±1.6）mol/L， and the positive control was L （+）-ascorbic acid.

Keywords： Chinese agarwood induced by artificial holing; dimeric 2-（2-phenethyl）chromone; DPPH; isolation and identification

沉香為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）或擬沉香屬（Gyrinops）物含有樹脂的木材[1]。沉香作為一種傳統(tǒng)中藥，其味辛、苦，性微溫，廣泛應(yīng)用于止痛、止咳、止吐，并可以緩解胃病、咳嗽、風濕和高燒[2-3]。白木香是我國沉香的唯一基原植物，主要分布在海南、福建、廣東及廣西等地區(qū)，其所結(jié)樹脂稱為“國產(chǎn)沉香”[4-6]。白木香只有在自然傷害（雷劈、風害、蟲蛀等）或人為傷害（砍傷、鑿洞、接菌等）下才會結(jié)香[7]。隨著人們對沉香需求的不斷擴大，其野生資源面臨枯竭，沉香作為瀕危物種目前已被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》（CITES）名錄[8]。因此，在其野生資源利用受到限制的情況下，為了滿足沉香的市場需求，人工結(jié)香技術(shù)不斷地發(fā)展，其中人工打洞法是一種較為常見的人工結(jié)香方法[9]。

前期在對人工打洞法產(chǎn)生的“國產(chǎn)沉香”化學成分的研究中，本課題組分離鑒定了一系列的倍半萜類和2-（2-苯乙基）色酮類化合物[9-16]。為了進一步揭示人工打洞對沉香化學成分的影響，本研究對國產(chǎn)沉香的乙酸乙酯萃取部分進行分離純化，采用波譜學方法對化合物進行鑒定，以期從中發(fā)現(xiàn)更多具有不同連接方式的二聚體，豐富沉香中2-（2-苯乙基）色酮聚合物的骨架結(jié)構(gòu)，為國產(chǎn)沉香的進一步開發(fā)利用提供一定的科學依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?植物材料 ?結(jié)香4年的國產(chǎn)人工打洞沉香樣品（4.7 kg）于2012年11月采自云南省西雙版納傣族自治州，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所代正福副研究員鑒定其基原植物為白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]，樣本保存在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所（標本編號為AW20121108）。

1.1.2 ?儀器與設(shè)備 ?薄層色譜硅膠板和柱色譜硅膠，青島海洋化工廠;Sephadex LH-20，德國默克公司;N1000（2 L）立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司;安捷倫1260分析型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司;Bruker AV 500型超導(dǎo)核磁共振波譜儀，德國布魯克公司;ELX-800酶標儀，美國寶特公司;UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津公司;API QSTAR Pulsar 質(zhì)譜儀（HR-ESI-MS），德國布魯克公司;AV-500Nicolet 380紅外光譜儀，美國賽默公司;MCP 5100旋光儀，美國安東帕公司;萬分之一電子秤，北京賽多利斯天平有限公司;JASCO J-715分光光度計，日本分光株式會社;SUMMIT P680A半制備高效液相色譜儀，美國戴安公司;半制備色譜柱（C18，250 mm×10.0 mm，ID），日本半井公司。

1.1.3 ?主要試劑 ?濃硫酸（≥98%），淄博濱嶺化工有限公司;核磁共振用氘代試劑（≥99%），德國默克公司;乙腈、甲醇，色譜純，天津科密歐公司;甲醇、氯仿，分析純，天津科康德公司;石油醚、乙酸乙酯和丙酮，均為分析純，廣州化工公司;2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基，Sigma公司;L（+）-抗壞血酸，國藥集團公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?化學成分的分離 ?國產(chǎn)人工打洞沉香（4.7?kg）粉碎成粉末后用95%乙醇溶液加熱回流提取3次，減壓濃縮后得到乙醇提取物（510.0?g）。提取物分散至水中后依次用乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，萃取液分別經(jīng)減壓濃縮，得到乙酸乙酯浸膏（310.0 g）和正丁醇浸膏（199.0 g）。將乙酸乙酯相（310.0?g）經(jīng)減壓硅膠柱色譜，用氯仿∶甲醇（1∶0～0∶1）梯度洗脫得到9個流份（Fr.1～9）。Fr. 5（89.6 g）首先經(jīng)MCI柱色譜除去部分色素得到86.6 g，經(jīng)減壓硅膠柱（石油醚∶丙酮=2∶1，1∶1，1∶1，1∶20）分成6個流份（Fr.5-a～f），將其中Fr.5-c（46.8 g）經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿∶甲醇=1∶1）凝膠柱色譜洗脫得5個流份（Fr.5-c-1～5）。Fr.5-c-3（5.8 g）經(jīng)反相柱色譜（甲醇∶水=3∶7～1∶0）梯度洗脫得到11個流份（Fr.5-c-3-1～11），其中Fr.5-c-3-5（299.0 mg）經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿∶甲醇=1∶1）凝膠柱色譜洗脫得3個流份（Fr.5-c-3-5-1～3），再將Fr.5-c- 3-5-2（228.3 mg）減壓硅膠柱色譜，用氯仿∶甲醇（80∶1～0∶1）梯度洗脫得到5個流份（Fr.5- c-3-5-2-1～5），最后Fr.5-c-3-5-2-3（66.3 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜C18柱;28%乙腈-水系統(tǒng)為流動相;流速4?mL/min;檢測波長210 nm得到化合物1（1.4 mg，tR=39.5 min）。Fr.5-c-3-4（240.9?mg）經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿∶甲醇=1∶1）凝膠柱色譜洗脫得5個流份（Fr.5-c-3-4-1～5），再將Fr.5-c-3-4-4（106.8 mg）減壓硅膠柱色譜，用氯仿∶甲醇（80∶1～0∶1）梯度洗脫得到6個流份（Fr.5-c-3-4-4-1～6），最后Fr.5-c-3-4-4-5（36.5?mg）經(jīng)半制備高效液相色譜C18柱;45%甲醇-水系統(tǒng)為流動相;流速4 mL/min;檢測波長210 nm得到化合物2（1.5 mg，tR=16.3 min）。

1.2.2 ?DPPH自由基清除率的測定 ?參照文獻[17]對化合物1和2進行DPPH自由基清除能力測定。用無水乙醇配制0.1 mmol/L的2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）溶液，避光保存;配制100 mmol/L （+）-抗壞血酸（Vc）溶液（作為陽性對照）;將待測樣品稀釋為1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 ?mol/L不同濃度。將以下各溶液混勻于96孔酶標板后置于酶標儀中：實驗組20 ?L待測樣品溶液+180 ?L DPPH溶液，陰性對照20??L DMSO溶液+180 ?L DPPH溶液，陽性對照20??L Vc溶液+180 ?L DPPH溶液，空白對照20??L DMSO溶液+180 ?L無水乙醇溶液。避光保存30?min，于酶標儀517?nm波長處測其吸光度。計算出樣品對DPPH自由基的清除率和IC50值，每個分析樣品重復(fù)3次。清除率計算公式如下：

1.2.3 ?化合物的結(jié)構(gòu)鑒定方法 ?（1）核磁共振譜（NMR）：用約0.5 mL的CD3OD氘代試劑溶解純化合物，并轉(zhuǎn)移到微量核磁管中進行核磁共振測試。

（2）質(zhì)譜（MS）：微量樣品用色譜級甲醇溶解后過0.45 ?m 微孔濾膜，再用進樣針吸取少量樣品溶液注入質(zhì)譜儀中，采集信息。質(zhì)譜條件：陽離子采集模式，采集二級質(zhì)譜，掃描范圍m/z 70～2200，氮氣流速6.0?L/min，干燥氣體溫度為250℃，霧化氣壓力為15 psi，毛細管壓力4000 V。

（3）紅外光譜（IR）：將溴化鉀置于紅外燈下研磨，并用粉末壓片機將其壓成透明的溴化鉀片;然后將溶于適量易揮發(fā)有機溶劑的樣品滴到溴化鉀片上，待溴化鉀片上溶劑揮干后再在紅外光譜儀上進行測定。

（4）紫外光譜（UV）：將樣品溶于適宜溶劑并配制成20??g/mL溶液，測試前先用溶劑做空白對照將紫外分光光度計進行調(diào)零，然后將溶液移入石英比色皿，在190～400?nm波長下掃描，記錄吸收值。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定形粉末;C36H32O12;[α] + 81.5 （c 0.130， MeOH）;UV （MeOH） λmax （log ε）：301 （3.69）， 271 （3.99）， 205 （4.52）nm;IR （KBr） υmax 3448， 2925， 1628， 1448， 1381， 1268， 1096， 1033 cm–1;1H-NMR （CD3OD， 500 MHz）和13C-NMR （CD3OD， 125 MHz）數(shù)據(jù)見表1;HR-EI-MS m/z： 679.1753 [M+Na]+（計算值為C36H32NaO12， 679.1786），數(shù)據(jù)見圖1;ECD （c 0.09 M?1cm?1 MeOH） λmax （Δε）： 206 （?16.73）， 220 （17.26）， 250 （17.09）， 277 （?8.65）， 315 （3.20）nm。

該化合物的紅外測試結(jié)果如圖2所示，化合物結(jié)構(gòu)中存在羥基（3448?cm?1）和α，β-不飽和酮（1628 cm?1）。分析化合物1的1 D和2 D NMR數(shù)據(jù)（表1、圖3）可知，存在2個甲氧基單峰：δH 3.76 （3 H， s）和δH 3.78 （3 H， s）;2個雙鍵上的質(zhì)子：δH 6.05 （1 H， s， H-3）和δH 6.06 （1 H， s， H-3″），4個連續(xù)的CH信號：δH 5.53 （1 H， s， H-5″），δH 4.60 （1 H， br s， H-6″），δH 4.79 （1 H， br s， H-7″），δH 4.46 （1 H， s， H-8″）;2個ABX芳香環(huán)系統(tǒng)：δH 6.65 （1 H， d， J = 2.1 Hz， H-2′），δH 6.67 （1 H， d， J = 8.2 Hz， H-5′），δH 6.32 （1 H， dd， J = 8.2， 2.1 Hz， H-6′）和δH 6.59 （1 H， d， J = 2.2 Hz， H-2′′′），δH 6.74 （1 H， d， J = 8.2 Hz， H-5′′′），δH 6.57 （1 H， 2.2 Hz， H-6′′′）;芳香環(huán)上的2個對位質(zhì)子：δH 7.67 （1 H， s， H-5），δH 6.95（1 H， s， H-8）;4組亞甲基信號：δH 2.90 （6H， m， H-8′/7′′′/8′′′）和δH 2.76 （2H， m， H-7′）。由以上信息推測出化合物1是由2個2-（2-苯乙基）色酮單體聚合而成的2-（2-苯乙基）色酮二聚體。

經(jīng)比對1H-NMR和13C-NMR 數(shù)據(jù)（表1）發(fā)現(xiàn)，化合物1中的色酮母核的氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與1類2-（2-苯乙基）色酮二聚體相似，如crassins E-G[18]、（–）-aquisinenone G[19]以及（+）-4′-methox yaquisinenone G[19]，因此推測化合物1是5，6，7，8-四氫-2-（2-苯乙基）色酮和fidersia型2-（2-苯乙基）色酮通過C-6-O-C-7′′和C-7-O-C-5′′2個醚鍵聚合形成，與（+）-4′-methoxyaquisinenone G[19]的區(qū)別在于化合物1有2個ABX芳香環(huán)系統(tǒng)，推測出化合物1的2個苯乙基片段中苯環(huán)的間位（C-3′和C-3′′′）和對位（C-4′和C-4′′′）都存在取代基。又通過甲氧基δH 3.78與δC 147.6 （C-4′）的HMBC相關(guān)信號和甲氧基δH 3.78與δH 6.67 （H-5′）的ROESY相關(guān)信號確定了甲氧基δH 3.78取代在C-4′位。同理可得，甲氧基δH 3.76取代在C-4′′′位，所以2個苯乙基片段中苯環(huán)的間位即C-3′和C-3′′′位被羥基取代。根據(jù)ROESY譜上δH 4.60 （H-6″）與δH 4.46 （H-8″），δH 5.53 （H-5″）與δH 4.79 （H-7″）的相關(guān)信號，確定了化合物1的5″， 6″， 7″， 8″位的相對構(gòu)型?；衔?與（+）-4′-methox ya quisinenone G[19]的ECD譜具有相同的Cotton效應(yīng)（圖4）且旋光數(shù)據(jù)相似，確定二者絕對構(gòu)型相同，即為5″R，6″S，7″R，8″S。綜上化合物1的結(jié)構(gòu)如圖5所示，將其命名為（+）-3′，3′′′-dihydroxy- 4′，4′′′-dimethoxyaquisinenone G。

2.2 ?DPPH自由基清除率

結(jié)果如表2所示，化合物1和2在1000 mol/L濃度時都表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，對DPPH自由基的清除率分別為39.3%、59.6%，其中化合物2對DPPH自由基的清除效果相對更好，IC50值為（64.6±1.6）mol/L。

3 ?討論

目前，從沉香中鑒定了360多種化學成分，主要是倍半萜類（55.86%）和2-（2-苯乙基）色酮類（44.14%）化合物[20]，其中2-（2-苯乙基）色酮類化合物大部分為2-（2-苯乙基）色酮單體類化合物。但近年來一系列結(jié)構(gòu)新穎的2-（2-苯乙基）色酮二聚體[15-16， 18-19， 21-23]被國內(nèi)外學者陸續(xù)從沉香中分離鑒定，是沉香中化合物的研究熱點。

前期研究已從本樣品中分離鑒定了一系列通過一個醚鍵連接形成的2-（2-苯乙基）色酮二聚體[15-16]。本研究從國產(chǎn)沉香的乙酸乙酯萃取物中分離得到了1個新的2-（2-苯乙基）色酮二聚體（1）和1個已知的2-（2-苯乙基）色酮二聚體（2），并對化合物1和2的分離、結(jié)構(gòu)鑒定和DPPH自由基清除率結(jié)果進行了報道。（+）-3′，3″-dihydroxy-4′， 4′′′-dimethoxya quisinenone G （1）是1個5，6，7，8-四氫-2-（2-苯乙基）色酮和1個fidersia型的2-（2-苯乙基）色酮通過2個醚鍵形成的具有七元二氧環(huán)的二聚體，之前報道的通過這種方式聚合而成的2-（2-苯乙基）色酮二聚體只有5個[18-19]，且化合物1中苯乙基的苯環(huán)間位和對位都具有取代基，結(jié)構(gòu)上具有一定新穎性，豐富了國產(chǎn)沉香中2-（2-苯乙基）色酮二聚體的化學結(jié)構(gòu)，也為國產(chǎn)人工打洞沉香的質(zhì)量評價提供了參考。

文獻報道的色酮二聚體的生物活性主要有抗炎活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性、細胞毒活性，未見有關(guān)色酮二聚體的抗氧化活性報道[15-16，18-23]，僅報道了單體2-（2-苯乙基）色酮類化合物的抗氧化活性[11]。本研究發(fā)現(xiàn)2個色酮二聚體（1和2）對DPPH自由基具有一定的清除效果，其中化合物2的IC50值為（64.6±1.6）mol/L。本文為第一次報道色酮二聚體對DPPH自由基的清除能力，為沉香中化學成分后續(xù)的抗氧化活性篩選提供了科學依據(jù)。

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責任編輯：崔麗虹