謝全亮 于莉 袁博軒 張雪妍 馬駿駿 王旭初

摘 ?要：產(chǎn)膠植物合成的天然橡膠是一種聚異戊二烯高分子化合物，廣泛用于民生、醫(yī)療和軍事等領(lǐng)域，具有重要的經(jīng)濟價值和戰(zhàn)略地位。天然橡膠主要是通過甲羥戊酸和甲基赤蘚糖醇途徑共同合成，其合成機制主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)調(diào)控方面。本文綜述了蛋白組學(xué)在產(chǎn)膠植物橡膠樹、橡膠草、銀膠菊和杜仲中天然橡膠生物合成調(diào)控的研究進展，歸納了天然橡膠生物合成過程中相關(guān)蛋白質(zhì)可能的調(diào)控機制，為促進我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)向多元化發(fā)展提供一定的潛在作用和建設(shè)性意見。

關(guān)鍵詞：天然橡膠;巴西橡膠樹;橡膠草;銀膠菊;蛋白質(zhì)組

Abstract： The natural rubber synthesized by rubber-producing plant is a polyisoprene high-molecular compound. It is widely used in the fields of peoples livelihood， medical treatment and military affairs， and has important economic value and strategic position. Natural rubber is mainly synthesized through mevalonate and methylerythritol pathways， and its synthesis mechanism is mainly manifested in protein regulation. In this paper， the research progress of proteomics in the regulation of natural rubber biosynthesis in rubber-producing plants Hevea brasiliensis， rubber grass rubber grass Taraxacum kok-saghy， the guayule Parthenium argentatum Gray and Eucommia ulmoides Oliver was reviewed. The possible mechanism of protein regulating natural rubber biosynthesis was summarized. Finally， we put forward several opinions， and it has certain potential roles and constructive suggestions on the diversified development of China's natural rubber industry in future.

Keywords： natural rubber; Hevea brasiliensis; Taraxacum kok-saghyz; Parthenium argentatum; proteomics

天然橡膠（順式-1，4-聚異戊二烯）是天然高分子化合物，與合成橡膠相比有優(yōu)良的抗撕裂、耐老化、回彈性、伸展性、較強金屬粘合性和應(yīng)變誘導(dǎo)結(jié)晶性能等。其制品遍及民生、交通運輸業(yè)、醫(yī)療制品業(yè)、建材業(yè)、機械制造業(yè)、航天科技和國防軍工業(yè)等領(lǐng)域，具有不可替代作用，所以天然橡膠具有重要的經(jīng)濟價值和戰(zhàn)略意義[1]。巴西橡膠樹是當前天然橡膠的主要來源，但由于葉枯病和人類對原始植地的破壞等原因，近些年全球天然橡膠的總產(chǎn)量約1200萬～1400萬t，已達到生產(chǎn)上限。我國是天然橡膠消費大國，但80%以上的天然橡膠依賴進口來滿足，致使天然橡膠產(chǎn)業(yè)成為一種典型的資源約束型產(chǎn)業(yè)，一旦切斷我國天然橡膠進口來源，橡膠產(chǎn)業(yè)形勢不容樂觀[2]。目前，僅通過提高橡膠樹單產(chǎn)來提高我國天然橡膠產(chǎn)量進度十分緩慢，其策略也非常不符合現(xiàn)實，必須大膽開辟新的途徑，尋找其他產(chǎn)膠作物來增加天然橡膠多元化來源，以緩解當前我國對進口天然橡膠的依賴。在近幾十年里，世界科學(xué)家在近萬種植物中大量篩選試種，在2500多種產(chǎn)膠植物中，最終篩選出新生產(chǎn)膠物種草本植物橡膠草和銀膠菊，二者均可在貧瘠和高緯度寒冷地域生長，且具有適合規(guī)?；N植采收的特點[3]。研究者們對這幾種產(chǎn)膠植物進行了系統(tǒng)性研究，并試圖將橡膠草作為潛在產(chǎn)膠經(jīng)濟作物，以期進一步使天然橡膠產(chǎn)業(yè)多元化發(fā)展。

膠乳是產(chǎn)膠植物中一種?；匀楣芗毎募毎|(zhì)，乳膠中主要含有橡膠粒子（RPs）、C-乳清（CS）及黃色體（Lutoid）等成分[4]，而橡膠粒子是天然橡膠膠乳中的一種用于橡膠生物合成和貯存的特殊細胞器。研究發(fā)現(xiàn)，天然橡膠的生物合成是一種典型的植物類異戊二烯的次生代謝途徑。甲羥戊酸（MVA）途徑和甲基赤蘚糖醇（MEP）途徑是橡膠樹中天然橡膠合成的2種主要途徑，MVA發(fā)生在細胞質(zhì)中，而MEP發(fā)生在質(zhì)體中，二者均可合成類異戊二烯橡膠單體[5]。天然橡膠的生物合成是將異戊烯基焦磷酸（IPP）作為合成原料，合成過程可分為3個階：（1）乙酰-CoA合成的起始階段;（2）乙酰-CoA再經(jīng)過MVA轉(zhuǎn)化成IPP的延伸過程;（3）最后由多個IPP分子通過順式聚合的方式形成高分子聚合物——天然橡膠[6]。研究表明，橡膠粒子是橡膠生物合成和貯存的特殊細胞器，天然橡膠主要是通過RPs膜上多種蛋白質(zhì)共同調(diào)控合成[7]，并且主要通過調(diào)控橡膠粒子上的蛋白質(zhì)的表達積累量和酶的活性起作用[8]。

如何精準調(diào)控橡膠樹中天然橡膠的生物合成，一直是天然橡膠基礎(chǔ)研究中的核心問題。隨著基因組測序研究的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)組研究隨之不斷更新，并廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個研究領(lǐng)域[9]，產(chǎn)膠植物的蛋白組學(xué)研究也相繼展開，研究包括在細胞水平、蛋白質(zhì)表達水平、蛋白質(zhì)相互作用、氨基酸翻譯后修飾等內(nèi)容，并取得了很多有價值的新研究成果。本文綜述了橡膠樹、橡膠草和銀膠菊等產(chǎn)膠植物在國內(nèi)外蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域的最新進展，以期為解析蛋白質(zhì)在天然橡膠生物合成中的調(diào)控機制提供新思路，為促進我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)向多元化發(fā)展提供一定的潛在作用和建設(shè)性意見。

1 ?天然橡膠生物合成的關(guān)鍵蛋白酶和調(diào)控基因研究

早在1969年，Archer等[10]首次提出橡膠轉(zhuǎn)移酶（RT-ase）是天然橡膠生物合成的主要合成酶。2013年，巴西橡膠樹的基因組草圖首次報道，為解開天然橡膠生物合成機理研究奠定生物信息學(xué)基礎(chǔ)，并指出天然橡膠的合成并不是RT-ase單一酶的作用結(jié)果[11]。2016年，Tang等[12]將橡膠樹基因組進一步深度測序，獲得基因組93.8%（1.47 Gb）的覆蓋率，包含約43 792個預(yù)測的蛋白編碼基因。2020年，Liu等[13]使用單分子實時測序（SMRT）和Hi-C技術(shù)將橡膠樹基因組裝配到18條假染色體中，與整個橡膠生物合成過程相關(guān)基因的顯著擴展，還鑒定了許多與產(chǎn)膠相關(guān)的候選馴化基因，其中一些基因與橡膠樹栽培種中的橡膠生物合成有關(guān)。

天然橡膠是在植物類異戊二烯/萜類次生代謝中產(chǎn)生的，細胞質(zhì)中的類異戊二烯合成單體分子IPP，是由乙酰-CoA在MVA途徑或丙酮酸和甘油醛-3-磷酸經(jīng)質(zhì)體中的MEP途徑生成[14]。在MVA途徑中，每種酶的家族基因中至少有一個基因成員在乳膠中大量表達，說明MVA途徑是橡膠樹天然橡膠生物合成IPP的主要貢獻者，也是天然橡膠最主要合成的途徑[15]。MVA通過6個主要步驟合成天然橡膠：乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶（AACT）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（HMGS）[16]、HMG-CoA還原酶（HMGR）、甲羥戊酸激酶（MVK）、磷酸甲羥戊酸激酶（PMK）和甲羥戊酸二磷酸脫羧酶（MVD）[17]。HMG-CoA在胞質(zhì)中將乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為橡膠合成單體IPP，HMGS催化乙酰乙酰-CoA向HMG-CoA轉(zhuǎn)化是不可逆的反應(yīng)，所以HMGS是MVA途徑的決定性步驟和關(guān)鍵限速酶[18]，接著MVA途徑通過二甲丙烯焦磷酸酯（DMAPP）、牻牛兒基焦磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸合酶（FPS）和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）等一系列酶促反應(yīng)后，再經(jīng)順式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（CPT）、橡膠延伸因子（REF）、小橡膠粒子膜蛋白（SRPP）和橋接蛋白（HRBP）形成的復(fù)合體共同作用下，使IPP單體在橡膠粒子膜上聚合形成IPP長鏈分子。通常橡膠分子起始物APP的合成與其他植物合成一樣，在乳管細胞的細胞質(zhì)或質(zhì)體中進行，并且催化過程中的酶都相同，在APP合成過程中法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）是關(guān)鍵酶[19]。橡膠分子延伸是在橡膠粒子膜上進行，通過膜表面蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物催化IPP加到橡膠鏈上形成天然橡膠[7]。Cornish等[20]研究發(fā)現(xiàn)，橡膠轉(zhuǎn)移酶（RuTase）是一類順式異戊二烯轉(zhuǎn)移酶，它將IPP聚合到橡膠分子上，或與APP合成分子量大小不等的順式-1，4-聚異戊二烯。RuTase也是一個多種酶的合稱，均為疏水性蛋白，不同的植物中的RuTase具有相近的性質(zhì)，能與橡膠粒子膜上的CPT結(jié)合，參與橡膠延伸最后一步反應(yīng)，并決定橡膠分子的大小，但二者之間精確結(jié)合位點及互作方式還有待解析。

天然橡膠分子量約為105～106 Da，是由成千上萬個IPP聚合構(gòu)成[1]，在橡膠粒子膜上的SRPP和REF蛋白占較大比例，不僅影響天然橡膠生物合成的速度，還可能與橡膠分子量的大小有關(guān)，直接關(guān)系著橡膠膠乳的產(chǎn)量[21]。REF、SRPP和HRBP等蛋白的合成與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）緊密相關(guān)，質(zhì)膜上的CPT是被SRPP轉(zhuǎn)入到ER內(nèi)，而HRBP蛋白與CPT蛋白結(jié)合相互作用后，再將CPT蛋白又重新轉(zhuǎn)至質(zhì)膜中[6]。雖然CPT、REF、SRPP和HRBP蛋白在橡膠生物合成中起著積極和關(guān)鍵作用，但天然橡膠的分子量大小的決定性因素仍然不清楚。這些蛋白質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)具體的催化結(jié)構(gòu)域，還需對每種蛋白的同/異種結(jié)構(gòu)型蛋白及蛋白修飾的確切功能進行深入研究。

2 ?橡膠樹蛋白質(zhì)組研究

2.1 ?橡膠樹不同組織蛋白質(zhì)組研究

1991年，Martin[22]通過雙向蛋白電泳（2-DE）結(jié)合酶學(xué)技術(shù)，首次報道橡膠樹膠乳中黃色體和C-乳清的蛋白表達圖譜，并發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶和溶菌酶是膠乳蛋白中的主要成分。很多天然橡膠制品都會引起人類的過敏反應(yīng)現(xiàn)象，通過蛋白質(zhì)微陣列和2-DE技術(shù)，發(fā)現(xiàn)膠乳中存在很多過敏原蛋白。2004年，Yagami等[23]在膠乳中鑒定了10個膠乳過敏原蛋白，其中5個是新的過敏原蛋白。在膠乳蛋白聯(lián)合肽段配體庫（Combinatorial Peptide Ligand Libraries）中，共有300多個基因產(chǎn)物。然后通過18個病人的抗體篩選膠乳過敏原，發(fā)現(xiàn)除了常規(guī)的膠乳過敏原蛋白外，還發(fā)現(xiàn)有熱激蛋白80、蛋白酶體亞基、蛋白酶抑制劑、幾丁質(zhì)酶A（hevamine A）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）等也被認為是膠乳過敏原蛋白。橡膠樹不同組織蛋白組研究能夠發(fā)現(xiàn)組織特異性蛋白質(zhì)，其具體功能對精確解析相關(guān)代謝機制顯得尤為重要。

2.1.1 ?橡膠樹樹皮蛋白質(zhì)組研究 ?橡膠樹韌皮部中的乳管列數(shù)與膠產(chǎn)量密切相關(guān)，是決定橡膠產(chǎn)量的因素之一。對樹干和樹皮進行細胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，形成層與周皮間的乳管位于韌皮部中，呈同心環(huán)狀排列。膠乳的再生不僅取決于乳管細胞本身的代謝，還取決于乳管周圍其他薄壁細胞提供源源不斷的蔗糖和碳氮源等有機能量物質(zhì)[7]。乳管細胞中還存在很多細胞器，如線粒體、高爾基體、核糖體、橡膠粒子、細胞核等。

天然橡膠的生物合成是在橡膠粒子表面進行的，不同含膠植物中橡膠粒子的分布是不同的，如巴西橡膠樹和杜仲在各個組織均有分布，橡膠草的橡膠粒子主要分布在根中的乳管細胞中，葉脈中也有少量分布，而銀膠菊分布在皮層下薄壁細胞中[25]。2008年，蘭芳銀[26]在分析橡膠樹幼樹無性系和老樹無性系的差異蛋白時，發(fā)現(xiàn)了2個與氫氰酸（HCN）合成相關(guān)酶是樹皮特有酶，當樹皮損傷后，產(chǎn)生的HCN對樹皮具有一定的保護作用。另外，在木質(zhì)部蛋白中發(fā)現(xiàn)，S-腺苷甲硫氨酸合成酶和半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶也是高豐度蛋白[27]。2008年，閆潔等[28]在健康樹皮與死皮的膠乳中的黃色體蛋白質(zhì)組對比差異蛋白時，在死皮蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了一個滲透蛋白，該滲透蛋白在死皮植株中表達下調(diào)可能與死皮病的發(fā)生有一定的關(guān)系。2012年，王斌等[29]比較橡膠樹木質(zhì)部和樹皮蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)，與HCN合成相關(guān)的2個酶是樹皮特有的，而半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶（cysteine transmethylase）是木質(zhì)部的高豐度蛋白，這2個酶與橡膠樹木質(zhì)部早期發(fā)育相關(guān)。2001年，Sookmark等[30]發(fā)現(xiàn)了死皮樹膠乳中REF和SRPP蛋白均大量表達，并且在割膠后REF蛋白也明顯增多，說明機械損傷能夠促進膠乳中REF蛋白高調(diào)表達，加速橡膠的合成。此外，在樹皮機械損傷后，還發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶（PPO）使乳膠暴露在空氣出現(xiàn)褐變現(xiàn)象[31]。在乳膠中PPO與乳膠凝固和傷口封閉緊密相關(guān)，然而，在乙烯刺激橡膠后，樹皮中PPO、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的積累反而下降，這可能會阻礙橡膠粒子在傷口的聚集，膠乳的外流時間延長增加，從而提升橡膠產(chǎn)量。

2.1.2 ?橡膠樹種子和葉片蛋白質(zhì)組研究 ?2011年，在橡膠樹種子萌發(fā)前后的差異蛋白質(zhì)功能研究發(fā)現(xiàn)，僅在成熟干種子中酸性凝集素和赤霉素20-氧化酶特異性表達;另有淀粉分支酶、假定的β-葡萄糖苷酶及MutT/nudix家族蛋白質(zhì)在萌發(fā)種子中呈下調(diào)表達。其中MutT/nudix家族蛋白質(zhì)和β-葡萄糖苷酶參與控制細胞壁水解的活性，而胞壁水解活性與種子發(fā)芽過程中胚乳營養(yǎng)組織生長，或與儲藏物的調(diào)動密切相關(guān)[32]。2009年，林秀琴等[33]發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫橡膠樹葉片中有38個差異蛋白表達量明顯增加，這些蛋白主要參與脅迫應(yīng)激響應(yīng)、能量代謝、光合作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程。2012年，王海燕等[34]在對橡膠樹幼嫩和成熟葉片蛋白分離鑒定時，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛋白參與碳代謝和翻譯后修飾過程[35]。

2.2 ?橡膠樹膠乳蛋白質(zhì)組研究

天然橡膠主要在乳管細胞中合成和積累，目前主要集中在膠乳中蛋白質(zhì)修飾方面的研究[36]。膠乳成分較為復(fù)雜，主要含有天然橡膠、碳氫化合物、水、樹脂、油脂和蛋白質(zhì)等[6]。Wang等[37]從橡膠樹全膠乳及膠乳各個組分中提取蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)組研究，在植物酚抽提法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了一套適合分離橡膠樹膠乳及純化其不同組分的技術(shù)。還建立了一種能夠提取全膠乳、黃色體、橡膠粒子和C-乳清蛋白質(zhì)的新方法來滿足蛋白質(zhì)組研究要求。隨后利用2-DE結(jié)合差異凝膠電泳（DIGE）技術(shù)，首次公布橡膠樹膠乳全蛋白凝膠圖譜，質(zhì)譜鑒定143個乙烯響應(yīng)蛋白。Habib等[38]在C-乳清、黃色體和橡膠粒子層中獲得蛋白包括：磷酸化、賴氨酸乙?；端乙?；⒎核鼗土u基化等在翻譯后的蛋白修飾作用，為膠乳蛋白質(zhì)功能研究提供很大幫助。利用iTRAQ標記共獲得1600個膠乳蛋白，其中404個蛋白是響應(yīng)乙烯刺激調(diào)控，再通過磷酸化蛋白質(zhì)組技術(shù)，鑒定了膠乳中59個磷酸化蛋白質(zhì)[39]。Wang等[40]對膠乳不同組分蛋白質(zhì)組分進行亞細胞分析，獲得了橡膠粒子蛋白質(zhì)組的可視化圖譜，并在乳膠的橡膠粒子洗脫液（WS）、CS和RPs中共鑒定數(shù)千種特有蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)WS中含有天然橡膠生物合成的關(guān)鍵酶。差異蛋白分析了可能的生物學(xué)功能及后續(xù)部分功能驗證，然而，橡膠生物合成的相關(guān)基因并沒有受到明顯誘導(dǎo)調(diào)控，在乙烯刺激膠乳增產(chǎn)主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平，這也是阻礙橡膠合成調(diào)控機理研究進度的重要因素。這項研究是橡膠樹膠乳定量蛋白質(zhì)組研究中獲得重要突破性進展。

近些年橡膠樹膠乳蛋白質(zhì)組研究共有26篇文獻，根據(jù)內(nèi)容分類發(fā)現(xiàn)，膠乳中橡膠粒子蛋白組研究文章占28%，RPs蛋白組研究是破解天然橡膠生物合成機制重要部分。膠乳蛋白生物學(xué)功能分類研究占20%，植物防御和橡膠過敏原研究占12%，其它研究占比較少（圖1）。

2.2.1 ?橡膠粒子蛋白質(zhì)組研究 ?橡膠粒子是膠乳的主要成分之一（約占膠乳總體積的30%～50%），平均直徑約為1 μm，外面僅由一層約2.5 nm厚的單位生物半膜包。RPs根據(jù)直徑的不同，通常人們把大于800 nm和小于200 nm的橡膠粒子分別稱為大橡膠粒子（LRPs）和小橡膠粒子（SRPs），相對分子質(zhì)量為22 kDa的SRPP會與SRPs緊密結(jié)合，并且在膠乳中大量表達[41]。乳管細胞內(nèi)的RPs特別是SRPs是進行橡膠生物合成的主要場所，也是天然橡膠貯存的重要細胞器[42]。橡膠粒子是一種由ER發(fā)育而來的特殊細胞器[24]，具有磷脂單分子層膜結(jié)構(gòu)特征，膜上富含膜蛋白，這些膜蛋白主要參與調(diào)控IPP的合成及類胡蘿卜素形成等生物學(xué)過程[5]。

橡膠粒子作為乳管細胞質(zhì)中的重要細胞器，參與了橡膠分子的聚集和延伸[43]。其中，LRPs中包含有分支的橡膠分子，而SRPs中卻沒有鏈結(jié)形成的分支點?？拷举|(zhì)部形成層的乳管層中SRPs含量較多，而靠近外表皮的乳管層中LRPs含量較多;從新鮮膠乳中分離出的SRPs具有更高的RT-ase活性[44]。橡膠樹中REF、SRPP和銀膠菊中的SRPP同源物GHS在橡膠的延伸過程中有正向調(diào)節(jié)作用，體外實驗發(fā)現(xiàn)異源表達的GST-SRPP和His-GHS融合蛋白增強了RPs利用IPP的活性，而對REF和SRPP的抗體免疫抑制卻減少IPP的利用活性[45]。在橡膠草中沉默SRPP也明顯抑制了橡膠合成，說明SRPP很可能是橡膠合成復(fù)合體比REF更重要。在橡膠粒子膜上分離出520個蛋白質(zhì)，質(zhì)譜鑒定大多高豐度蛋白點為REF和SRPP蛋白的異構(gòu)體[46]。研究顯示，橡膠生物合成的速率和聚合程度主要受到SRPs數(shù)量和SRPP種類的影響，并且橡膠粒子中存在非膠組分具有高度的物種特性，可以影響不同植物橡膠的性質(zhì)[47]。

2.2.2 ?C-乳清蛋白組研究 ?2008年，閆潔等[48]在死皮和正常橡膠樹中，C-乳清中蛋白表達顯著變化，共有40個差異蛋白，并通過質(zhì)譜鑒定了其中27個蛋白質(zhì)可能參與了死皮發(fā)生和發(fā)展的過程。2009年，不同采膠強度下C-乳清的蛋白研究發(fā)現(xiàn)，采膠強度高比采膠強度低膠乳C-乳清下調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)量更多，而上調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)量更少，并且隨著采膠強度相差越大，下調(diào)與上調(diào)的比例也越大[49]。在死皮膠乳的乳清蛋白組的研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)REF和SRPP積累明顯增加，這暗示著2種蛋白質(zhì)可能參與了橡膠樹死皮應(yīng)答過程。魏芳等[50]選取采膠強度為嚴重過度、適中、嚴重不足的橡膠樹膠乳，提取C-乳清中的蛋白質(zhì)進行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同采膠強度下的C-乳清中存在十幾個差異蛋白。在高產(chǎn)和低產(chǎn)膠橡膠樹的膠乳差異蛋白對比時，在C-乳清中的上調(diào)蛋白數(shù)量較少，下調(diào)蛋白數(shù)量較多，并且隨著采膠強度的增加，其上調(diào)與下調(diào)差異蛋白比例也相應(yīng)增大。通過研究不同采膠強度下的橡膠樹膠乳C-乳清蛋白質(zhì)差異，找出采膠強度與膠乳C-乳清蛋白質(zhì)的關(guān)系，利用這種關(guān)系進行乙烯刺激采膠強度的判斷，進而可指導(dǎo)采膠生產(chǎn)和產(chǎn)膠機理研究。

2.2.3 ?黃色體蛋白質(zhì)組研究 ?橡膠樹膠乳中黃色體是一種特化的植物液泡，占乳管細胞內(nèi)比例很大的一種細胞器，其含量約占膠乳鮮重的15%～30%。在橡膠樹正常樹皮與死皮樹的黃色體中有24個差異蛋白，這些差異蛋白可能參與死皮的發(fā)生和發(fā)展過程，其中一個滲透蛋白質(zhì)與死皮病的發(fā)生呈正相關(guān)[51]。黃色體破裂后會釋放pH約為5.5的內(nèi)含物：B-乳清。B-乳清中含有橡膠素、幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶、大量二價陽離子、防衛(wèi)蛋白和可溶性蛋白質(zhì)等物質(zhì)。B-乳清的主要作用是在橡膠樹受到破壞時膠乳中能使RPs失去穩(wěn)定性后凝集，加快網(wǎng)絡(luò)蛋白結(jié)合[52]，在電鏡下觀察乳管傷口附近的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是由蛋白質(zhì)構(gòu)成，稱為“蛋白質(zhì)網(wǎng)”[53]，促進膠乳快速凝固加快傷口封閉。據(jù)推測，該網(wǎng)還可能是一個化學(xué)防護物，主要成分來自于排膠過程中黃色體破裂后釋放的防衛(wèi)蛋白和結(jié)合相關(guān)酶等內(nèi)含物相互作用的結(jié)果[54]。病原入侵能夠提高黃色體內(nèi)源幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的活性抑制病原菌增生和生長快速閉塞受侵害部位，不但提供一個物理屏障防止膠乳外流，同時也是一個生化屏障免受病原體侵入乳管細胞內(nèi)從而產(chǎn)生病變的作用[52]。

2.3 ?乙烯/茉莉酸/割膠刺激使橡膠樹增產(chǎn)的蛋白組研究

研究發(fā)現(xiàn)RPs膜上存在乙烯/茉莉酸信號響應(yīng)蛋白，所以采膠時常用乙烯/茉莉酸刺激割膠部位，延長排膠時間提高產(chǎn)膠量[55]。乙烯處理橡膠樹幼苗后，蔗糖含量顯著下降，在2-DE圖譜中有66個蛋白質(zhì)點的豐度發(fā)生顯著變化，其中54個蛋白質(zhì)表達高調(diào)，這些蛋白質(zhì)主要與篩管中碳水化合物的運輸及代謝相關(guān)。另外，還發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜H+-ATPase的基因與蛋白表達水平變化趨勢具有一致性[56]，說明乙烯刺激提高了篩管的傳輸效率，并促進了篩管的能量和蔗糖消耗。在乙烯刺激膠乳乳清iTRAQ標記時，SRPP和REF蛋白也會大量積累，這可能是SRPP和REF存在響應(yīng)乙烯刺激結(jié)構(gòu)域，從而使橡膠粒子之間相互作用后具有一定的富集作用。隨后，Tong等[57]乙烯處理橡膠樹后，在膠乳的橡膠粒子對選定的REF（Hevb 1）、SRPP（Hevb 3）和蔗糖磷酸合酶蛋白進行免疫印跡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同pI和分子量的SRPP存在多個不同亞型蛋白，并且REF2、SRPP1和SRPP3的蛋白在膠乳中均高表達[39， 57]。SRPP和REF的mRNAs在乳管層和膠乳中高表達，并且割膠刺激也會使其高表達[58]，免疫金電鏡發(fā)現(xiàn)SRPs分布于靠近形成層的傳導(dǎo)韌皮部中，而REF在所有乳管層均有分布。REF在橡膠合成中的作用可能是輔助性的，而SRPP同源物只能在產(chǎn)生高分子量橡膠的物種中發(fā)現(xiàn)（如巴西橡膠樹和銀膠菊），在低分子量橡膠的物種（如無花果和孟加拉榕）中并未發(fā)現(xiàn)。所以SRPP在橡膠合成延伸過程中可能比REF具有更大的作用[23]。雖然REF和SRPP具有多種型，不同橡膠樹無性系的乳膠的REF和SRPP的磷酸化修飾對于橡膠合成可能至關(guān)重要，但他們中很少與產(chǎn)膠量或?qū)σ蚁┐碳さ捻憫?yīng)相關(guān)[52]，這與乙烯刺激產(chǎn)膠機理之間的聯(lián)系還需深入探究。另一方面，乙烯刺激后還能夠促使RPs上的幾丁質(zhì)酶和1，3-β葡聚糖酶活性增強[59]，并且?guī)锥≠|(zhì)代謝的乳膠過敏原Hevb 2和Hevb 9蛋白活性也相應(yīng)增加。研究還發(fā)現(xiàn)，橡膠樹乳管細胞內(nèi)存在COI1-JAZ3-MYC2結(jié)構(gòu)模塊，這是響應(yīng)茉莉酸特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊[60]，進一步證實茉莉酸刺激橡膠樹能夠增加天然橡膠產(chǎn)量。通過DIGE結(jié)合iTRAQ對乙烯處理不同SRPs蛋白質(zhì)組研究[61]，發(fā)現(xiàn)許多橡膠合成相關(guān)蛋白是在乙烯的誘導(dǎo)下急劇高調(diào)，所有與橡膠合成相關(guān)的蛋白質(zhì)都可在SRPs中檢測到，說明SRPs上有許多蛋白質(zhì)對乙烯刺激具有積極的反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)某些關(guān)鍵蛋白質(zhì)的積累來刺激乳膠產(chǎn)生，還說明SRPs可能充當復(fù)雜的天然橡膠生物合成機器合成天然橡膠。Dai等[62]用乙烯利和茉莉酸處理橡膠樹，在乳膠中共有101種蛋白質(zhì)是響應(yīng)乙烯利/茉莉酸調(diào)節(jié)，其中包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEP）、乙酰輔酶-A，C-乙酰轉(zhuǎn)移酶（ACCT）和幾種REF同種型的蛋白質(zhì)均受乙烯調(diào)控參與乳膠再生。所以外施乙烯/施茉莉酸與割膠刺激增強橡膠合成的作用類似，均能延長排膠時間進而達到增產(chǎn)效果。綜上所述，可預(yù)測天然橡膠生物合成調(diào)控機制關(guān)鍵在蛋白質(zhì)調(diào)控層面，而橡膠粒子膜上蛋白質(zhì)的調(diào)控作用是解析橡膠生物合成機制重要研究方向，如乙烯、茉莉酸和割膠刺激橡膠樹的天然橡膠生物合成模式圖（圖2，紅色剪頭所指的粉紅色間隔線圈出部位）。目前，推測乙烯刺激橡膠增產(chǎn)的機理可能是植物將大量淀粉轉(zhuǎn)為蔗糖，為乳管細胞提供能量，促使蔗糖大量進入乳管細胞，以增加乳管細胞膜上酶的活性，為橡膠合成提供能量動力，從而增強乳管對蔗糖吸收，這種現(xiàn)象也稱為“質(zhì)子蔗糖共運轉(zhuǎn)”效應(yīng)，更加證實了乙烯刺激橡膠樹增產(chǎn)的機理[62]。此外，對乙烯刺激不同蛋白的表達模式可能表明了橡膠生物合成具有一定的離散功能。這些結(jié)果揭示乙烯對膠乳乳清蛋白組的影響及其在膠乳產(chǎn)量生產(chǎn)中的作用機制。乙烯作為天然橡膠的產(chǎn)量促進劑，可引起多種復(fù)雜的生化和生理變化，其中一些與碳水化合物代謝、植物應(yīng)激、防御相關(guān)反應(yīng)、細胞穩(wěn)態(tài)及橡膠生物合成均有關(guān)[63]。然而，為什么橡膠樹能高產(chǎn)膠乳及橡膠樹在近一個世紀如何被馴化等是產(chǎn)膠植物研究中長期懸而未決的重大科學(xué)問題，隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，闡明乙烯、茉莉酸和割膠增產(chǎn)的精確調(diào)控機制將會越發(fā)清晰。

3 ?其他產(chǎn)膠植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究

自然界中產(chǎn)膠植物有2500多種，雖然絕大多數(shù)產(chǎn)膠植物的膠乳中不含天然橡膠，但乳白色膠乳也有不少共性，很多植物膠乳中均含有天然橡膠類似組分或者前體物質(zhì)。橡膠草（Taraxacum kok-saghyz L. Rodin， TKS）和銀膠菊（Parthenium argentatum Grey）體內(nèi)的橡膠與巴西橡膠樹所含的天然橡膠結(jié)構(gòu)和性能類似[64]，這3種橡膠植物被稱為世界三大產(chǎn)膠植物。橡膠草根部可產(chǎn)生高質(zhì)量的天然橡膠，根部含膠量最高可達28%，是最有潛力替代橡膠樹生產(chǎn)天然橡膠的產(chǎn)膠植物[65]。2017年橡膠草基因組測序工作由中國科學(xué)家率先完成，基因組大小為1.29 Gb，預(yù)測含有46 000多個編碼蛋白的基因[66]。橡膠草基因組草圖的公布大大降低克隆橡膠生物合成的關(guān)鍵基因的難度，加速推進基于基因組信息的農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析。在蛋白組研究方面，2012年，Wahler等[67]通過橡膠草近親物種短角蒲公英（Taraxacum brevicorniculatum）的膠乳蛋白，首次報道蒲公英屬膠乳的凝膠圖譜，蛋白質(zhì)功能分類顯示，膠乳蛋白富含與脂質(zhì)代謝和運輸?shù)鞍纵^多，而參與應(yīng)激反應(yīng)的蛋白質(zhì)相對較少。2019年，Xie等[68]鑒定了橡膠草成熟根全蛋白，其中MVA和MEP途徑的蛋白幾乎全部鑒定，但每種蛋白的家族成員鑒定還不夠全面，有些蛋白在成熟期并未表達，還需外界刺激使蛋白產(chǎn)生作用。隨后，Benninghaus等[69]成功地建立了高質(zhì)量的橡膠草蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集，精確地區(qū)分不同營養(yǎng)階段根系和非根系生理過程，鑒定出乳膠中多種特異性蛋白，其中類脂蛋白類似的蛋白迄今為止尚未在植物中進行討論。研究結(jié)果有望作為在植物與環(huán)境相互作用過程中對乳膠進行有價值的前瞻性分析基礎(chǔ)，從而闡明整個植物乳膠的進化關(guān)系。橡膠草在很大程度上是未被馴化的，并且存在一些固有的問題，如自交不親和性，在發(fā)芽期間需穩(wěn)定水分含量，生長速度慢，與雜草之間的競爭力差，僅成熟時可測量有生產(chǎn)意義的橡膠含量，以及自身與蒲公英屬的其他成員高度雜合等缺點[70]。因此，橡膠草在成為商業(yè)上可行且具有競爭力的橡膠作物之前，還需通過分子育種和常規(guī)育種手段提高橡膠產(chǎn)量是必不可少的。早期橡膠草研究主要著眼于含膠量提取、品種篩選及田間試種等方面，在蛋白組研究方面剛剛起步，研究所涉及內(nèi)容較少。橡膠草基因組草圖的公布，將為橡膠草蛋白組研究的開展奠定基礎(chǔ)。

銀膠菊是一種多年生灌木，原產(chǎn)于墨西哥和德克薩斯州的奇瓦瓦沙漠，其橡膠中含有少量的結(jié)合蛋白質(zhì)[71]，只占橡膠樹天然橡膠中蛋白質(zhì)4%。銀膠菊膠乳RPs中結(jié)合蛋白不能與過敏原免疫球蛋白（Ig）E反應(yīng)[42]，所以橡膠制品不會引起過敏性反應(yīng)。銀膠菊橡膠與巴西橡膠樹的橡膠相比，具有高分子量、更高的彈性和柔軟度等優(yōu)勢。Madhavan等[72]測定了銀膠菊RPs中橡膠轉(zhuǎn)移酶活性。Pan等[73]對銀膠菊橡膠轉(zhuǎn)移酶進行序列分析，結(jié)果表明其為細胞色素P450 CYP74的家族成員，否定了該蛋白質(zhì)為膜結(jié)合橡膠轉(zhuǎn)移酶的觀點。然而銀膠菊在蛋白組研究方面還未真正系統(tǒng)展開。

杜仲也可產(chǎn)生高分子橡膠，但主要成分為反式-1，4-聚異戊二烯，與天然橡膠化學(xué)組成相同，互為同分異構(gòu)體[74]。杜仲也是我國比較常見的中藥藥材，具有降壓和強身健體的保健作用[75]。趙欣等[76]利用杜仲葉片干旱脅迫下的36個差異蛋白進行功能分析，結(jié)果顯示，杜仲葉片是通過調(diào)節(jié)可溶性糖含量、胞內(nèi)脯氨酸和降低胞內(nèi)滲透勢，從而減少水分損失的方式適應(yīng)干旱脅迫。杜仲在蛋白組研究方面涉及較少，還未真正展開。我國是杜仲資源主要生產(chǎn)國，全球99%杜仲種植在中國，具有資源壟斷式的優(yōu)勢[77]。因此，加快我國杜仲橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展，不僅可改變我國長期依賴進口天然橡膠的現(xiàn)狀，還為我國橡膠資源提供新的后備膠，從而形成以我國杜仲橡膠新興產(chǎn)業(yè)為引領(lǐng)的國際天然橡膠市場新格局。2020年，Cherian等[8]對含膠植物體內(nèi)天然橡膠的生物合成、橡膠轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、代謝工程的進展進行歸納[78]。在田間系統(tǒng)化種植橡膠替代植物研究方面也達到了生產(chǎn)規(guī)模的要求[79-81]，相比我國對橡膠草和銀膠菊的蛋白組學(xué)研究一直處于初步探索階段，目前作為替代產(chǎn)膠作物資源，在未來的輪胎市場上展現(xiàn)出巨大的潛力，正逐漸向商業(yè)化生產(chǎn)階段發(fā)展。

4 ?展望

目前在產(chǎn)膠植物蛋白組的研究中，主要聚焦于膠乳和橡膠粒子蛋白質(zhì)組的研究。然而，橡膠生物合成中涉及的每種蛋白質(zhì)，以及橡膠粒子膜上的生物發(fā)生和橡膠分子量決定因素的確切信息仍然是未知。由于CPT、SRPP、REF和HRBP被確定為橡膠轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的組分，所以天然橡膠生物合成機器的精確調(diào)控變得越來越清晰。為了揭示產(chǎn)膠機制，各組學(xué)將繼續(xù)成為尋找橡膠轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物不可缺少的有力工具，再利用CRISPR技術(shù)，在橡膠草和銀膠菊中確定基因編輯后植物的表型，可作為天然橡膠合成研究的模式植物深入研究，加速關(guān)鍵調(diào)控或催化基因的鑒定及高產(chǎn)量突變體的改進。另外，人造體外模擬功能性橡膠粒子的重建，將豐富我們對橡膠粒子生物發(fā)生和橡膠轉(zhuǎn)移酶組裝的認識，為非植物衍生天然橡膠的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)?？傊?，橡膠植物的蛋白質(zhì)組研究還處于起步快速發(fā)展階段，需不斷完善測定蛋白質(zhì)內(nèi)其他物質(zhì)的干擾因素，需提高橡膠膠乳蛋白質(zhì)中低豐度蛋白的鑒定，盡可能多維度測定消除高豐度蛋白質(zhì)的影響。雖然蛋白質(zhì)組研究還不夠成熟，許多技術(shù)仍需改進和發(fā)展，尤其是蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法不斷改進，但蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于產(chǎn)膠植物蛋白酶鑒定研究中會更廣泛，結(jié)合轉(zhuǎn)基因和基因編輯等技術(shù)，展開分子育種普及和深入研究，蛋白質(zhì)組用于產(chǎn)膠植物能夠促進我國橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展，對天然橡膠生物合成調(diào)控蛋白質(zhì)組研究具有深遠影響，今后蛋白質(zhì)組的應(yīng)用將促進我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)實現(xiàn)可持續(xù)的多元化健康快速發(fā)展。

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責任編輯：黃東杰