周曉瓊，饒凱瑞，陳宣欽

昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，昆明 650500

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)是衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，又名水莽草，斷腸草等，多分布于長江流域以南及西南地區(qū)。雷公藤始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦、辛，性寒，歸肝、腎二經(jīng)，具有祛風除濕、殺蟲解毒、消腫止痛和舒筋活絡的功效[1]。雷公藤作為一種常用中藥，多以根入藥，已開發(fā)成多種雷公藤制劑，如雷公藤多苷片，雷公藤片，雷公藤總萜片和雷公藤雙層片等[2]，這些雷公藤制劑主要用于免疫和炎性疾病的治療，如類風濕關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡和潰瘍性結(jié)腸炎等[3]。此外，現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)雷公藤還具有抗腫瘤活性，其在腫瘤治療中具有很好的應用前景。

至今為止，國內(nèi)外科研工作者已從雷公藤屬中分離鑒定了500多個化合物，主要為二萜，三萜和倍半萜，其中二萜類成分骨架類型多樣，包括松香烷型、海松烷型、對映貝殼杉烷型和其他類型。松香烷型三元環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物，如雷公藤甲素及其衍生物一直以來被認為是雷公藤二萜類成分中抗炎和抗腫瘤的主要活性成分[4]。然而，雷公藤甲素及其衍生物的含量低且多數(shù)具有較強的肝和腎毒性，這極大的限制了雷公藤的應用和開發(fā)。在雷公藤中，除雷公藤甲素及其衍生物外，是否存在其他低毒高效的抗炎和抗腫瘤活性二萜類成分，值得進一步研究。另一方面，有關(guān)雷公藤化學成分的研究主要集中在其主要藥用部位根中，對其莖的化學成分研究不夠深入，查閱文獻發(fā)現(xiàn)從雷公藤莖或者莖和葉的混合提取物中分離到的化合物目前共24個，其中二萜類化合物有9個。鑒于此，本研究采用各種色譜和波譜技術(shù)對雷公藤莖中的二萜類成分進行了系統(tǒng)的分離和鑒定，并對分離得到的化合物進行了體外抗炎和抗腫瘤活性評價。

1 材料與方法

1.1 藥材

干燥的雷公藤莖于2019年7月購自于昆明市新螺螄灣藥材市場，并由昆明理工大學陳宣欽副教授鑒定為雷公藤(Tripterygiumwilfordii)，憑證標本(KUMST20190716)存放于昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院資源藥物化學重點實驗室。

1.2 儀器與試劑

拌樣硅膠(80～100目)、柱色譜用硅膠(200～300目)、十八烷基硅膠(ODS-C18，75 μmol，日本YMC公司)和羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20，20～100 μmol，Pharmacia公司)；薄層色譜(TLC)用硅膠板(G和GF254，青島海洋化工廠)；色譜純試劑甲醇和乙腈(Fisher公司)；顯色劑5% H2SO4-EtOH溶液(噴灑后適當加熱)；胎牛血清(FBS，Hyclone公司)；基礎培養(yǎng)基(DMEM，Thermofisher公司)；二甲基亞砜(DMSO，Solarbio公司)；小鼠巨噬細胞RAW 264.7(中國科學院昆明動物研究所)和脂多糖(LPS，sigma公司)；Hela細胞株(中國科學院昆明動物研究所)；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Biosharp公司)；青鏈霉素混合液(Solarbio公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Solarbio公司)；一氧化氮合成酶抑制劑(L-NMMA，Beyo Time公司)。

Bruker DRX-500和Bruker AV Ⅲ-600核磁共振儀(德國，Bruker BioSpin Group)；UV1102Ⅱ紫外分光光度計(Betop Scientific)；高分辨質(zhì)譜儀(Agilent 6530 LC/MSD)；Jasco DIP-370數(shù)字偏振儀(日本，JASCO Corporation)；Agilent 1200高效液相色譜儀(Agilent公司)，配備ZORBAX SB-C18反相柱和二極管陣列檢測器(Agilent公司)；Spectra Max M2多功能讀板機(美國，Moleccular Devices 公司)和CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermofisher公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取與分離

雷公藤莖50 kg粉碎，采用95%乙醇浸泡提取3次，每次60 L，每次24 h，濃縮后，加適量水溶解，并依次用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次。

乙酸乙酯部位(672 g)經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，5∶1和2∶1)進行劃段，得到4個部分Fr.1～4。Fr.1(29 g)通過硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，50∶1、30∶1和20∶1)劃分為2個組分Fr.1.1～1.2。Fr.1.1(2.1 g)經(jīng)過ODS-C18反相中壓柱層析(甲醇∶水，70%→100%)分為2個組分Fr.1.1.1～1.1.2。Fr.1.1.1(90 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，11∶1)進行純化得到化合物4(10.7 mg)。Fr.1.2(18 g)經(jīng)過ODS-C18反相中壓柱層析(甲醇∶水，60%→100%)劃分為Fr.1.2.1～1.2.4共4個組分。Fr.1.2.1(4.09 g)通過硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，30∶1、20∶1和10∶1)得到Fr.1.2.1.1～1.2.1.4共4個組分，其中Fr.1.2.1.1(62.8 mg)經(jīng)過硅膠柱層析(石油醚∶二氯甲烷，1∶1)分離純化得到化合物2(34.3 mg)。Fr.1.2.1.2(45 mg)通過硅膠柱層析(石油醚∶二氯甲烷，1.5∶1和1∶1)分離純化得到化合物5(6.7 mg)。Fr.1.2.1.3(420.1 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶二氯甲烷，1.5∶1和1∶1)得到2個部分Fr.1.2.1.3.1～1.2.1.3.2。Fr.1.2.1.3.1(63 mg)經(jīng)過硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，10∶1)分離純化得化合物9(9.7 mg)。Fr.1.2.1.3.2(382.1 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶異丙醇，100∶1)分離純化得化合物11(58.8 mg)。Fr.1.2.1.4(54.9 mg)通過硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，12∶1)分離純化得化合物12(5.0 mg)。Fr.1.2.2(548.9 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶氯仿，1∶10；氯仿∶乙酸乙酯，40∶1和30∶1)洗脫得到化合物19(26.4 mg)。Fr.1.2.3(618.2 mg)采用硅膠柱層析(二氯甲烷∶乙酸乙酯，10∶1)得到化合物16(121.9 mg)。Fr.1.2.4(2.45 g)經(jīng)過硅膠柱層析(石油醚∶二氯甲烷，1∶1)洗脫得2個部分Fr.1.2.4.1～1.2.4.2。Fr.1.2.4.1(36.7 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶二氯甲烷，2∶1)得到化合物10(1.3 mg)。Fr.1.2.4.2(328.7 mg)經(jīng)過硅膠柱層析(石油醚∶丙酮，35∶1)得到化合物17(23 mg)和化合物18(28.3 mg)。

Fr.2(49.48 g)經(jīng)過ODS-C18反相中壓柱層析(甲醇∶水，60%→100%)得到3個組分Fr.2.1～2.3。Fr.2.1(4.6 g)采用硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，7∶1)洗脫得到2個組分Fr.2.1.1～2.1.2。Fr.2.1.1(288.8 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，7∶1)分離純化得化合物6(8.1 mg)和化合物7(12 mg)。Fr.2.1.2(943.8 mg)經(jīng)過Sephadex LH-20(氯仿∶甲醇，1∶1)分離得到化合物20(29 mg)和2個組分Fr.2.1.2.1～2.1.2.2。Fr.2.1.2.1(100 mg)通過半制備HPLC(乙腈∶水，28%，tR= 9.2 min)得到化合物8(2.2 mg)。Fr.2.1.2.2(400 mg)采用硅膠柱層析(二氯甲烷∶乙酸乙酯，80∶1)得到化合物13(4.8 mg)。Fr.2.2(8.2 g)經(jīng)過硅膠柱層析(二氯甲烷∶乙酸乙酯，120∶1和30∶1)分成2個部分 Fr.2.2.1～2.2.2。Fr.2.2.1(582.5 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶異丙醇，30∶1)分為2個部分Fr.2.2.1.1～2.2.1.2，其中Fr.2.2.1.1(124.2 mg)采用硅膠柱層析(石油醚∶二氯甲烷，1∶10)洗脫得到化合物1(2 mg)，F(xiàn)r.2.2.1.2(75 mg)采用硅膠柱層析(二氯甲烷∶乙酸乙酯，200∶1)分離純化得到化合物14(24 mg)和化合物15(22.4 mg)。Fr.2.2.2(449.9 mg)經(jīng)過硅膠柱層析(石油醚∶異丙醇，50∶1)劃分為 Fr.2.2.2.1～2.2.2.2共2個部分。Fr.2.2.2.2(107 mg)采用硅膠柱層析(二氯甲烷∶乙酸乙酯，200∶1)分離，得到化合物3(15 mg)。

1.3.2 抗炎活性和毒性篩選

1.3.2.1 巨噬細胞RAW 264.7的培養(yǎng)

RAW 264.7細胞使用DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗溶液)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行恒溫培養(yǎng)，每日觀察細胞生長的狀態(tài)，同時DMEM培養(yǎng)液需要定期進行替換，直到細胞生長良好，覆蓋率達90%以上對細胞進行傳代。

1.3.2.2 Griess試劑的配制

Griess Ⅰ液：在1.0 g無水對氨基苯磺酸中加入6 mL的磷酸和適量的超純水，進行水浴加熱使其全部溶解，再定容至100 mL，進行除雜除菌后，于4 ℃的條件貯存?zhèn)溆谩?/p>

Griess Ⅱ液：稱取0.1 g的N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽同上述方法配制。

1.3.2.3 Griees法檢測體外抗炎活性

把對數(shù)生長期的RAW 264.7細胞，按7×104濃度稀釋，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(每孔加入100 μL細胞懸液)，再置于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，把貼壁生長的細胞分別分為空白組、模型組(1 μg/mL脂多糖LPS)、實驗組(待測物+1 μg/mL LPS)和陽性對照組(一氧化氮合成酶抑制劑L-NMMA+1 μg/mL LPS)等4個組，每組設3個復孔。其中，待測物的濃度分別為12.5、6.25、3.125、1.56 和0.78 μmol/L；繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后，吸取各孔細胞的上層清液加入50 μL的Griess Ⅰ溶液并用搖床振搖10 min,之后再加入50 μL的Griess Ⅱ溶液并在避光條件下振搖10 min，最后用酶標儀檢測其在540 nm處的吸光值，使用IBM SPSS Statistics 20計算半數(shù)抑制濃度IC50值。

1.3.2.4 MTT法檢測細胞毒性

把濃度為7×104的RAW 264.7細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，再置于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用不同濃度(50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L)的待測物處理RAW 264.7細胞。用MTT法檢測化合物對RAW 264.7細胞的細胞毒性[5]。

1.3.2.5 MTT法檢測抗腫瘤活性

把對數(shù)生長期的Hela細胞以每孔1×105的密度接種于96孔板中，恒溫培養(yǎng)24 h后，以順鉑為陽性對照，以不同濃度50、25、12.5、6.25和3.12 μmol/L的樣品作為實驗組，作用48 h，用MTT比色法測定細胞存活率[6]。

2 實驗結(jié)果

從雷公藤莖中分離得到了20個二萜類化合物(見圖1)，包括1個新二萜和19個已知二萜。

圖1 化合物1～20的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of compounds 1～20

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖2 化合物1的1H-1H COSY 和 HMBC相關(guān)Fig.2 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

表1 化合物1的1H NMR(600 MHz，CDCl3)和13C NMR(150 MHz，CDCl3)譜數(shù)據(jù)

續(xù)表1

化合物2淡黃色油狀物；分子式C20H26O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.37(1H，s，H-12)，3.00(1H，m，H-15)，2.86(1H，m，H-2)，2.82(1H，m，H-7)，2.57(2H，m，H-1)，2.32(1H，m，H-7)，1.52(1H，m，H-6)，1.30(3H，s，H-20)，1.15(3H，s，H-19)，1.12(3H，s，H-18)，1.12(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.11(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：217.1(C-3)，187.7(C-14)，187.5(C-11)，153.2(C-13)，148.2(C-9)，142.8(C-8)，131.9(C-12)，50.8(C-5)，47.0(C-4)，37.5(C-10)，34.7(C-1)，33.9(C-2)，27.7(C-19)，26.4(C-15)，25.5(C-7)，21.4(C-17)，21.3(C-16)，20.7(C-18)，20.2(C-20)，18.6(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[8,9]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物2為雷藤二萜醌H。

化合物3黃色無定形粉末；分子式C20H26O4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.38(1H，d，J= 1.2 Hz，H-12)，4.06(1H，d，J= 11.4 Hz，H-19)，3.46(1H，m，H-19)，3.00(1H，m，H-15)，2.84(1H，m，H-1)，2.48(1H，ddd，J= 15.7，9.1，5.6 Hz，H-2)，2.29(1H，ddd，J= 20.0，11.8，6.6 Hz，H-7)，2.01(1H，dd，J= 13.0，2.2 Hz，H-5)，1.85(2H，m，H-1，H-6)，1.83(1H，m，H-1)，1.43(1H，m，H-6)，1.35(3H，s，H-18)，1.28(3H，s，H-20)，1.12(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.10(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：221.0(C-3)，187.6(C-14)，187.4(C-11)，153.4(C-13)，147.5(C-9)， 142.5(C-8)，131.9(C-12)，65.6(C-19)，51.6(C-5)，50.2(C-4)，37.1(C-10)，34.4(C-1)，34.2(C-2)，26.4(C-15)，25.5(C-7)，22.6(C-18)，21.4(C-17)，21.3(C-16)， 21.2(C-20)，17.8(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[10]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物3為triptoquinone B。

化合物4無色油狀物；分子式C20H28O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.87(1H，s，H-11)，6.63(1H，s，H-14)，3.13(1H，m，H-15)，1.27(3H，s，H-18)，1.25(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)，1.23(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.16(3H，s，H-19)，1.13(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：217.9(C-3)，151.1(C-12)，145.6(C-9)，132.3(C-13)，126.8(C-8)，126.6(C-14)，111.8(C-11)，50.5(C-5)，47.4(C-4)，37.5(C-1)，37.0(C-10)，34.6(C-2)，30.1(C-7)，26.9(C-18)，26.8(C-15)，24.6(C-20)，22.7(C-17)，22.5(C-16)，21.0(C-19)，20.4(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[11,12]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物4為hinokione。

化合物5無色油狀物；分子式C20H28O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.04(1H，d，J= 8.2 Hz，H-12)，6.85(1H，d，J= 8.2 Hz，H-11)，4.75(1H，s，14-OH)，3.13(1H，m，H-15)，2.92(1H，m，H-7)，2.61(1H，m，H-7)，2.56(1H，m，H-2)，2.48(1H，m，H-2)，1.93(1H，m，H-6)，1.91(1H，m，H-1)，1.88(1H，m，H-1)，1.80(1H，m，H-6)，1.33(3H，s，H-18)，1.25(3H，d，J= 6.8 Hz，H-17)，1.23(3H，d，J= 6.8 Hz，H-16)，1.17(3H，s，H-19)，1.14(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：217.3(C-3)，150.1(C-14)，146.4(C-9)，130.4(C-13)，123.6(C-12)，120.8(C-8)，117.3(C-11)，50.0(C-5)，47.4(C-4)，37.6(C-1)，37.1(C-10)，34.8(C-2)，26.9(C-15)，26.6(C-19)，24.7(C-7)，24.4(C-18)，22.8(C-17)，22.5(C-16)，21.2(C-20)，19.5(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[10]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物5為雷酚萜。

化合物6白色粉末；分子式C21H30O4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.30(1H，s，H-12)，4.40(1H，d，J= 11.4 Hz，H-19)，3.67(3H，s，H-21)，3.44(1H，d，J= 11.4 Hz，H-19)，3.24(1H，m，H-15)，3.08(1H，m，H-7)，3.08(1H，m，H-1)，2.77(1H，ddd，J= 15.1，11.2，6.7 Hz，H-2)，2.55(1H，m，H-7)，2.39(1H，m，H-2)，2.22(1H，dd，J= 12.9，12.0 Hz，H-5)，2.04(1H，m，H-1)，1.85(1H，m，H-6)，1.46(1H，m，H-6)，1.42(3H，s，H-18)，1.29(3H，s，H-20)，1.18(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.17(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：223.8(C-3)，150.5(C-11)，148.4(C-14)，139.7(C-13)，130.7(C-9)，130.6(C-8)，111.8(C-12)，66.1(C-19)，60.8(C-21)，52.6(C-5)，49.9(C-4)，37.6(C-10)，35.4(C-1)，34.6(C-2)，26.5(C-7)，26.1(C-15)，23.8(C-17)，23.8(C-16)，22.8(C-18)，21.1(C-20)，19.1(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)一致[13]，故鑒定化合物6為triptonediol。

化合物7黃色無定形粉末；分子式C20H28O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.04(1H，d，J= 8.2 Hz，H-12)，6.85(1H，d，J= 8.2 Hz，H-11)，4.08(1H，d，J= 11.3 Hz，H-19)，3.54(1H，d，J= 11.3 Hz，H-19)，3.11(1H，m，H-15)，2.92(1H，dd，J= 16.7，4.8 Hz，H-7)，2.70(1H，ddd，J= 16.1，9.1，4.5 Hz，H-2)，2.62(1H，dd，J= 16.8，8.1 Hz，H-2)，2.48(1H，ddd，J= 13.0，8.2，4.5 Hz，H-1)，2.10(1H，dd，J= 13.1，2.2 Hz，H-5)，2.02(1H，m，H-1)，1.97(1H，m，H-7)，1.70(1H，m，H-6)，1.35(3H，s，H-18)，1.28(3H，s，H-20)，1.25(3H，d，J= 6.8 Hz，H-16)，1.24(3H，d，J= 6.8 Hz，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：220.4(C-3)，150.0(C-14)，145.6(C-9)，130.4(C-13)，123.7(C-12)，120.7(C-8)，117.7(C-11)，65.7(C-19)，51.0(C-4)，50.7(C-5)，37.3(C-1)，36.8(C-10)，35.0(C-2)，26.9(C-15)，25.5(C-20)，24.8(C-7)，22.7(C-17)，22.5(C-16)，22.1(C-18)，19.0(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[10]報道的數(shù)據(jù)一致[14]，故鑒定化合物7為triptobenzene A。

化合物8淡黃色無定形粉末；分子式C21H30O4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.36(1H，s，H-11)，4.73(1H，s，14-OH)，4.07(1H，d，J= 11.3 Hz，H-19)，3.77(3H，s，H-21)，3.49(1H，s，H-19)，3.45(1H，m，H-15)，2.99(1H，s，19-OH)，2.80(1H，dd，J= 15.3，6.4 Hz，H-7)，2.71(1H，ddd，J= 16.0，9.3，4.6 Hz，H-2)，2.60(1H，dt，J= 16.1，8.1 Hz，H-2)，2.50(1H，m，H-7)，2.44(1H，ddd，J= 13.1，8.5，4.8 Hz，H-1)，2.11(1H，dd，J= 13.0，2.2 Hz，H-5)，2.06(1H，m，H-1)，1.96(1H，m，H-6)，1.68(1H，m，H-6)，1.35(3H，s，H-18)，1.32(3H，d，J= 7.2 Hz，H-16)，1.31(3H，d，J= 7.2 Hz，H-17)，1.29(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：220.4(C-3)，156.8(C-12)，151.5(C-14)，145.2(C-9)，119.2(C-13)，113.8(C-8)，100.8(C-11)，65.6(C-19)，55.7(C-21)，50.9(C-4)，50.8(C-5)，37.2(C-1)，37.0(C-10)，34.9(C-2)，25.4(C-20)，24.3(C-7)，24.3(C-15)，22.2(C-18)，20.9(C-16)，20.8(C-17)，19.1(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[15]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物8為wilforol F。

化合物9白色無定形粉末；分子式C20H30O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.03(1H，d，J= 8.2 Hz，H-12)，6.84(1H，d，J= 8.2 Hz，H-11)，3.15(1H，m，H-15)，2.85(1H，dd，J=16.5，6.5 Hz，H-7)，1.25(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.22(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)，1.20(3H，s，H-20)，1.07(3H，s，H-18)，0.90(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：150.2(C-14)，148.3(C-9)，130.2(C-13)，123.4(C-12)，120.6(C-8)，116.5(C-11)，78.7(C-3)，49.2(C-5)，38.9(C-4)，37.3(C-10)，37.1(C-1)，28.2(C-19)，28.0(C-2)，26.8(C-15)，24.9(C-20)，24.7(C-7)，22.8(C-17)，22.5(C-16)，18.2(C-6)，15.4(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[14]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物9為triptobenzene B。

化合物10白色粉末；分子式C20H30O。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.17(1H，d，J= 8.1 Hz，H-11)，7.00(1H，m，H-12)，6.90(1H，s，H-14)，3.30(1H，m，H-3)，2.95(1H，m，H-15)，2.79-2.89(2H，m，H-15/H-7)，1.23(3H，d，J= 7.3 Hz，H-17)，1.21(3H，d，J= 7.3 Hz，H-16)，1.19(3H，s，H-19)，1.07(3H，s，H-18)，0.89(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：146.8(C-9)，145.7(C-13)，134.7(C-8)，126.8(C-14)，124.4(C-11)，123.9(C-12)，78.8(C-3)，49.8(C-5)，39.0(C-4)，37.3(C-10)，36.9(C-1)，33.4(C-15)，30.7(C-7)，28.2(C-18)，28.0(C-2)，24.9(C-20)，24.0(C-17)，24.0(C-16)，18.9(C-6)，15.4(C-19)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[16]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物10為abietatrien-3β-ol。

化合物11黃色油狀物；分子式C20H26O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.54(1H，s，H-12)，3.66(3H， s，H-21)，3.29(1H，s，H-15)，3.24(1H，m，H-7)，3.20(1H，m，H-1)，2.96(1H，m，H-6)，2.70(1H，m，H-2)，2.49(1H，m，H-7)，2.46(1H，m，H-2)，2.28(1H，m，H-6)，1.89(3H，s，H-18)，1.84(1H，m，H-1)，1.70(3H，s，H-20)，1.18(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)，1.16(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：200.4(C-3)，166.1(C-5)，151.4(C-11)，147.7(C-14)，139.7(C-13)，130.9(C-8)，129.1(C-9)，126.7(C-4)，112.6(C-12)，61.1(C-21)，40.7(C-10)，34.2(C-2)，32.1(C-1)，26.7(C-6)，26.2(C-15)，25.4(C-7)，23.9(C-17)，23.6(C-16)，22.3(C-20)，10.8(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[17]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物11為triptobenzene S。

化合物12黃色無定形粉末；分子式C20H24O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.13(1H，d，J= 10.0 Hz，H-7)，6.53(1H，s，H-12)，6.53(1H，d，J= 10.0 Hz，H-6)，3.83(3H，s，H-20)，2.72(1H，m，H-1)，2.64(1H，m，H-1)，2.56(1H，m，H-2)，2.24(1H，m，H-2)，1.90(3H，s，H-18)，1.39(3H，s，H-19)，1.35(3H，d，J= 7.2 Hz，H-16)，1.35(3H，d，J= 7.2 Hz，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：197.5(C-3)，158.9(C-11)，156.6(C-5)，151.1(C-14)，145.3(C-9)，128.7(C-4)，126.6(C-7)，120.1(C-6)，119.2(C-13)，112.8(C-8)，100.1(C-12)，55.6(C-20)，39.2(C-10)，33.9(C-1)，33.3(C-2)，29.9(C-19)，24.3(C-15)，20.9(C-16)，20.9(C-17)，10.5(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[7]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物12為hypoglicin B。

化合物13黃色無定形粉末；分子式C20H26O5。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：12.78(1H，s，14-OH)，6.85(1H，s，H-12)，5.04(1H，s，11-OH)，4.07(1H，d，J= 11.3 Hz，H-19)，3.53(1H，d，J= 11.3 Hz，H-19)，3.32(1H，m，H-15)，3.32(1H，m，H-1)，3.12(1H，s，19-OH)，2.76(1H，m，H-2)，2.73(1H，m，H-6)，2.65(1H，d，J= 2.5 Hz，H-5)，2.64(1H，d，J= 2.5 Hz，H-6)，2.54(1H，ddd，J= 15.6，8.7，6.7 Hz，H-2)，2.07(1H，ddd，J= 14.1，9.7，6.7 Hz，H-1)，1.42(3H，s，H-20)，1.35(3H，s，H-18)，1.20(3H，d，J= 6.6 Hz，H-16)，1.29(3H，d，J= 6.6 Hz，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：219.4(C-3)，204.4(C-7)，155.2(C-14)，144.7(C-11)，136.6(C-13)，133.0(C-9)，123.8(C-12)，114.8(C-8)，65.6(C-19)，50.2(C-4)，49.3(C-5)，38.2(C-10)，35.5(C-6)，35.1(C-1)，34.8(C-2)，26.0(C-15)，22.6(C-18)，22.3(C-17)，22.1(C-16)，18.3(C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[18]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物13為triregelin H。

化合物14黃色油狀物；分子式C20H24O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.08(1H，d，J= 8.2 Hz，H-12)，6.96(1H，d，J= 8.2 Hz，H-11)，4.89(1H，d，J= 3.4 Hz，14-OH)，4.84(1H，m，H-19)，4.77(1H，m，H-19)，3.12(1H，m，H-15)，2.92(1H，dd，J= 17.3，7.3 Hz，H-7)，2.82(1H，m，H-7)，2.51(2H，m，H-2)，2.00(2H，m，H-6)，1.70(2H，m，H-1)，1.28(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.26(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)，1.03(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：174.4(C-18)，163.0(C-4)，150.8(C-14)，143.8(C-8)，131.0(C-9)，125.1(C-13)，123.4(C-12)，120.6(C-3)，116.3(C-11)，70.6(C-19)，40.8(C-15)，36.2(C-10)，32.6(C-1)，26.9(C-5)，22.8(C-17)，22.6(C-6)，22.54(C-16)，22.46(C-20)，19.7(C-2)，18.2(C-7)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[19,20]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物14為雷酚內(nèi)酯。

化合物15黃色油狀物；分子式C21H26O4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.48(1H，s，H-12)，4.80(2H，m，H-19)，3.69(3H，s，H-21)，3.08(1H，m，H-15)，2.40(2H，m，H-2)，1.82(2H，m，H-1)，1.18(6H，d，J= 6.9 Hz，H-16/H-17)，1.16(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：174.6(C-18)，163.4(C-4)，150.8(C-14)，149.1(C-11)，139.9(C-13)，130.8(C-9)，129.2(C-8)，125.2(C-3)，111.9(C-12)，70.7(C-19)，60.7(C-21)，44.0(C-15)，37.2(C-10)，31.0(C-1)，26.0(C-5)，25.5(C-2)，23.8(C-17)，23.8(C-16)，19.5(C-6)，18.6(C-7)，17.3(C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物15為雷酚新內(nèi)酯。

化合物16無色油狀物；分子式C21H34O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：4.40(1H，dd，J= 11.1，2.7 Hz，H-20)，4.14(1H，s，H-19)，3.35(1H，d，J= 12.4 Hz，H-20)，3.32(3H，s，H-21)，2.24(1H，m，H-2)，2.17(1H，m，H-5)，1.87(1H，m，H-1)，1.82(1H，m，H-6)，1.73(1H，m，H-13)，1.66(1H，m，H-14)，1.37(3H，s，H-17)，0.86(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：105.9(C-19)，79.4(C-16)，62.5(C-20)，57.6(C-15)，55.0(C-21)，52.5(C-9)，49.2(C-5)，48.2(C-13)，44.9(C-8)，40.6(C-1)，40.4(C-7)，40.35(C-3)，39.0(C-10)，38.5(C-14)，36.7(C-4)，26.8(C-12)，24.5(C-17)，23.3(C-18)，22.4(C-2)，22.1(C-6)，18.0(C-11)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物16為16α-hydroxy-19,20-epoxy-19R*-methoxy-kaurane。

化合物17無色油狀物；分子式C22H36O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.21(1H，s，H-20)，3.97(1H，m，H-21)，3.62(1H，dd，J= 11.3，2.7 Hz，H-19)，3.49(1H，dd，J= 11.3，1.7 Hz，H-19)，3.40(1H，m，H-21)，2.52(1H，m，H-1)，2.36(1H，m，H-2)，1.99(1H，m，H-11)，1.82(1H，s，H-13)，1.38(3H，s，H-17)，1.22(3H，t，J= 7.1 Hz，H-22)，1.07(1H，m，H-5)，0.68(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：101.7(C-20)，79.5(C-16)，71.7(C-19)，64.1(C-21)，58.0(C-15)，54.2(C-9)，52.1(C-5)，49.0(C-13)，44.9(C-8)，41.7(C-10)，41.2(C-3)，40.6(C-7)，38.7(C-14)，35.7(C-1)，33.3(C-4)，25.6(C-12)，24.4(C-17)，23.3(C-18)，22.4(C-2)，19.8(C-6)，18.6(C-11)，15.1(C-22)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[22]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物17為16α-hydroxy-19,20-epoxy-20R*-ethoxy-kaurane。

化合物18白色粉末；分子式C22H36O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：4.43(1H，dd，J= 11.0，2.8 Hz，H-20)，4.25(1H，s，H-19)，3.71(1H，m，H-21)，3.36(1H，m，H-21)，3.32(1H，d，J= 10.7 Hz，H-20)，2.24(1H，m，H-2)，2.16(1H，m，H-1)，1.94(1H，m，H-6)，1.81(1H，m，H-13)，1.37(3H，s，H-17)，1.20(3H，t，J= 7.1 Hz，H-22)，0.85(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：104.2(C-19)，79.5(C-16)，62.7 (C-21)，62.6(C-20)，57.6(C-15)，52.5(C-9)，49.2(C-5)，48.3(C-13)，45.0(C-8)，40.7(C-1)，40.4(C-3)，40.40(C-7)，39.0(C-10)，38.4(C-14)，36.6(C-4)，26.8(C-12)，24.4(C-17)，23.4(C-18)，22.5(C-2)，22.0(C-6)，18.1(C-11)，15.4(C-22)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[22]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物18為16α-hydroxy-19,20-epoxy-19R*-ethoxy-kaurane。

化合物19無色油狀物；分子式C20H32O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：10.41(1H，s，H-20)，2.61(1H，d，J= 12.7 Hz，H-1)，1.34(3H，s，H-17)，0.92(3H，s，H-18)，0.76(3H，s，H-19)，0.58(1H，t，J= 13.0 Hz，H-1)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：208.0(C-20)，79.6(C-16)，58.5(C-9)，56.0(C-15)，55.5(C-5)，54.1(C-10)，48.7(C-13)，45.0(C-8)，41.6(C-3)，41.0(C-14)，40.1(C-7)，34.7(C-1)，33.6(C-4)，31.9(C-18)，24.4(C-12)，24.0(C-17)，20.7(C-19)，19.7(C-6)，19.1(C-2)，17.6(C-11)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[23]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物19為fischericin D。

化合物20白色無定形粉末；分子式C20H32O。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.71(1H，dd，J= 17.4，10.4 Hz，H-15)，5.13(1H，s，H-14)，4.95(1H，dd，J= 10.4，2.0 Hz，H-16)，4.90(1H，dd，J= 17.3，2.0 Hz，H-16)，3.83(1H，d，J= 10.8 Hz，H-19)，3.43(1H，d，J= 10.8 Hz，H-19)，2.32(1H，ddd，J= 14.3，4.6，2.1 Hz，H-7)，0.99(6H，s，H-17/H-18)，0.70(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：147.3(C-15)，138.1(C-8)，128.0(C-14)，112.8(C-16)，65.2(C-19)，55.7(C-5)，51.4(C-9)，39.1(C-1)，38.6(C-13)，38.5(C-10)，38.3(C-4)，36.1(C-7)，35.7(C-12)，35.3(C-3)，29.4(C-17)，27.0(C-18)，22.4(C-6)，19.2(C-11)，18.6(C-2)，15.8(C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[24]報道的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物20為ent-pimara-8(14),15-diene-19-ol。

2.2 抗炎活性評價

采用LPS誘導小鼠單核巨噬細胞的體外炎癥模型，以L-NMMA作為陽性對照，對從雷公藤中分離得到的20個單體化合物進行體外抗炎活性研究，結(jié)果表明化合物2、3和20對LPS誘導NO的產(chǎn)生有顯著的抑制作用，IC50分別為2.01、1.70和1.77 μmol/L，活性遠強于L-NMMA(IC50= 24.89 μmol/L，表2)，其他化合物IC50值大于50，沒有顯示出明顯的抗炎活性。

表2 化合物2、3和20的體外抗炎活性

2.3 抗腫瘤活性評價

采用MTT法評價了化合物1～20對Hela細胞增殖的影響，結(jié)果表明只有化合物11具微弱的抗腫瘤活性，IC50值為18.41 μmol/L，其他化合物沒有明顯的活性(IC50>40 μmol/L)。

3 討論與結(jié)論

本實驗從雷公藤莖的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相中分離鑒定了20個二萜類化合物，骨架類型包括二萜醌類、松香烷型、海松烷型和對映貝殼杉烷型，其中1為新的二萜醌類化合物，化合物10、19和20為首次從雷公藤中分離得到，在以往的研究基礎上，進一步豐富了雷公藤化學成分的研究內(nèi)容。我們并沒有分離得到具有三元環(huán)氧結(jié)構(gòu)的松香烷型二萜內(nèi)酯，可能是因為這類化合物主要分布在根部，其在莖中含量較低的緣故。對化合物1～20進行了體外抗炎活性和抗腫瘤活性篩選，化合物2、3和20具有顯著的抗炎活性。2為C環(huán)具有對醌結(jié)構(gòu)的松香烷型二萜，C環(huán)的對醌結(jié)構(gòu)可能是松香烷型二萜抗炎的關(guān)鍵活性基團。前人的研究表明具有三元環(huán)氧結(jié)構(gòu)的松香烷型二萜內(nèi)酯(雷公藤甲素及其衍生物)是雷公藤中二萜類成分抗炎的主要活性成分，而本研究表明，除雷公藤甲素及其衍生物外，具有C環(huán)對醌結(jié)構(gòu)的松香烷型二萜可能也是雷公藤二萜類抗炎的活性成分之一[25]。本研究的發(fā)現(xiàn)為我們對雷公藤抗炎物質(zhì)基礎的認識提供了新線索，也為以松香烷型二萜作為抗炎先導化合物的結(jié)構(gòu)改造提供了思路。此外，所有的化合物均沒有顯示顯著的抗腫瘤活性，與文獻報道一致，具有三元環(huán)氧結(jié)構(gòu)的松香烷型二萜內(nèi)酯可能才是雷公藤抗腫瘤的關(guān)鍵活性成分[4]。