石崯力，王 旭，盛 沛，張 擎，梁 婕

南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210029

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由遺傳和環(huán)境多重因素造成胰島素分泌或生物作用缺陷，臨床以慢性高血糖為特征的一組代謝性疾病。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)近三分之一DM患者合并不同程度的認(rèn)知功能障礙[1]，多表現(xiàn)出健忘、學(xué)習(xí)及記憶能力減退、認(rèn)知缺失等癥狀，嚴(yán)重者病情可進(jìn)展至不可逆性癡呆。中醫(yī)將糖尿病認(rèn)知功能障礙(diabetic cognitive dysfunction，DCD)歸于“消渴”“呆病”范疇，認(rèn)為該病多由年邁腎虛、情志所傷、飲食失調(diào)、久病耗損等內(nèi)外病因綜合影響所致[2]。近年來運(yùn)用中藥治療DCD的研究逐漸增加，積累大量臨床數(shù)據(jù)，將其規(guī)范、總結(jié)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的大方向。通過對治療DCD的中醫(yī)處方進(jìn)行探尋,挖掘潛在配伍藥物組合并提煉用藥規(guī)律，為今后臨床選方用藥提供借鑒。本研究基于對文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,通過數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)、聚類和因子分析，研究其用藥規(guī)律，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對核心組方治療DCD的有效活性成分和潛在靶點(diǎn)進(jìn)行初步預(yù)測，篩選出相關(guān)生物學(xué)功能相關(guān)通路，對核心組方治療DCD的復(fù)雜作用機(jī)制進(jìn)行初步探究，為科研和臨床提供新思路和可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)來源與檢索策略

以(主題=糖尿病認(rèn)知功能障礙or主題=糖尿病認(rèn)知障礙or主題=糖尿病腦病)and(關(guān)鍵詞=中醫(yī)or關(guān)鍵詞=中醫(yī)藥)匹配，檢索中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)(WF)、維普期刊全文數(shù)據(jù)庫(VIP)、生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(CBM)、及中國科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(CSCD)自1999年1月至2020年10月收載的文獻(xiàn)。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

采用以下納入標(biāo)準(zhǔn)對文獻(xiàn)進(jìn)行篩選：(1)治療DCD的公開發(fā)表的中醫(yī)臨床研究文獻(xiàn)，包括證治探討、名家經(jīng)驗(yàn)和臨床觀察等，DCD的診斷應(yīng)符合國內(nèi)外公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)[3,4]；(2)研究對象未合并其他病癥；(3)文獻(xiàn)所報(bào)道的中藥復(fù)方、中成藥資料完整；(4)中藥在對照實(shí)驗(yàn)研究中具有顯著明確的臨床療效；(5)作者使用同一觀點(diǎn)重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)只取一篇。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

采用以下排除標(biāo)準(zhǔn)對已納入的文獻(xiàn)進(jìn)行進(jìn)一步篩選：(1)綜述類、動物實(shí)驗(yàn)、源于會議、科普類文獻(xiàn)；(2)采用針灸、推拿、食療、護(hù)理等非中醫(yī)處方治療或中西醫(yī)結(jié)合治療DCD的文獻(xiàn)；(3)非糖尿病所引起的認(rèn)知功能障礙的文獻(xiàn)。

1.2 中藥材數(shù)據(jù)的規(guī)范化

參照全國高等中醫(yī)藥院?！笆濉币?guī)劃教材《中藥學(xué)》[5]將表達(dá)相同的中藥進(jìn)行歸類處理，并將中藥別名或俗稱予以規(guī)范。如將“丹皮”“牡丹皮”統(tǒng)一為“牡丹皮”，“生地”“生地黃”統(tǒng)一為“生地黃”，“法半夏”“半夏”統(tǒng)一為“半夏”等。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)排除篩選后將納入的文獻(xiàn)內(nèi)中藥處方及中藥材逐一輸入至Microsoft Excel 2019，進(jìn)行排序、校對和整理，建立中藥治療DCD數(shù)據(jù)庫。運(yùn)用IBM SPSS Modeler 18.0、SPSS Statistics 25.0軟件對高頻中藥進(jìn)行因子、聚類分析以及關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)圖的制作。

1.4 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行作用機(jī)制分析

1.4.1 核心組方化合物的篩選和預(yù)測

運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索核心組方化學(xué)成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug like，DL)≥0.18為閾值條件[6]進(jìn)行初步篩選，納入中藥有效活性成分，建立中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)集。通過SuperPred數(shù)據(jù)庫(http://prediction.charite.de/)對篩選出的化合物進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測[7]，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)，將種屬設(shè)置為“homo sapiens”，對去重后的有效靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范化。

1.4.2 DCD疾病靶點(diǎn)的預(yù)測

以“diabetic cognitive dysfunction”“diabetic encephalopathy”等為關(guān)鍵詞，通過OMIM(http://www.omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、Genecards(https://www.genecards.org/)、PharmGkb(http://www.pharmgkb.org/)和Drugbank數(shù)據(jù)庫(http://www.drugbank.ca/)獲取DCD潛在疾病靶點(diǎn)并建立疾病信息數(shù)據(jù)集[8]。

1.4.3 核心組方藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選出的有效化合物、其潛在的靶點(diǎn)蛋白和疾病的導(dǎo)入至Cytoscape 3.8.0軟件(http://www.cytoscape.org/)構(gòu)建“核心組方藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”共有機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，并使用Network Analyzer功能對核心組方中的有效成分進(jìn)行分析。

1.4.4 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Stitch和String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)分別構(gòu)建核心組方潛在靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，選擇種屬為“homo sapiens”，篩選條件為“minimum required interaction score>0.7”，將得到的蛋白質(zhì)互作關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)相互作用 PPI網(wǎng)絡(luò)[9]，并通過CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯跃W(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)點(diǎn)度中心性(degree centrality，DC)、中介中心性(betweenness centrality，BC)和接近中心性(closeness centrality，CC)均大于中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選發(fā)揮藥效的主要活性成分以及核心靶點(diǎn)[10]。

1.4.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的代謝通路與生物過程分析

將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)[11]，將“gene list”及“background”設(shè)置為“homo sapiens”。運(yùn)用R Studio軟件下載“ggplot2”擴(kuò)展包[12]，設(shè)定閾值P< 0.01，F(xiàn)DR < 0.01，進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析；下載“dplyr”和“org.Hs.eg.db”安裝包，以閾值P< 0.01、FDR < 0.01進(jìn)行關(guān)鍵基因基因本體(GO)功能分析，最終以條形圖和氣泡圖的形式輸出結(jié)果。

1.4.6 分子對接驗(yàn)證

通過分子對接技術(shù)對核心組方內(nèi)的關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的互作關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的探究。研究表明[13]，二甲雙胍(metformin)作為經(jīng)典的降糖藥物，能一定程度改善糖尿病患者認(rèn)知障礙，因此以其作為陽性對照藥物。具體步驟為：通過Pubchem網(wǎng)站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索獲取關(guān)鍵成分的3D結(jié)構(gòu)，下載SDF文件并利用Open Babel 2.3.2軟件將SDF文件轉(zhuǎn)化為PDB文件，從Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb)數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵靶點(diǎn)的受體蛋白，利用AutoDockTools軟件對受體蛋白進(jìn)行去水、去配體、加氫、平衡電荷等修飾，用Grid程序下的Grid Box命令打開Grid Option工具對每個(gè)受體蛋白進(jìn)行處理，利用AutoDock Vina 1.1.2對受體蛋白與配體小分子分別進(jìn)行分子對接。分子對接的結(jié)果以一種結(jié)合能(affinity)的形式輸出，是衡量配體是否能與受體分子有效結(jié)合的重要指標(biāo)，一般認(rèn)為對接得分小于-4.25 kcal/mol可認(rèn)為配體與靶點(diǎn)之間具有結(jié)合活性，得分小于-5.0 kcal/mol則認(rèn)為結(jié)合活性較佳，得分小于-7.0 kcal/mol則認(rèn)為兩者之間有強(qiáng)烈的對接活性。

2 數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果

2.1 治療DCD的中藥使用頻次統(tǒng)計(jì)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)排除篩選，共納入符合的文獻(xiàn)33篇，涉及中藥加減處方共123首，中藥共137味，總使用頻數(shù)為1 381次，使用中藥頻次最高的前十位依次是：當(dāng)歸、熟地黃、甘草、川芎、茯苓、枸杞子、桃仁、黃芪、石菖蒲和白芍，并對中藥在中藥組方中出現(xiàn)的頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用頻數(shù)大于25次的中藥共20味(見表1)。

表1 治療糖尿病認(rèn)知功能障礙的處方頻數(shù)大于25次的中藥材統(tǒng)計(jì)

續(xù)表1

2.2 治療DCD的中藥關(guān)聯(lián)分析

通過 SPSS Modeler 18.0軟件應(yīng)用apriori算法對使用頻數(shù)大于25次的20味高頻中藥進(jìn)行建模，以查找各中藥間的相關(guān)性與因果關(guān)系。設(shè)置關(guān)聯(lián)參數(shù)：最小支持度大于20%,最小置信度大于80%，支持度提示藥對或藥物組合同時(shí)出現(xiàn)的頻率，置信度則提示當(dāng)藥物組合前項(xiàng)出現(xiàn)時(shí)，后項(xiàng)藥物出現(xiàn)的概率。結(jié)果得到桃仁-紅花、川芎-紅花、當(dāng)歸-桃仁-川芎、川芎-紅花-桃仁、熟地黃-菟絲子-枸杞子等核心藥物組合共26組(見表2)。

表2 糖尿病認(rèn)知功能障礙處方高頻中藥關(guān)聯(lián)分析

2.3 治療DCD的中藥聚類分析

使用SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對使用頻數(shù)大于25次的20味高頻中藥進(jìn)行聚類分析。采用組間連接的系統(tǒng)聚類算法，運(yùn)算后可得到6類，即為DCD的核心配伍藥物組合用于臨證加減(見圖1)。分別是：(1)桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎；(2)枸杞子、菟絲子、熟地黃；(3)甘草、白芍、丹參；(4)石菖蒲、遠(yuǎn)志、黃芪；(5)半夏、白術(shù)、茯苓；(6)山藥、山茱萸、五味子、麥冬。

圖1 糖尿病認(rèn)知功能障礙處方中藥聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis of diabetes cognitive dysfunction prescription注：右側(cè)中藥材由上至下的順序?yàn)椋禾胰?、紅花、川芎、當(dāng)歸、枸杞子、菟絲子、熟地黃、甘草、白芍、丹參、石菖蒲、遠(yuǎn)志、黃芪、半夏、白術(shù)、茯苓、山藥、山茱萸、五味子、麥冬。以下圖中數(shù)字對應(yīng)的中藥材與圖1相一致。Note:The order of Chinese herbal medicines from top to bottom is:Persicae Semen;Carthami Flos;Chuanxiong Rhizoma;Angelicae Sinensis Radix;Lycii Fructus;Cuscutae Semen;Rehmanniae Radix Praeparata;Glycyrrhizae Radix et Rhizoma;Paeoniae Radix Alba;Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma;Acori Tataninowii Rhizoma;Polygalae Radix;Astragali Radix;Pinelliae Rhizoma;Atractylodis Macrocephalae Rhizoma;Poria;Dioscoreae Rhizoma;Corni Fructus;Schisandrae Chinensis Fructus;Ophiopogonis Radix.The Chinese herbal medicines corresponding to the numbers in the figures below are the same as those in figure 1.

2.4 治療DCD的中藥因子分析

為了探尋高頻中藥間潛在的結(jié)構(gòu)關(guān)系，運(yùn)用SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對高頻中藥進(jìn)行因子分析，通過KMO檢驗(yàn)和Bartlet球形檢驗(yàn)比較變量間相關(guān)系數(shù)的差異，結(jié)果顯示抽樣適合性檢驗(yàn)KMO=0.600，Bartlet球形檢驗(yàn)P=0.000，差異具有顯著性P<0.05，認(rèn)為變量間存在較強(qiáng)的依賴性，符合因子分析標(biāo)準(zhǔn)。采用主成分分析法，設(shè)置提取初始特征值大于1，可提取公因子數(shù)為8個(gè)，累計(jì)貢獻(xiàn)率為78.53%。設(shè)置最小載荷量為0.5，得出桃仁(0.896)、紅花(0.861)、川芎(0.841)、當(dāng)歸(0.645)在成分F1上載荷量較高；在成分F2上載荷量前四位為熟地黃(0.755)、枸杞子(0.801)、菟絲子(0.842)、半夏(0.513)；五味子(0.701)和麥冬(0.869)在成分F3上載荷量較高；在成分F4上載荷量較高的中藥為山藥(0.843)、山茱萸(0.876)；在成分F5上載荷量較高的中藥為石菖蒲(0.856)、遠(yuǎn)志(0.540)和白芍(0.682)；在成分F6上載荷量最高的前三位分別是甘草(0.808)、茯苓(0.565)和白術(shù)(0.576)；在成分F7-8上載荷最高分別為黃芪(0.815)和丹參(0.904)，由此將各成分上載荷量較高的中藥提煉為公因子(見表3)。通過kaiser標(biāo)準(zhǔn)化的全體旋轉(zhuǎn)法得到旋轉(zhuǎn)因子載荷圖(見圖2)。

表3 公因子信息表

圖2 糖尿病認(rèn)知功能障礙中藥處方旋轉(zhuǎn)因子載荷圖Fig.2 Rotational load diagram for prescription factor analysis of diabetic cognitive dysfunction

3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

3.1 核心組方化學(xué)成分篩選

根據(jù)關(guān)聯(lián)、聚類和因子分析，綜合得到“當(dāng)歸、桃仁、紅花、川芎、熟地黃、枸杞子、菟絲子、石菖蒲、白芍”9味中藥組成的核心組方。從TCMSP數(shù)據(jù)庫中根據(jù)OB、DL值篩選核心組方的潛在活性化學(xué)成分共109個(gè)(見表4)。

表4 核心組方中109個(gè)候選化合物的基本信息

續(xù)表4(Continued Tab.4)

續(xù)表4(Continued Tab.4)

3.2 DCD疾病靶點(diǎn)篩選

通過OMIM、TTD、PharmGkb和Drugbank數(shù)據(jù)庫分別收集DCD相關(guān)靶點(diǎn)基因590、282、44、61個(gè)，通過Genecards數(shù)據(jù)庫獲得“diabetic cognitive dysfunction”為關(guān)鍵詞的靶點(diǎn)5 236個(gè)、“diabetic encephalopathy”為關(guān)鍵詞的靶點(diǎn)2 556個(gè)，將二者靶點(diǎn)合并后去重；relevance score代表靶點(diǎn)與疾病的密切程度，根據(jù)其由高到低排序，取前1 000個(gè)作為DCD的潛在靶點(diǎn)；經(jīng)去重后共收集到1 490個(gè)DCD疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

3.3 “核心組方藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”共有網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將上述的經(jīng)剔除無對應(yīng)靶點(diǎn)的核心組方有效化學(xué)成分、重復(fù)靶點(diǎn)和疾病的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入至Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建“核心組方藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，其包含了349個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 723條關(guān)系(見圖3)。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的大小與度值呈正比關(guān)系，其中度值(degree)排在前三位的化合物為槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)和β-谷甾醇(β-sitosterol)。

圖3 “核心組方藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”共有網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Common network of "core prescription drugs-active ingredients-targets-disease"注：藍(lán)色表示疾病靶點(diǎn)；紅色表示核心組方中藥物名稱；綠色表示核心組方有效成分；棕色表示共有化合物成分。Note:The blue section represents the disease target;The red portion represents the core prescription drug;The green portion represents the active ingredient;The brown portion represents a common compound ingredient.

3.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

利用Stitch和String數(shù)據(jù)庫分別獲得核心組方和疾病潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)；通過Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行合并，去除19個(gè)單獨(dú)的靶點(diǎn)GABRA2、GABRA5、PLAT、PSMD3、NR3C2、ECE1、GABRA1、G6PD、THBD、CHRNA7、MGAM、DPP4、SCN5A、ADRA2A、ACHE、NR1I3、PTGS1、RXRA、PPP3CA后獲得核心組方治療DCD相關(guān)潛在作用靶點(diǎn)76個(gè)。運(yùn)用Cytoscape軟件中CytoNCA插件通過對中心網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選最終得到24個(gè)核心靶點(diǎn)(見圖4)，其中degree值排名前3位的靶點(diǎn)依次為：TP53、IL6、FOS，由此推測其是作為核心藥物治療DCD中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，將用于后續(xù)的分子對接驗(yàn)證。

3.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的代謝通路與生物過程分析

3.5.1 藥物-疾病核心靶點(diǎn)GO分析

將獲得的核心組方治療DCD交互的潛在靶點(diǎn)利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析，結(jié)果可獲得237條GO富集功能，其中生物過程(biological process，BP)相關(guān)的條目最多，共183條，23條細(xì)胞組成(cellular component，CC)和31條分子生物學(xué)功能(molecular function，MF)。以P<0.01，F(xiàn)DR<0.01為篩選條件選取GO條目，其涉及調(diào)控糖脂代謝、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化、蛋白酶結(jié)合、血管生成等生物學(xué)過程。運(yùn)用R Studio軟件下的“dplyr”“org.Hs.eg.db”和“ggplot2”擴(kuò)展包對上述的分析結(jié)果前20條進(jìn)行可視化處理(見圖5)。

圖4 核心組方治療DCD靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 The core prescription drugs PPI network for the treatment of DCD targets

圖5 核心組方治療DCD潛在核心靶點(diǎn)的GO功能分析(前20位)Fig.5 GO function analysis of core prescription drugs for treating DCD potential core targets (Top 20)

3.5.2 藥物-疾病KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對核心組方治療DCD交互的核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，共獲得96條富集通路，以P<0.01，F(xiàn)DR<0.01為篩選條件選取共66條KEGG條目。分析結(jié)果提示核心靶點(diǎn)與TNF信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、FoxO信號通路、HIF-1信號通路、鞘脂信號通路、VEGF信號通路和胰島素信號通路等有關(guān)，與此同時(shí)還發(fā)現(xiàn)核心靶點(diǎn)與多種癌癥、病毒感染性疾病、寄生蟲病等存在聯(lián)系。運(yùn)用R Studio軟件對篩選后的前30條KEGG通路結(jié)果進(jìn)行可視化處理(見圖5)。

圖6 核心組方治療DCD潛在核心靶點(diǎn)的KEGG富集功能分析(前30位)Fig.6 KEGG enrichment function analysis of core prescription drugs for treating DCD potential core targets (Top 30)

3.6 分子對接驗(yàn)證

通過對核心組方中主要活性成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，結(jié)果顯示，配體小分子均穩(wěn)定地位于對接口袋內(nèi)(見表5)。與二甲雙胍相比，核心組方的主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間對接更為緊密，其中與TP53和FOS結(jié)合能最低的活性成分為槲皮素，與IL6結(jié)合能最低的活性成分為β-谷甾醇。運(yùn)用PyMOL作三維圖展示槲皮素與配體小分子FOS(PDB ID:1fos)之間的相互作用(見圖7)。

表5 核心組方有效成分和二甲雙胍與TP53、FOS、IL6分子對接結(jié)果

圖7 FOS與槲皮素的分子對接模式圖Fig.7 Molecular docking diagram of FOS and quercetin

4 討論與結(jié)論

DCD是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，對患者的疾病預(yù)后、生活質(zhì)量造成不良的影響。中醫(yī)對DCD無專門病名，多將其歸于“消渴”“呆病”“癡呆”范疇，現(xiàn)多認(rèn)為其發(fā)病病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，病位在腦，涉及脾、腎等多臟腑。脾失健運(yùn)，不能游溢精微，積于中焦使其運(yùn)化機(jī)能受損，意舍不清,影響心神[14]；病程日久，或因痰蒙神竅，或因瘀血阻絡(luò)，或因痰瘀毒互結(jié)，集聚腦絡(luò)，腦失所養(yǎng)，導(dǎo)致DCD的發(fā)生發(fā)展，患者多表現(xiàn)出健忘、精神恍惚、認(rèn)知減退。病程日久，痰濕、瘀血、濁毒等病理產(chǎn)物相互作用耗損陰陽，終致腎精不足，髓海空虛[15,16]。

前針對DCD尚無明確完善的西醫(yī)治療方案，而中醫(yī)藥在治療DCD方面優(yōu)勢突出，在降低血糖血脂、延緩記憶減退、減輕毒副作用、提高生活質(zhì)量等方面均取得良好的臨床療效。本研究基于對中醫(yī)臨床處方進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘分析，通過頻次統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)DCD用藥多為川芎、桃仁、丹參、紅花、當(dāng)歸、黃芪、熟地黃等具有活血化瘀、補(bǔ)氣補(bǔ)血之味和半夏、石菖蒲、遠(yuǎn)志等理氣化濕、醒神益智之品?；钛雠c補(bǔ)虛藥物性味多甘、溫，配伍使用可化腦絡(luò)瘀阻，調(diào)氣血通暢，補(bǔ)正氣虛損。肝為瘀血生成之樞，善用肝經(jīng)藥物引經(jīng)報(bào)使，行氣活血，通利化瘀。理氣開竅藥與安神藥甘苦同用，肺脾同治，氣行則濕化，氣順則痰消，則化濁開竅，醒腦通絡(luò)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果提示桃仁-紅花、川芎-紅花、當(dāng)歸-紅花、枸杞子-菟絲子具有高頻率和強(qiáng)相關(guān)性。聚類分析和因子分析發(fā)現(xiàn)，公因子F1、F8(包括桃仁、紅花、川芎、當(dāng)歸、丹參)以活血化瘀通絡(luò)為主，是為“逐瘀湯”的基礎(chǔ)，并歸氣血，養(yǎng)活同施，既可除病因通腦絡(luò)，又可匡扶正氣，主治瘀血所致之證；公因子F2、F4(包括熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、菟絲子等)以補(bǔ)虛為主，其中熟地黃、山藥、山茱萸三陰并補(bǔ)，補(bǔ)腎益精，養(yǎng)肝健脾，為“地黃丸”重要組成部分，主治肝腎虧損之證；公因子F2、F3、F5、F6、F7(包括半夏、茯苓、白術(shù)、甘草、石菖蒲等)以理氣化濕醒腦為主，其中半夏和茯苓相結(jié)合，為“二陳湯”的基礎(chǔ)，取燥濕散結(jié)與利水滲濕之效，主治痰濁所致之證。聚類分析與因子分析結(jié)果相似，客觀地證明治療DCD中藥配伍有規(guī)可循。

根據(jù)數(shù)據(jù)挖掘分析結(jié)果得出，當(dāng)歸、桃仁、紅花、川芎、熟地黃、枸杞子、菟絲子、石菖蒲、白芍9味藥組成的核心組方能從多角度、多維度、多層面反映中醫(yī)藥從“活血化瘀、補(bǔ)腎填髓、開竅醒腦”基本法則治療DCD。從微觀角度，核心組方中槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇等化合物發(fā)揮了重要的作用。槲皮素不僅能降低胰島素抵抗和空腹血糖水平，而且可調(diào)節(jié)海馬區(qū)SIRT1活性蛋白和NLRP3炎癥小體表達(dá)，不僅可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，而且還可抑制海馬區(qū)異常炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)元異常退變[17]。山奈酚是一種天然類黃酮化合物，不僅能通過抑制NO降解實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的抗氧化保護(hù)，還可通過調(diào)節(jié)MAPK、PI3K-Akt通路降低炎癥因子表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激[18]。β-谷甾醇[19]可通過激活胰島素下游信號分子以降低IRS-1磷酸化，上調(diào)IR-1和AKT蛋白的表達(dá)，抑制PKCq和NF-κB通路傳導(dǎo)，削弱海馬區(qū)炎癥反應(yīng)。PPI網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治霰砻鳎诵慕M方通過TP53、FOS、IL6、MAPK14、CASP3、ERS1、IL1B等核心靶點(diǎn)治療DCD的可能性較大，涉及糖脂代謝、血管生成、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞老化和凋亡等生物學(xué)過程。

通過FOS、IL6、IL1B、MAPK14、CASP3等基因可誘導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子，激活TNF信號通路、MAPK信號通路、Toll樣通路、FoxO信號通路發(fā)揮作用，使得炎性因子磷酸化以調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)[20]。這些信號通路不僅與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)之間關(guān)系緊密，也與ERS和細(xì)胞自噬相關(guān)。當(dāng)機(jī)體能量供給不足引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡紊亂，通過MAPK信號通路、FoxO信號通路多重調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，清除細(xì)胞質(zhì)中的異常蛋白，調(diào)控自噬通量，抑制ERS，減少淀粉樣蛋白在海馬區(qū)的異常沉積以保護(hù)神經(jīng)元[21,22]。雌激素信號通路介導(dǎo)多種雌激素核受體抑制海馬神經(jīng)元內(nèi)部的ERS，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定，阻斷Caspase級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控CASP3基因以保護(hù)細(xì)胞存活，對認(rèn)知功能障礙產(chǎn)生一定程度的良性調(diào)節(jié)[23]。Toll樣受體(TLRs)被證明可通過胰島素信號通路和Toll樣通路激活胰島素下游信號分子，上調(diào)胰島β細(xì)胞周圍蛋白的活性，調(diào)控全身胰島素敏感性和血脂分布[24]。

通過數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)目前中醫(yī)組方治療DCD多從行氣活血化瘀、化痰醒腦開竅、滋陰填精固腎的大方向入手，從中挖掘出當(dāng)歸-桃仁-川芎、當(dāng)歸-紅花-川芎、川芎-紅花-桃仁、熟地黃-菟絲子-枸杞子等核心藥物配伍，為日后臨床應(yīng)用提供寶貴治療經(jīng)驗(yàn)和參考；基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對中醫(yī)治療DCD遣方用藥中的核心組方潛在作用機(jī)制進(jìn)行初步分析，由此對中醫(yī)醫(yī)家治療疾病過程中所用的藥物給出科學(xué)的解釋。同時(shí)，本研究還存在一定的不足和缺陷，包括納入中醫(yī)臨床處方數(shù)量有限、文獻(xiàn)質(zhì)量參差不齊等，數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)尚停留于理論層面，對核心藥物有效成分作用DCD的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。