梁瑞敏，王 凱，陳 悅，曹金一，喬 逸，馮智軍，楊志福*

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽(yáng) 712046；2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，西安 710032

近年來(lái)缺血性腦卒中的致殘率和死亡率持續(xù)上升[1]。缺血性腦卒中是最常見(jiàn)的中風(fēng)類型，發(fā)生在頸部或腦部血管阻塞時(shí)，導(dǎo)致腦組織局部缺血缺氧，引起腦組織軟化甚至壞死的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2]。目前西醫(yī)治療缺血性腦卒中的方法有抗血小板治療、急性期降壓處理及去血腫顱骨切除術(shù)、腦室內(nèi)置管引流術(shù)、微創(chuàng)穿刺血腫清除術(shù)等[3,4]。這些方法迅速、有效，但也伴隨一些副作用，如術(shù)后再出血、感染及神經(jīng)損傷、腦灌注壓不足等風(fēng)險(xiǎn)。目前中藥改善缺血性腦卒中的主要作用包括對(duì)抗缺血性腦卒中后的細(xì)胞凋亡，減少出血量，同時(shí)緩解腦血管痙攣、腦水腫以及神經(jīng)功能障礙等并發(fā)癥，進(jìn)而降低炎性反應(yīng)。

紅花為菊科紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，具有活血通經(jīng)，散瘀止痛之效[5]。其主要化學(xué)成分有黃酮類、甾體類、酚酸類、木脂素、查爾酮和揮發(fā)油等[6]。近年來(lái)紅花抗缺血性腦卒中的作用受到關(guān)注，其主要通過(guò)抑制自由基的產(chǎn)生、抑制血栓形成、抑制細(xì)胞凋亡與炎性反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抗氧化能力以及通過(guò)調(diào)節(jié)一些信號(hào)通路等發(fā)揮腦保護(hù)作用[5,8]。但是，中藥發(fā)揮療效具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因此紅花抗缺血性腦卒中的機(jī)制也是多方面的，但現(xiàn)階段缺乏對(duì)紅花抗缺血性腦卒中的藥效成分及作用機(jī)制的整體認(rèn)識(shí)。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)相結(jié)合的方法，通過(guò)構(gòu)建“紅花-活性成分-腦缺血共同靶點(diǎn)”三者間網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并對(duì)紅花抗缺血性腦卒中疾病中作用較強(qiáng)的靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，從整體角度闡述紅花抗缺血性腦卒中的復(fù)雜關(guān)系，進(jìn)而說(shuō)明紅花多成分、多靶點(diǎn)、多通路的藥理作用機(jī)制。

1 資料

本研究使用的數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件相關(guān)信息(見(jiàn)表1)。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件相關(guān)信息

2 方法

2.1 收集紅花活性成分、潛在靶點(diǎn)及轉(zhuǎn)換基因名

登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)，選擇“Herb name”，輸入“honghua”進(jìn)行檢索，以化合物口服藥物生物利用度(oralbioavail ability，OB)和類藥性(drug-like，DL)為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18，將符合條件的成分導(dǎo)入Excel表，即得紅花活性成分。研究表明紅花中的活性成分羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)，對(duì)缺血性腦卒中具有神經(jīng)保護(hù)作用[9-12]。因此將HSYA也列在其中。將紅花活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基因名的轉(zhuǎn)換，去除重復(fù)后獲得紅花活性成分對(duì)應(yīng)的基因名。

2.2 篩選缺血性腦卒中疾病靶點(diǎn)

利用人類基因(Genecards)、人類孟德?tīng)栠z傳(OMIM)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“ischemic stroke”作為關(guān)鍵詞檢索，去除重復(fù)后，得到與缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)。從中篩選出評(píng)分大于15的缺血性腦卒中疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分析。

2.3 獲取共同靶點(diǎn)

將紅花活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)與缺血性腦卒中疾病對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入在線Venny中，繪制韋恩圖，得到紅花作用靶點(diǎn)與缺血性腦卒中疾病靶點(diǎn)的交集，即共同靶點(diǎn)。獲得紅花潛在治療缺血性腦卒中疾病作用靶點(diǎn)。

2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及篩選核心靶點(diǎn)

將Venny中篩選到的共同靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇“Homo sapiens”，隱藏離散節(jié)點(diǎn)，得到蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因。利用Cytoscape 3.7.2將關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因按degree值排列，繪制相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并構(gòu)建“紅花-活性成分-腦缺血共同靶點(diǎn)”三者間網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，該網(wǎng)絡(luò)中有10個(gè)化合物能與5個(gè)及以上靶點(diǎn)發(fā)生相互作用。

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)。選擇“Homo sapiens”，進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，設(shè)定P-value ≤0.05，篩選出符合條件的條目，對(duì)其進(jìn)行可視化分析。GO富集分析主要包括生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞成分(cellular component，CC)相關(guān)過(guò)程，這些參與紅花治療缺血性腦卒中的整個(gè)過(guò)程。KEGG富集分析主要對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行富集，篩選出紅花治療缺血性腦卒中最可能的信號(hào)通路。

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

選擇共同靶點(diǎn)中degree值排名較高的靶點(diǎn)基因與“紅花-活性成分-腦缺血共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中排名靠前的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取紅花活性成分的分子結(jié)構(gòu)mol2格式，在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)將對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因轉(zhuǎn)換成3D分子結(jié)構(gòu)pdb格式。通過(guò)Pymol 2.5.0對(duì)分子進(jìn)行去水和剔除修飾配體，利用AutoDock Tools 1.5.6將紅花活性成分和靶點(diǎn)基因轉(zhuǎn)換為pdbqt格式。最后采用AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接，通過(guò)Pymol 2.5.0獲得化合物的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象，運(yùn)用Discovery Studio Visualize將分子對(duì)接得分較高且構(gòu)象較穩(wěn)定的化合物與靶點(diǎn)基因進(jìn)行可視化分析。

3 結(jié)果

3.1 紅花活性成分

通過(guò)篩選獲得紅花活性成分23種(見(jiàn)表2)。

表2 紅花23種活性成分信息表

續(xù)表2(Continued Tab.2)

3.2 獲取共同靶點(diǎn)

將23種紅花活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)去除重復(fù)后導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換基因名，共獲得459個(gè)靶點(diǎn)，利用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出評(píng)分大于15的缺血性腦卒中疾病靶點(diǎn)249個(gè)，在Venny中取交集得74個(gè)紅花潛在治療缺血性腦卒中疾病的作用靶點(diǎn)(見(jiàn)圖1)。

圖1 紅花與缺血性腦卒中靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Wain diagram of the targets of safflower and ischemic stroke

3.3 構(gòu)建“紅花-活性成分-腦缺血共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)篩選

將74個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇“Homo sapiens”，得到各靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖2)。將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中運(yùn)行的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2中，對(duì)各靶點(diǎn)之間關(guān)系進(jìn)行處理，依據(jù)degree值篩選出排名前20的靶點(diǎn)，繪制各靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系圖，圖中圓圈大小表示靶點(diǎn)作用強(qiáng)度，圓圈越大，表明作用越強(qiáng)(見(jiàn)圖3)。將紅花、紅花活性成分和紅花與疾病共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，構(gòu)建“紅花-活性成分-腦缺血共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖4)。

圖2 紅花潛在治療缺血性腦卒中作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network of potential therapeutic targets of safflower for ischemic stroke

圖3 排名前20靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系Fig.3 Interaction relationships among the top 20 targets

圖4 “紅花-活性成分-腦缺血共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network diagram of “safflower-active ingredient-cerebral ischemia common target”注：綠色節(jié)點(diǎn)表示紅花活性成分；黃色節(jié)點(diǎn)表示紅花與疾病共同作用靶點(diǎn)。Note:Green nodes represent active components of safflower;Yellow nodes represent common targets of safflower and disease.

3.4 GO功能及KEGG通路富集分析

采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)和R語(yǔ)言，將74個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析。通過(guò)GO富集分析，共得226個(gè)條目，其中BP條目170個(gè)，MF條目28個(gè)，CC條目28個(gè)；根據(jù)Count值由大到小的順序，分別選取前6個(gè)分析條目，BP中排名靠前的三個(gè)過(guò)程分別為RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)和基因表達(dá)的正調(diào)控(positive regulation of gene expression)，說(shuō)明紅花治療缺血性腦卒中疾病的靶點(diǎn)主要與炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)(見(jiàn)圖5)。通過(guò)KEGG富集分析，共得92條信號(hào)通路，根據(jù)P-adjust和Count值對(duì)紅花治療缺血性腦卒中疾病的代謝通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及AGE-RAGE、PI3K-Akt、TNF、HIF-1、IL-17信號(hào)通路(見(jiàn)圖6)。

圖5 GO功能富集分析圖Fig.5 GO functional enrichment analysis diagram注：圖中藍(lán)色、黃色和綠色分別表示MF、BP和CC過(guò)程。Note:Blue,yellow and green represent MF,BP and CC processes respectively.

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖(排名前20)Fig.6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis (top 20)注：圖中氣泡大小與顏色表示代謝通路富集程度，氣泡越大，顏色越深表明富集程度越高。Note:The bubble size and color in the figure indicate the enrichment degree of metabolic pathway.The larger the bubble,the deeper the color,and the higher the enrichment degree.

3.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合，結(jié)合能越低，其構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能≤-4.25 kcal/mol提示有一定結(jié)合活性，≤-5.0 kcal/mol說(shuō)明有較好結(jié)合活性，≤-7.0 kcal/mol表示有較強(qiáng)結(jié)合活性[13]。通過(guò)AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果如表3，利用Discovery Studio Visualize將紅花5種主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接，將結(jié)合活性強(qiáng)的結(jié)果進(jìn)行可視化處理(見(jiàn)圖7)。

圖7 紅花關(guān)鍵活性成分與靶蛋白對(duì)接可視化圖Fig.7 Visualization of the docking of key active components of safflower with target protein

4 討論與結(jié)論

缺血性腦卒中會(huì)造成一系列不利影響，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和認(rèn)知障礙等[1]。中醫(yī)認(rèn)為中風(fēng)的主要病機(jī)在于陰陽(yáng)失調(diào)，氣血逆亂，治療原則多以祛風(fēng)通絡(luò)、活血化瘀為主[14]。而紅花是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，屬活血化瘀類，多見(jiàn)于活血化瘀類的復(fù)方中[15]。近年來(lái)在腦血管疾病中應(yīng)用廣泛，但其作用機(jī)制仍不明確，因此本文首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)紅花治療缺血性腦卒中機(jī)制進(jìn)行探討。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，紅花活性成分中槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、豆甾醇(stigmasterol)、木犀草素(luteolin)和羥基紅花黃色素A(HSYA)作用靶點(diǎn)居多，是紅花的主要活性成分。其中槲皮素[16]、山奈酚[17]、豆甾醇[18]、木犀草素[19]、羥基紅花黃色素A[20]均具有抗炎抗氧化的作用，有作為炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激輔助治療的潛力，山奈酚[17]和羥基紅花黃色素A[20]還具有抑制細(xì)胞凋亡，改善微循環(huán)，矯正受損代謝通路的作用。因此推測(cè)這些成分可能是紅花治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵。

將靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，通過(guò)degree值篩選發(fā)現(xiàn)TNF、VEGFA、IL6、CXCL8、ICAM1和CCL2靶點(diǎn)與紅花活性成分作用關(guān)系強(qiáng)，是紅花治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)對(duì)細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，可引發(fā)血管炎性，并誘導(dǎo)炎性細(xì)胞從血管內(nèi)轉(zhuǎn)移至神經(jīng)組織[21]，白介素-6(IL-6)[22]、CXCL8[23]、趨化因子配體2(Chemokine ligand 2，CCL2)[24]在缺血性腦卒中后炎癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)[25]主要參與缺血性腦卒中后血管新生過(guò)程。通過(guò)GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，AGE-RAGE、PI3K-Akt、TNF、HIF-1、IL-17信號(hào)通路是紅花治療缺血性腦卒中的主要通路。PI3K-Akt是細(xì)胞內(nèi)重要存活和抗凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[26]，AGE-RAGE信號(hào)通路可促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管新生[27]，HIF-1信號(hào)通路在急性腦缺血時(shí)可被激活，介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)[28]，表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在AGE-RAGE和HIF-1信號(hào)通路富集，且課題組前期研究表明HSYA通過(guò)刺激VEGF信號(hào)傳導(dǎo)可治療缺血性腦卒中[29]，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。因此，紅花治療缺血性腦卒中是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管新生等作用。

表3 紅花關(guān)鍵活性成分與靶蛋白對(duì)接結(jié)果

通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步揭示紅花治療缺血性腦卒中疾病的作用機(jī)制，結(jié)果顯示關(guān)鍵靶點(diǎn)與紅花活性成分對(duì)接效果好，其中TNF與紅花5種主要活性成分的結(jié)合能均≤-7.0 kcal/mol，表明有較強(qiáng)結(jié)合活性，IL6與槲皮素、山奈酚、木犀草素也有較強(qiáng)結(jié)合活性，而CXCL8和VEGFA與槲皮素、山奈酚、木犀草素結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，有較好結(jié)合活性。因此推測(cè)紅花主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合可能是紅花發(fā)揮治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵。

綜上所述，本研究從整體角度闡述紅花抗缺血性腦卒中的復(fù)雜關(guān)系，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)紅花治療缺血性腦卒中機(jī)制進(jìn)行分析，并運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)紅花主要通過(guò)槲皮素、山奈酚和木犀草素等活性成分，作用于TNF、VEGFA、IL6、CXCL8等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和血管新生等作用，進(jìn)而調(diào)控AGE-RAGE、TNF和IL-17等信號(hào)通路治療缺血性腦卒中。研究結(jié)果為紅花治療缺血性腦卒中作用機(jī)制提供理論指導(dǎo)，也為缺血性腦卒中的藥物研發(fā)提供參考。