杜世龍，寧秀梅，何 苗，李翡翡，張 會，丁 蘭

西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070

真核細(xì)胞內(nèi)的微絲、微管和中間纖維通過與其結(jié)合蛋白相互連接，形成了高度有序的三維網(wǎng)絡(luò)狀的胞質(zhì)骨架系統(tǒng)，它們參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運輸、信息傳遞、細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞形態(tài)維持等關(guān)鍵性細(xì)胞生命過程。細(xì)胞骨架的動力學(xué)過程受到高度調(diào)控以服務(wù)于細(xì)胞生命活動的需求，其組裝失調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制，細(xì)胞分裂停滯，甚至細(xì)胞凋亡發(fā)生[1]。一些抗腫瘤藥物可通過改變細(xì)胞骨架的解聚和聚合作用，破壞微管的動態(tài)平衡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。植物源性抗癌藥物長春花生物堿和紫杉烷類藥物可與β-tubulin結(jié)合，干擾微管骨架的動力學(xué)過程，用于治療多種腫瘤，包括乳腺癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、急性白血病等[2]。以細(xì)胞骨架及其相關(guān)蛋白為靶點的抗腫瘤藥物的研究與發(fā)現(xiàn)已成為非?；钴S的前沿研究領(lǐng)域[1]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)作為細(xì)胞內(nèi)的信號分子，參與細(xì)胞增殖和分化等重大細(xì)胞生命過程[3]。在腫瘤細(xì)胞中由于代謝通路發(fā)生改變，ROS的含量增多，特別是H2O2顯著增加，使腫瘤細(xì)胞對ROS水平的變化更為敏感，因而ROS生成和抗氧化防御對細(xì)胞內(nèi)組分的特定修飾被確定為癌癥治療的靶點[4]。研究顯示，由NADPH氧化酶和其他來源產(chǎn)生的ROS可直接修飾微絲、微管和中間絲蛋白而對其組裝-解組裝的動態(tài)過程產(chǎn)生影響[5]，或通過相關(guān)信號通路活化細(xì)胞骨架上游Rho GTP酶而重塑細(xì)胞骨架[6]。NADPH氧化酶介導(dǎo)的胞內(nèi)氧化應(yīng)激還對細(xì)胞骨架相關(guān)疾病有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。近年來，研究者對ROS參與細(xì)胞骨架動力學(xué)調(diào)節(jié)產(chǎn)生了廣泛興趣。

香茶菜屬植物在我國分布90余種，供藥用的約有30余種，其中冬凌草(Isodonrubescens)曾被收入《中國藥典》，主要用于抗菌消炎及抗腫瘤等疾病的治療[7]。冬凌草素(oridonin)作為冬凌草的主要活性成分，其抗癌機制已有較深入研究，它的結(jié)構(gòu)修飾物已作為抗白血病藥物進(jìn)入一期臨床試驗[8]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對映-貝殼杉烷二萜約1 300余種，在香茶菜屬植物的枝葉中含量尤為豐富，該類化合物顯示了廣泛的抗癌活性，有望從中發(fā)現(xiàn)新的抗癌藥物[8]。目前僅有冬凌草素等極少數(shù)的對映-貝殼杉烷二萜的抗癌機制有較深入系統(tǒng)的研究，其他該類二萜的相關(guān)研究還很欠缺，但近年來也取得了一些重要進(jìn)展。近年來，發(fā)現(xiàn)某些對映-貝殼杉烷二萜可作用于細(xì)胞骨架系統(tǒng)而發(fā)揮抗癌活性。例如，pharicin A直接靶向BubR1蛋白而激活紡錘體組裝檢查點，阻止細(xì)胞中期向后期轉(zhuǎn)換，抑制白血病細(xì)胞Raji和Jurkat的有絲分裂期[9]；wangzaozin A和epinodosin分別引起HeLa細(xì)胞和HL-60細(xì)胞骨架(微絲、微管和中間絲)重排[10,11]，與其誘導(dǎo)細(xì)胞分化相關(guān)聯(lián)；leukamenin E還能誘導(dǎo)HUVECs和PLC細(xì)胞的角蛋白磷酸化進(jìn)而阻滯角蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)正常組裝[12,13]。本文繼續(xù)報道leukamenin E對HeLa細(xì)胞的3種骨架纖維(微絲、微管及角蛋白纖維)重排的影響以及所導(dǎo)致的細(xì)胞生長和遷移抑制的可能機制，為闡明對映-貝殼杉烷二萜類化合物的抗癌分子機制提供線索，也為該化合物的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑與受試化合物

DMEM培養(yǎng)基、MTT、吉姆薩染色劑、碘化丙啶(propidium iodide，PI)及TRITC Phalloidin(Sigma公司)；Pan-Keratin Mouse mAb、α-tubulin Mouse mAb(Cell Signaling Technology公司)；Goat anti-mouse IgG-FITC(Santa Cruz公司)；胰蛋白酶(trypsin,中國生工生物公司)；RNase A(Solarbio)；新生小牛血清(中國杭州四季青生物技術(shù)有限公司)；熒光探針DCFH-DA(2,7-dichlorfluorescein-diacetate)、抗氧化劑NAC(N-acetyl-L-cysteine)(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

對映-貝殼杉烷型二萜leukamenin E由本實驗室從甘肅產(chǎn)總序香茶菜(Isodonracemosa(Hemsl) Hara)中分離得到，采用紫外，紅外，質(zhì)譜，核磁共振等波譜學(xué)方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定[14]。用DMSO溶解leukamenin E(純度大于99.5%)，配制成10 mmol/L的母液于4 ℃儲存?zhèn)溆?。本實驗體系中助溶劑DMSO終濃度小于0.01%，對細(xì)胞的生長無影響。Leukamenin E的分子結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 Leukamenin E的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of leukamenin E

1.1.2 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱(Forma Scientific，美國)，超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)，江蘇)，倒置顯微鏡(Olympus CKX41SF，日本)，正置熒光顯微鏡(Leica DMI4000B，德國)，高速低溫離心機(Beckman Coulter Allegra64R，美國)，流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC Flow Cytometer，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa購自中科院上海典藏細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 °C、5% CO2及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測leukamenin E對HeLa細(xì)胞生長的影響

取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，以5 × 104個/mL的密度接種于96孔板，貼壁培養(yǎng)24 h后，加入含有不同濃度leukamenin E的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24或48 h后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，孵育4 h后棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，震蕩10 min，490 nm處測量OD值。

1.2.3 平板集落形成法檢測leukamenin E對HeLa細(xì)胞集落形成的影響

取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，以100個/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，24 h后加入與“1.2.2”相同的受試藥物濃度，培養(yǎng)7天后用甲醇固定，吉姆薩染色，在顯微鏡下記錄每孔的細(xì)胞集落數(shù)(≥ 50個細(xì)胞為一個集落)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測leukamenin E對HeLa細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞接種及藥物的加入與“1.2.2”所述相同。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)48、72 h后收集細(xì)胞；預(yù)冷的PBS(pH7.4)洗2次，離心，棄上清。加入預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃ 固定過夜，1 200 rpm離心5 min，棄固定液后用PBS洗2次，加入RNase A(終濃度100 μg/mL)，37 ℃ 孵育30 min后，再加入PI(終濃度40 μg/mL)避光孵育30 min后，260目尼龍網(wǎng)過濾，上機檢測。

1.2.5 吉姆薩染色觀察leukamenin E對HeLa細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)的影響

細(xì)胞接種密度與藥物的處理見“1.2.2”。在細(xì)胞培養(yǎng)48 h和72 h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，且對細(xì)胞偽足進(jìn)行定量分析[15]。在細(xì)胞培養(yǎng)48、72 h后，取出細(xì)胞爬片，PBS 洗2次，用甲醇-冰乙酸(3∶1)固定30 min，晾干后用吉姆薩染液染色20 min，用蒸餾水沖洗干凈，于顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)并拍照。

1.2.6 劃痕法檢測leukamenin E對HeLa細(xì)胞遷移的影響

取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，以5 × 104個/mL密度接種于24孔板，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入絲裂霉素(終濃度5 μg/mL)處理2 h，用滅菌的10 μL槍頭在每孔底部中間劃一窄線，用培養(yǎng)基洗去漂浮細(xì)胞，加入不同濃度的藥物。藥物處理24、48 h后置細(xì)胞培養(yǎng)板于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 TRITC Phalloidin檢測leukamenin E對HeLa細(xì)胞微絲的影響

細(xì)胞接種及藥物的加入與“1.2.2”所述相同。待細(xì)胞培養(yǎng)48、72 h后取出細(xì)胞爬片，用PBS(pH7.4)洗3次/5 min，加入4%甲醛室溫下固定15 min，洗去固定液，PBS(pH7.4)洗3次/5 min；避光加入TRITC Phalloidin，置于濕盒內(nèi)37 ℃ 孵育1 h后用PBS(pH7.4)洗3次，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8 間接免疫熒光技術(shù)檢測leukamenin E對HeLa細(xì)胞微管的影響

細(xì)胞接種、藥物濃度、細(xì)胞爬片及固定與“1.2.2”所述相同。細(xì)胞固定后于室溫下透化15 min(PBS含0.3% Triton X-100)；吸去透化劑，加一抗置于37 ℃ 孵育1 h；PBS(pH7.4)洗3次后加二抗避光孵育2 h；用PBS洗3次后封片，在熒光顯微鏡下用同樣的拍攝參數(shù)進(jìn)行觀察、拍照。

1.2.9 間接免疫熒光技術(shù)檢測leukamenin E對HeLa細(xì)胞角蛋白纖維的影響

細(xì)胞接種及藥物的加入與“1.2.2”所述相同。藥物處理48、72 h后，取出細(xì)胞爬片，PBS(pH8.0)洗3次/5 min；用預(yù)冷的甲醇在-20 ℃固定5 min后用PBS(pH8.0)洗3次/5 min；室溫下封閉1 h(封閉緩沖液：5%山羊血清，0.3% Triton X-100的PBS液)后，加一抗置于4 °C 冰箱孵育過夜；PBS(pH8.0)洗3次后加二抗避光孵育2 h，最后PBS(pH8.0)洗3次后封片，在熒光顯微鏡下用同樣的拍攝參數(shù)進(jìn)行觀察、拍照。

按照上述相同的細(xì)胞接種濃度，用吉姆薩染色、劃痕法和免疫熒光技術(shù)分別測定了300 μmol/L NAC單獨或聯(lián)合1.0 μmol/L leukamenin E對HeLa細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移以及3種細(xì)胞骨架纖維(微管、微絲和角蛋白纖維)重排的影響。

1.2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測leukamenin E對HeLa細(xì)胞聚合態(tài)纖維骨架含量的影響

細(xì)胞接種及藥物的加入與“1.2.2”所述相同。待細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，消化，用1 200 rpm離心5 min收集細(xì)胞，之后對細(xì)胞的處理方法同“1.2.7”“1.2.8”和“1.2.9”。PBS每次清洗后用1 200 rpm離心5 min收集細(xì)胞。260目尼龍網(wǎng)過濾，上機檢測。

1.2.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測leukamenin E對HeLa細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，以1 × 104個/mL密度接種于6孔板，不同藥物處理后離心收集各組細(xì)胞，PBS清洗后加入DCFH-DA熒光探針染色，收集細(xì)胞，PBS清洗去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，上機檢測。

1.2.12 統(tǒng)計學(xué)分析

每組處理組隨機取50個細(xì)胞，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析平均熒光強度。細(xì)胞遷移距離采用Image J 1.52a軟件測量分析。柱形圖和折線圖使用Origin 2018軟件制作。實驗數(shù)據(jù)以mean±SD表示(n=3)，顯著性差異分析用SPSS 23.0軟件。P< 0.05為差異顯著，P< 0.01為差異極顯著。

2 實驗結(jié)果

2.1 Leukamenin E導(dǎo)致HeLa細(xì)胞的周期阻滯及細(xì)胞的增殖抑制

不同濃度的leukamenin E處理HeLa細(xì)胞24、48 h后，用MTT法檢測細(xì)胞活力(見圖2A)。如圖2A所示，與對照相比，0.4 μmol/L leukamenin E對HeLa細(xì)胞的增殖無明顯影響，而0.6～1.0 μmol/L leukamenin E顯示了顯著的抑制效應(yīng)，其最高抑制率為20%(1.0 μmol/L， 48 h)。同樣，leukamenin E對HeLa細(xì)胞的集落形成能力也有顯著的抑制作用。如圖2B所示，對照組的細(xì)胞集落形成數(shù)目最多(63.2±3.3)，隨著藥物濃度的依次升高，HeLa細(xì)胞的集落形成能力明顯下降，各處理組與對照組相比均具有顯著差異。

進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)檢測了0.4～1.0 μmol/L leukamenin E對HeLa細(xì)胞周期的影響。如圖2C所示，leukamenin E導(dǎo)致明顯的G1期阻滯。48 h對照組G1期細(xì)胞比率為46.9%，0.4、0.6、0.8和1.0 μmol/L處理組G1期細(xì)胞比率分別為51.7%、55.5%、57.5%和60.1%，分別增加了4.8%、8.6%、11%和13.3%；同時，各處理組的G2期細(xì)胞比率也有所增加，而S期細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)下降，在1.0 μmol/L時下降了17.9%(見圖2C)。72 h處理組顯示了與48 h處理組相似的G1期阻滯效應(yīng)：與對照組相比，72 h藥物處理組G1期細(xì)胞分別增加了4.9%、6.3%、10.3%和11.8%。同時S期細(xì)胞比率也出現(xiàn)下降，但G2期細(xì)胞變化不大(見圖2D)。

圖2 Leukamenin E對HeLa細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effects of leukamenin E on HeLa cells proliferation and cell cycle注：A：Leukamenin E對HeLa細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)；B：Leukamenin E抑制HeLa細(xì)胞集落形成能力，與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；C、D：48 h和72 h時leukamenin E對HeLa細(xì)胞周期的影響。Note:A:Leukamenin E inhibits proliferation of HeLa cells;B:Leukamenin E inhibits the colony forming ability of HeLa cells,compared with control,*P < 0.05,**P < 0.01;C and D:Graph depicts the effects of leukameninE on HeLa cell cycle at 48 h and 72 h.

上述結(jié)果表明0.6～1.0 μmol/L leukamenin E通過對HeLa細(xì)胞的G1期阻滯而抑制其增殖。

2.2 Leukamenin E誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)的改變

不同濃度leukamenin E處理HeLa細(xì)胞48 h和72 h后的細(xì)胞形態(tài)如圖3A所示，對照組細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則多邊形，處理組的細(xì)胞的整體形態(tài)呈現(xiàn)兩極伸長，向長條形變化的趨勢；細(xì)胞偽足呈現(xiàn)減少趨勢，較高濃度處理組(0.6～1.0 μmol/L)顯示了顯著或極顯著差異(見圖3C、D)。處理組中某些細(xì)胞兩端的偽足拉伸延長呈細(xì)絲狀，尤其在高濃度和長時間處理組中，這類細(xì)胞明顯增多，還觀察到長絲狀偽足交織成網(wǎng)狀的現(xiàn)象。

進(jìn)一步通過吉姆薩染色觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化。從圖3B可以看出，對照組的細(xì)胞核體積較大，呈圓形或卵圓形，有多個核仁，核漿比值大；當(dāng)不同濃度藥物處理48 h后，核體積變小，核漿比值下降，核形態(tài)改變成為“腎形”的細(xì)胞比率增多，并發(fā)現(xiàn)在“腎形核”凹處其細(xì)胞質(zhì)著色較淺，呈小空泡樣結(jié)構(gòu)；當(dāng)藥物處理72 h后，核體積和核漿比值進(jìn)一步下降，但“腎形核”比率與48 h處理組相比卻有所減少，多數(shù)細(xì)胞核呈較小的橢圓形。核體積和核漿比值下降表明細(xì)胞代謝活動有所下降，而“腎形核”增多提示細(xì)胞骨架尤其是微管骨架可能有顯著重排。

圖3 Leukamenin E對HeLa細(xì)胞形態(tài)及核形態(tài)的影響Fig.3 Effects of leukamenin E on HeLa cells morphology and nuclear morphology注：A：48 h和72 h倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化；B：48 h和72 h細(xì)胞核形態(tài)的變化；C、D：Leukamenin E處理48 h和72 h后HeLa細(xì)胞偽足數(shù)的定量分析，與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖中箭頭指示細(xì)胞核為“腎形核”的細(xì)胞。Note:A:Changes of cell morphology under the inverted microscope at 48 h and 72 h;B:Changes in nuclear morphology at 48 h and 72 h;C and D:Quantitative analysis of the pseudopodia number of HeLa cells treated with leukamenin E at 48 h and 72 h,compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.The arrow in the figure indicates a cell with a "kidney-shaped nucleus".

2.3 Leukamenin E抑制HeLa細(xì)胞的遷移

劃痕實驗檢測leukamenin E對HeLa細(xì)胞遷移的變化結(jié)果如圖4所示。在24 h處理組中對照組細(xì)胞遷移明顯，其劃痕愈合率為51%±2.0%，而0.6、0.8和1.0 μmol/L藥物處理組的劃痕愈合率分別為43.5%±4.0%、31.4%±3.0%和23.7%±3.0%(圖4B)，表明leukamenin E對細(xì)胞的遷移有明顯的抑制效應(yīng)；48 h后對照組大部分細(xì)胞已遷移靠近劃痕中線，其劃痕愈合率為62.7%±5.0%，而0.6、0.8和1.0 μmol/L處理組細(xì)胞的遷移受到明顯的抑制，其劃痕愈合率分別為51.0%±2.0%、36.9%±3.0%和29.4%±2.0%(見圖4C)。

圖4 Leukamenin E對HeLa細(xì)胞遷移的影響Fig.4 Effects of leukamenin E on HeLa cells migration注：A：不同濃度的leukamenin E對HeLa細(xì)胞遷移的抑制作用；B、C：不同濃度的leukamenin E處理24 h和48 h后HeLa細(xì)胞的劃痕閉合率，與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:A:Inhibition of leukamenin E on HeLa cell migration at the indicated concentrations;B and C:Scratch closure rate of HeLa cells treated with the indicated concentrations of leukamenin E for 24 h and 48 h,compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

2.4 Leukamenin E誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的微絲、微管及角蛋白纖維的重排

分別用0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L的leukamenin E處理HeLa細(xì)胞48 h、72 h，通過TRITC Phalloidin染色微絲或者免疫熒光染色微管和角蛋白纖維后觀察其變化，結(jié)果如圖5所示。從圖5A可以看出，對照組細(xì)胞胞質(zhì)中可見清晰的平行束狀應(yīng)力纖維(微絲)，貫穿于整個細(xì)胞胞質(zhì)，數(shù)量較多。0.4 μmol/L的leukamenin E對HeLa細(xì)胞中應(yīng)力纖維的影響與對照組相比沒有顯著變化，而0.6～1.0 μmol/L的leukamenin E顯著減少胞質(zhì)中的應(yīng)力纖維數(shù)量，并顯示了濃度依賴性(見圖5A、B)。另外，表示胞質(zhì)中微絲含量的細(xì)胞的平均熒光強度也隨leukamenin E的濃度增加而降低，較高濃度處理組細(xì)胞顯示了顯著性或極顯著差異(圖5D)，表明leukamenin E本文實驗條件下可減少微絲數(shù)量，主要減少應(yīng)力纖維的數(shù)量。

利用間接免疫熒光技術(shù)對微管染色，結(jié)果如圖5A所示。對照組細(xì)胞中的微管網(wǎng)絡(luò)在胞質(zhì)中呈致密的均勻分布；0.4 μmol/L處理組細(xì)胞的微管網(wǎng)絡(luò)與對照組細(xì)胞相比沒有發(fā)生明顯變化，而在0.6、0.8和1.0 μmol/L藥物處理組細(xì)胞中的微管分布有明顯改變：核周出呈現(xiàn)較強的熒光斑，表明微管在此有聚集，且隨著處理藥物濃度的升高和時間的延長，這種現(xiàn)象更為明顯。經(jīng)Image Pro Plus 6.0軟件分析顯示，處理組細(xì)胞中微管的平均熒光強度與對照組細(xì)胞相比顯著增加(見圖5E)，表明leukamenin E可增加HeLa細(xì)胞微管數(shù)量，主要刺激核周區(qū)域微管的聚集。

圖5 Leukamenin E對HeLa細(xì)胞3種細(xì)胞質(zhì)骨架分布的影響Fig.5 Effects of leukamenin E on the distribution of three cytoskeleton in HeLa cells注：A：48 h處理組細(xì)胞內(nèi)微管、微絲和角蛋白纖維的熒光顯微鏡圖像；B：72 h處理組細(xì)胞內(nèi)微管、微絲和角蛋白纖維的熒光顯微鏡圖像；C：具有長絲狀偽足細(xì)胞的微管和角蛋白纖維的熒光顯微鏡圖像；D～F：不同處理組細(xì)胞的微絲、微管和角蛋白纖維的平均熒光強度值，分別與48 h或72 h的對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。白色箭頭指細(xì)胞骨架的排列發(fā)生顯著改變的胞質(zhì)區(qū)域，標(biāo)尺10 μm。Note:A:Fluorescence microscope images of intracellular microtubules,microfilaments and keratin filaments in treated cells at 48 h;B:Fluorescence microscope images of intracellular microtubules,microfilaments and keratin filaments in treated cells at 72 h;C:Fluorescence microscope images of microtubules and keratin filaments in cells with cytoplasmic elongation.D-F:The average fluorescence intensity values of microfilaments,microtubules and keratin filaments of cells in different treatment groups,respectively compared with the control group of 48 h or 72 h,*P < 0.05,**P < 0.01;The white arrow points to the cytoplasmic area where the arrangement of the cytoskeleton has changed significantly,and the scale is 10 μm.

對角蛋白中間纖維進(jìn)行免疫熒光染色，其觀察結(jié)果如圖5B所示。對照組細(xì)胞的角蛋白纖維呈致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且均勻分布；0.4和0.6 μmol/L處理組細(xì)胞在48 h和72 h時其角蛋白纖維的分布與對照相比無明顯變化，但核周角蛋白纖維的熒光強度有增加趨勢，0.6 μmol/L處理組(48 h和72 h)角蛋白纖維的平均熒光強度均具有顯著性上升；0.8和1.0 μmol/L處理組細(xì)胞與對照相比其角蛋白纖維分布明顯改變，在核周有聚集的趨勢，尤其是48 h處理組細(xì)胞在核周出現(xiàn)較強的熒光區(qū)域，纖維變粗，而72 h處理組細(xì)胞核周熒光區(qū)與48 h處理組細(xì)胞比卻有顯著的減弱。

如前所述(見圖3A)，較高濃度藥物和較長時間處理組的細(xì)胞形成伸長的絲狀偽足，經(jīng)免疫熒光染色后，發(fā)現(xiàn)這些偽足中含有豐富的微管和角蛋白纖維，清晰可見其平行束狀排列(見圖5C)。但在微絲的染色中未見這些長絲狀偽足中有應(yīng)力纖維分布。從上述這些現(xiàn)象可知，藥物處理后微管和角蛋白纖維的重排明顯，最明顯特征是核周及偽足處聚合度明顯增加。

2.5 Leukamenin E引起HeLa細(xì)胞微絲、微管及角蛋白纖維的聚合度改變

細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色后用流式細(xì)胞術(shù)測量胞內(nèi)微絲、微管和角蛋白纖維的含量。由于樣品處理過程使細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白流出(低聚合的骨架纖維也有流失)，因而，此方法所檢出數(shù)據(jù)表示聚合態(tài)纖維骨架含量。

用0.4和0.8 μmol/L的leukamenin E處理HeLa細(xì)胞48 h后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中3種骨架纖維含量，評估其聚合特性，結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，與對照組相比，高濃度處理組(0.8 μmol/L)細(xì)胞的聚合態(tài)微絲含量顯著減少，而聚合態(tài)微管的含量卻顯著增多，其中0.4 μmol/L和0.8 μmol/L處理組細(xì)胞中聚合態(tài)微管與對照組相比分別增加了204.1%和383.4%，并顯示了濃度依賴性，同時，處理組細(xì)胞中聚合態(tài)角蛋白纖維含量有較小幅增加，達(dá)到顯著性或極顯著差異(見圖6)。

圖6 Leukamenin E對HeLa細(xì)胞3種骨架聚合的影響Fig.6 Effects of leukamenin E on the aggregation of three cytoskeleton in HeLa cells注：與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:Compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

2.6 Leukamenin E引起HeLa細(xì)胞內(nèi)ROS的變化

DCFH-DA(2′,7′-dichlorfluorescein-diacetate)可穿過細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)酯酶作用下水解生成無熒光的DCFH，細(xì)胞內(nèi)的ROS可以進(jìn)一步氧化DCFH生成具有熒光的DCF(2′,7′-dichlo-rofluorescin)，其熒光強度即可反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。本實驗中，不同濃度的leukamenin E處理HeLa細(xì)胞6、12和24 h后，運用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的變化，其結(jié)果如圖7所示。從圖可以看出，0.6～1.0 μmol/L在相同濃度條件下，隨著處理時間的延長，ROS含量降低；相同處理時間條件下，隨著藥物濃度的升高ROS的含量明顯升高。與對照組相比，在0.6、0.8和1.0 μmol/L時顯示了顯著性差異，表明leukamenin E可在較短時間內(nèi)較大幅度提高胞內(nèi)ROS水平。

圖7 Leukamenin E對HeLa細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.7 Effects of leukamenin E on ROS in HeLa cells注：與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:Compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

2.7 Leukamenin E聯(lián)合NAC對HeLa細(xì)胞形態(tài)、遷移以及3種細(xì)胞骨架形態(tài)的影響

為了求證leukamenin E誘導(dǎo)的ROS升高與HeLa細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞遷移的改變是否相關(guān)聯(lián)，將抗氧化劑NAC(可清除活性氧)和1.0μmol/L leukamenin E加入培養(yǎng)基中，共孵育HeLa細(xì)胞24、48和72 h后，檢測細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移以及3種細(xì)胞骨架分布的變化，其結(jié)果如圖8所示。從圖8A可以看出，1.0 μmol/L leukamenin E單獨處理組細(xì)胞的形態(tài)與對照組細(xì)胞相比其伸長變形的細(xì)胞有明顯的增加(見圖8A：c和g)，細(xì)胞偽足數(shù)量比對照組有顯著減少(見圖8D)；300 μmol/L NAC對細(xì)胞形態(tài)沒有明顯的影響(見圖8A：b和f)，而NAC聯(lián)合leukamenin E處理組(300 μmol/L NAC+1.0 μmol/L leukamenin E)的細(xì)胞形態(tài)與對照組細(xì)胞相比也未見明顯改變(見圖8A：d和h)，表明leukamenin E誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與細(xì)胞形態(tài)的伸長改變相關(guān)聯(lián)。

圖8 NAC聯(lián)合leukamenin E使用對HeLa細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移以及3種胞質(zhì)骨架重排的影響Fig.8 Effects of NAC combined with leukamenin E on cell morphology,cell migration and three cytoskeletal rearrangement in HeLa cells注：A：NAC減弱了leukamenin E誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞形態(tài)的改變；B：NAC減弱了leukamenin E誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移的抑制效應(yīng)；C：NAC減弱了leukamenin E誘導(dǎo)3種胞質(zhì)骨架的重排，標(biāo)尺10 μm；D～F：Leukamenin E聯(lián)合NAC使用對HeLa細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移和胞質(zhì)骨架重排的定量分析，與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Le:Leukamenin E。Note:A:NAC reduced leukamenin E-induced changes of cell morphology;B:NAC reduced leukamenin E-induced inhibition of cell migration;C:NAC reduced leukamenin E-induced changes of the three cytoskeletal distribution in HeLa cells,scale 10 μm;D-F:Quantitative analysis of cell morphology,cell migration and cytoskeletal rearrangement in HeLa cells treated by leukamenin E combined with NAC.Compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.Le:Leukamenin E.

同樣，1.0 μmol/L leukamenin E單獨處理組對HeLa細(xì)胞3種細(xì)胞骨架的分布與對照組相比有明顯改變，具體細(xì)節(jié)與前面2.4中所述結(jié)果一致：胞質(zhì)應(yīng)力纖維顯著減少(見圖8C：c)；微管向核周聚集，而其他胞質(zhì)區(qū)域的微管分布減少(見圖8C：g)；角蛋白也呈現(xiàn)不均勻分布也在核周聚集，纖維變粗(見圖8C k)。而NAC與leukamenin E聯(lián)合處理(300 μmol/L NAC+1.0 μmol/L leukamenin E)顯著抑制了leukamenin E對HeLa細(xì)胞3種骨架形態(tài)的改變：與1.0 μmol/L leukamenin E單獨處理組誘導(dǎo)的改變相比，聯(lián)合處理組細(xì)胞的應(yīng)力纖維在中央?yún)^(qū)域有所減少，但細(xì)胞周邊的應(yīng)力纖維清晰可見(見圖8C：d)；微管和角蛋白纖維分布較為均勻，核周熒光強度相對較低，未見明顯的核周聚集現(xiàn)象(見圖8C：h和l)。進(jìn)一步的熒光強度分析顯示，NAC在培養(yǎng)中的加入的確減弱了leukamenin E誘導(dǎo)的微絲、微管和角蛋白纖維的改變，表明leukamenin E誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與HeLa細(xì)胞3種骨架的改變(重排)特征相關(guān)聯(lián)。

隨后，劃痕實驗檢測了NAC聯(lián)合leukamenin E使用時HeLa細(xì)胞的遷移變化，發(fā)現(xiàn)300 μmol/L NAC單獨處理HeLa細(xì)胞24 h后對細(xì)胞遷移顯示了一定的促進(jìn)效應(yīng)，但在48 h后其細(xì)胞遷移促進(jìn)效應(yīng)減弱，未顯示顯著性差異(見圖8B：b、f、j)，而NAC聯(lián)合leukamenin E使用后(300 μmol/L NAC+1.0 μmol/L leukamenin E)顯著減弱了1.0 μmol/L leukamenin E單獨處理對HeLa細(xì)胞的遷移抑制效應(yīng)(見圖8B：d、h、l)，表明leukamenin E誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與細(xì)胞遷移抑制效應(yīng)相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

近年來，對映-貝殼杉烷二萜的抗癌藥理活性引起了研究者的廣泛興趣，不同分子構(gòu)型的該類化合物的抗癌機制的研究報道逐年增多[9,10,12,13,16]，發(fā)現(xiàn)該類化合物對細(xì)胞生命過程的影響是多方面的，在分子水平也顯示了多靶點效應(yīng)。例如，通過多種細(xì)胞信號途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化[10,16-19]；靶向作用于過氧化物還原酶Ⅰ和Ⅱ、BubR1蛋白以及癌蛋白AML1-ETO[9,16]，并可調(diào)節(jié)NADPH氧化酶活性和誘導(dǎo)角蛋白磷酸化[10,12,13,17]。我們課題組相繼報道了對映-貝殼杉烷二萜對細(xì)胞骨架系統(tǒng)的影響：leukamenin E可誘導(dǎo)細(xì)胞角蛋白K8和K18磷酸化而抑制角蛋白的組裝[13]；epinodosin和wangzaozin A可分別影響HL-60和HeLa細(xì)胞骨架動態(tài)組裝，引起胞質(zhì)骨架重排，改變微絲、微管和中間纖維骨架纖維的分布，干擾胞質(zhì)骨架系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)[10,11]，但其作用機制不甚清楚。

本文中我們首先研究了低濃度leukamenin E(0.4～1.0 μmol/L)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞骨架重排的特征。低濃度leukamenin E在較長時間(48 h和72 h)處理細(xì)胞后使細(xì)胞形態(tài)顯著變化，細(xì)胞形成長條狀，偽足數(shù)量顯著減少，偽足拉長，同時，核形態(tài)也發(fā)生明顯變化，“腎形核”數(shù)量增多。眾所周知，微絲、微管和中等纖維3種細(xì)胞骨架均具有維持細(xì)胞及其核形態(tài)的功能，因此這些變化提示leukamenin E可能干擾細(xì)胞骨架的動態(tài)平衡，誘導(dǎo)了細(xì)胞骨架的重排。進(jìn)一步的熒光染色檢測證實了這一推測：胞質(zhì)應(yīng)力纖維數(shù)量減少，微管以及角蛋白纖維在核周聚集，微管和角蛋白中間纖維的排布明顯改變，某些微管和角蛋白中間纖維增粗(見圖5)。流式細(xì)胞術(shù)檢測也證實了HeLa細(xì)胞內(nèi)聚合態(tài)微絲減少，聚合態(tài)的微管增加顯著以及角蛋白纖維聚合小幅上升(見圖6)。該結(jié)果與我們之前報道的對映-貝殼杉烷二萜wangzaozin A對HeLa細(xì)胞骨架重排的誘導(dǎo)作用相類似[11]。但leukamenin E在高濃度(2.0～4.0 μmol/L)條件下處理HepG2、H1299、PLC和HUVEC細(xì)胞24 h，其細(xì)胞形態(tài)變化較小，與低濃度處理后的變化模式完全不同[12,13]。我們發(fā)現(xiàn)高濃度leukamenin E可激活細(xì)胞ERK信號通路，誘導(dǎo)K8-S431/73和K18-S52磷酸化，抑制角蛋白纖維組裝，減少角蛋白纖維數(shù)量[13]。這表明不同濃度的leukamenin E可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞不同的信號通路，引起不同的細(xì)胞響應(yīng)事件。

細(xì)胞骨架深度參與了細(xì)胞分裂和遷移的細(xì)胞功能，與細(xì)胞癌變及惡化密切相關(guān)。細(xì)胞骨架極其調(diào)節(jié)蛋白所組成的動態(tài)纖維網(wǎng)絡(luò)參與了細(xì)胞遷移的過程，表現(xiàn)為連續(xù)的細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞骨架重組并驅(qū)動細(xì)胞定向運動[20]。以細(xì)胞骨架為靶點的化合物(細(xì)胞松弛素類、秋水仙素和長春新堿等)通過影響細(xì)胞骨架組裝阻止細(xì)胞增殖和遷移。我們的研究表明，0.8～1.0 μmol/L leukamenin E可通過干擾HeLa細(xì)胞骨架的動態(tài)平衡，引起胞質(zhì)骨架顯著重排，抑制細(xì)胞遷移，并通過阻滯細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)降低細(xì)胞增殖速率，說明leukamenin E對于抗癌新藥的研究和發(fā)現(xiàn)具有重要價值。