周靜靜，顧云，張龍，張穎，趙超，陸強(qiáng)，張虎，浦躍樸，尹立紅

1.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009

2.漣水縣人民醫(yī)院胸外科，江蘇 漣水 223400

食管癌是一種常見(jiàn)的消化道腫瘤，位居全球癌癥死因順位第六位［1］。近年來(lái)，食管癌的發(fā)病率仍在迅速攀升，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，盡管多學(xué)科治療取得了一定的進(jìn)展，但全球范圍內(nèi)，食管癌患者5年生存率仍＜20%［2］，因此迫切需要探索食管癌新的診斷和治療靶點(diǎn)。非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，根據(jù)長(zhǎng)度分為長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和短鏈非編碼RNA（如microRNA）［3］。其中，lncRNA長(zhǎng)度＞200個(gè)核苷酸，可直接與DNA、RNA和蛋白質(zhì)相互作用［4-5］，影響細(xì)胞增殖、凋亡、周期進(jìn)展、遷移和侵襲，參與包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展［6-7］。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究表明lncRNA在食管癌中異常表達(dá)，作為促癌因子或抑癌因子參與食管癌的發(fā)生發(fā)展，被認(rèn)為是食管癌診斷、治療及預(yù)后相關(guān)的潛在生物標(biāo)志［8-9］。因此，識(shí)別與食管癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的lncRNA 并闡明其調(diào)控機(jī)制對(duì)食管癌的防控具有重要意義。

在人類(lèi)基因組中有大量假基因的存在，它們被認(rèn)為是沒(méi)有功能作用的。然而，最近的研究表明，假基因來(lái)源的lncRNA 通過(guò)DNA、RNA 或蛋白質(zhì)水平上的調(diào)節(jié)在包括癌癥在內(nèi)的多種人類(lèi)疾病中發(fā)揮重要作用［10］。甘油激酶3假基因（glycerol kinase 3 pseudogene，GK3P）是位于人類(lèi)染色體4q32.3 區(qū)域的lncRNA，其親本基因是甘油激酶基因。研究表明，假基因在基因序列與功能上與親本基因具有相似性［11］。Zhou 等［12］發(fā)現(xiàn)，敲低甘油激酶5 基因可通過(guò)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1/硬脂酰輔酶A去飽和酶1 信號(hào)通路誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞周期停滯和凋亡；Yu 等［13］報(bào)道，甘油激酶基因在高級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中低表達(dá)，并且可以促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。這些均提示甘油激酶基因與癌癥進(jìn)展關(guān)系密切。課題組前期基于RNA-Seq、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)lncRNA-GK3P與食管癌患者的總生存率有相關(guān)性，但lncRNA-GK3P在食管癌進(jìn)程中的功能特征尚不明確［14］。因此，本研究在分析食管癌組織及癌旁組織、食管癌細(xì)胞以及永生化正常食管上皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-GK3P表達(dá)水平的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)和siRNA 敲低技術(shù)分別構(gòu)建lncRNA-GK3P過(guò)表達(dá)和敲低的食管癌EC109 細(xì)胞株，以探討lncRNA-GK3P對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 人體組織樣本在江蘇省淮安市漣水縣人民醫(yī)院募集41 例食管癌確診患者，收集其癌組織及配對(duì)癌旁組織樣本；本研究經(jīng)東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：2018ZDKYSB023），并獲得受試者的知情同意。

1.1.2 細(xì)胞人食管鱗癌細(xì)胞株（EC109）和永生化食管上皮細(xì)胞株（Het-1A）均來(lái)自東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 主要儀器與試劑超凈工作臺(tái)（上海凈化儀器廠(chǎng)，中國(guó)），二氧化碳培養(yǎng)箱（Heraeus，德國(guó)），生物圖像導(dǎo)航儀（Olympus，日本），細(xì)胞組織研磨儀（上海凈信，中國(guó)），高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），Tanon凝膠成像及分析系統(tǒng)（上海天能，中國(guó)），酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)）等。

RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），OptiMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），胎牛血清（Gibco，美國(guó)），LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（Thermo，美國(guó)），CCK-8 檢測(cè)試劑盒（上海碧云天，中國(guó)），EdU多重?zé)晒馊旧噭┖校◤V州銳博，中國(guó)），qRT-PCR 試劑盒（Takara，日本），lncRNA-GK3P過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及空載對(duì)照、lncRNA-GK3P敲低siRNA 及空載對(duì)照、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒（南京凱基，中國(guó)），一抗Bax、Bcl2、Cyclin B1、Cyclin E1、β-actin（CST，美國(guó)），羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（武漢愛(ài)博泰克，中國(guó)）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

將EC109分為4組：si-GK3P組（siRNAGK3P轉(zhuǎn)染），si-NC組（siRNAGK3P的空載體對(duì)照），plasmid-GK3P 組（GK3P過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染），plasmid-NC 組（GK3P空載質(zhì)粒對(duì)照）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染EC109 采用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基，Het-1A 采用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。EC109細(xì)胞以3×105個(gè)·孔-1接種于6孔板中，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h，用siRNA 轉(zhuǎn)染構(gòu)建lncRNA-GK3P敲低EC109 細(xì)胞株，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建lncRNA-GK3P過(guò)表達(dá)EC109 細(xì)胞株，分別設(shè)置空載對(duì)照組，轉(zhuǎn)染6 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，qRT-PCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 RNA 提取細(xì)胞RNA 提?。菏占?xì)胞后，加入1 mL Trizol，吹打混勻，60 Hz研磨30 s，室溫靜置5 min；再加入200 μL 三氯甲烷，顛倒混勻，于4℃、12 000×g離心10 min；取上層水相與異丙醇體積比為1∶1 至新EP 管中，顛倒混勻，4℃、12 000×g離心10 min，棄上清；加入體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇洗滌，4℃、8 000×g離心5 min，棄上清；重復(fù)洗滌一次；置室溫干燥10 min后用無(wú)酶水溶解使RNA含量在500 ng·μL-1左右。組織RNA 提?。航M織剪碎體積約為0.5 cm3左右，加1 mL Trizol，60 Hz 研磨5 min；后續(xù)操作同細(xì)胞RNA提取。

1.3.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR 分析以β-actin為內(nèi)參，lncRNA-GK3P基因及內(nèi)參基因引物序列設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。PCR 小管中依次加入5×逆轉(zhuǎn)錄酶混合物4 μL，總RNA 1 μL，補(bǔ)無(wú)酶水至總體積10 μL。反應(yīng)條件：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃保存。

表1 qRT-PCR分析的引物序列Table 1 The primer sequence for qRT-PCR analysis

qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq II 5 μL，前、后引物各0.4 μL，Rox Reference Dye 0.2 μL，cDNA 1 μL，補(bǔ)無(wú)酶水至總體積10 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性階段（95℃、30 s），PCR 反應(yīng)階段（95℃、5 s，60℃、30 s），40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本重復(fù)3 次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算癌組織相對(duì)于癌旁組織中l(wèi)ncRNA-GK3P的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 細(xì)胞活性測(cè)定96 孔板每孔接種8×103個(gè)細(xì)胞，每組6 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)組（si-GK3P 組或plasmid-GK3P組），空載對(duì)照組（si-NC 組或plasmid-NC 組），同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染48 h 后，每孔加入100 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液和10 μL CCK-8 溶液，孵育約2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的光密度值（D）。細(xì)胞活性計(jì)算：細(xì)胞活性=（D實(shí)驗(yàn)組-D空白組）/（D對(duì)照組-D空白組）×100%。

1.3.5 細(xì)胞增殖檢測(cè)細(xì)胞以密度8×103個(gè)·孔-1接種于96 孔板，每組各設(shè)3 個(gè)平行孔，轉(zhuǎn)染48 h 后，按照EdU 多重?zé)晒馊旧噭┖姓f(shuō)明書(shū)進(jìn)行EdU 標(biāo)記、細(xì)胞固定、染色，然后用生物圖像導(dǎo)航儀拍照分析。紅色標(biāo)記增殖期細(xì)胞，藍(lán)色標(biāo)記活細(xì)胞。細(xì)胞增殖率計(jì)算：細(xì)胞增殖率=增殖期細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.6 細(xì)胞周期檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，PBS 洗滌1次，400×g離心5 min，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)·mL-1，取1 mL 單細(xì)胞懸液，離心后棄上清，加入預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇500 μL 固定過(guò)夜。染色前，用PBS 洗去固定液，加入染色工作液（PI∶RnaseA=9∶1），室溫避光30～60 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，采用無(wú)EDTA的胰酶消化細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，400×g離心5 min，收集5×105個(gè)細(xì)胞。加入500 μL 細(xì)胞結(jié)合緩沖液（binding buffer）懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-APC 和5 μL PI（或5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI）進(jìn)行標(biāo)記，避光室溫5～15 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。凋亡率=（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.8 蛋白表達(dá)測(cè)定采用Western blotting 法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白E1（cyclin E1 protein，Cyclin E1）、細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1 protein，Cyclin B1）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（B cell lymphoma 2 protein，Bcl2 蛋白）和Bcl2 家族蛋白（Bcl2 associated X protein，Bax蛋白）的表達(dá)。用細(xì)胞刮板刮取各組細(xì)胞，PBS 洗滌兩次，于4℃，400×g離心5 min，每1×107個(gè)細(xì)胞加入含1 mmol·L-1蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA 裂解液300 μL，60 Hz 研磨2 min，冰上放置30 min。離心后取上清液，BCA 法測(cè)定總蛋白濃度，用5×SDS 上樣緩沖液和無(wú)酶水將蛋白濃度稀釋至2 μg·mL-1，于100℃，煮沸5 min使蛋白變性。Western blotting條件為：濃縮膠電壓為70 V，30 min；分離膠電壓為90 V，60 min；在200 mA 條件下轉(zhuǎn)膜2 h；轉(zhuǎn)移至PVDF 膜后，TBST 洗滌兩次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 稀釋一抗至適當(dāng)濃度，4℃孵育過(guò)夜；TBST 洗6 次后加入稀釋好的二抗，室溫孵育2 h；TBST 洗滌6 次，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。Image J v1.8.0 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 22.0，計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk（S-W）方法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)具有方差齊性。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；采用χ2檢驗(yàn)分析lncRNA-GK3P相對(duì)表達(dá)水平與臨床特征的相關(guān)性；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。采用GraphPad Prism 8.0、Adobe Photoshop CS6 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA-GK3P 在食管癌組織與食管癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

qRT-PCR 結(jié)果顯示，lncRNA-GK3P在食管癌組織中表達(dá)水平為癌旁組織的（2.91±0.61）倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A，t=19.38，P＜0.05）。且相對(duì)于食管上皮細(xì)胞Het-1A，lncRNA-GK3P在食管癌EC109 細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高，表達(dá)水平為前者的（3.15±0.27）倍（圖1B，t=13.06，P＜0.05）。根據(jù)lncRNA-GK3P在食管癌患者組織中相對(duì)表達(dá)水平的均數(shù)（2.91），將表達(dá)水平高于2.91 的患者歸為高表達(dá)組，共23 例；將表達(dá)水平低于2.91的患者歸為低表達(dá)組，共18例。對(duì)lncRNA-GK3P相對(duì)表達(dá)水平與臨床特征之間的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示lncRNA-GK3P表達(dá)水平與性別、年齡、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、吸煙以及飲酒均無(wú)相關(guān)性（表2）。

圖1 lncRNA-GK3P 在組織（A）和細(xì)胞（B）中的相對(duì)表達(dá)水平Figure 1 Relative expression levels of lncRNA-GK3P in selectedtissues (A) and cells (B)

表2 lncRNA-GK3P 表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系分析Table 2 Relationship between the expression level of lncRNA-GK3P and clinical characteristics

2.2 轉(zhuǎn)染效率

qRT-PCR檢測(cè)lncRNA-GK3P敲低和過(guò)表達(dá)后mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，si-GK3P 組細(xì)胞中l(wèi)ncRNAGK3P的mRNA 相對(duì)表達(dá)量是si-NC 組 的42%（圖2A，t=3.46，P＜0.05）；plasmid-GK3P組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-GK3P的mRNA相對(duì)表達(dá)量是plasmid-NC組的328倍（圖2B，t=4.20，P＜0.05）。

圖2 qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率Figure 2 Transfection efficiency by qRT-PCR

2.3 lncRNA-GK3P 對(duì)食管癌細(xì)胞活性和增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示（圖3A、3B），與si-NC組相比，si-GK3P組細(xì)胞活性降低（t=17.00，P＜0.05），與plasmid-NC 相比，plasmid-GK3P組細(xì)胞活性增強(qiáng)（t=11.61，P＜0.05）。EdU 結(jié)果顯示（圖3C、3D），si-GK3P 組和si-NC 組增殖率分別為（27.21±1.11）%、（37.95±0.93）%，敲低lncRNA-GK3P抑制食管癌細(xì)胞增殖（t=15.91，P＜0.05）；plasmid-GK3P 組和plasmid-NC 組增殖率為（37.00±1.71）%、（29.63±1.45）%，過(guò)表達(dá)lncRNA-GK3P促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖（t=7.37，P＜0.05）。

圖3 lncRNA-GK3P 對(duì)EC109 細(xì)胞活性和增殖能力的影響Figure 3 The effect of lncRNA-GK3P on cell viability and proliferation ability of EC109 cells

2.4 lncRNA-GK3P 對(duì)食管癌細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4），si-GK3P 組與si-NC 組G0/G1 期比例分別為（60.29±0.71）%、（57.91±0.77）%（t=3.91，P＜0.05）；S 期比例分別為（26.27±0.75）%、（24.51±0.45）%（t=3.49，P＜0.05）；G2/M 期比例分別為（13.45±0.03）%、（17.57±0.41）%（t=15.53，P＜0.05）。plasmid-GK3P 組與plasmid-NC 組G0/G1 期比例分別為（53.65±0.23）%、（65.65±0.05）%（t=87.71，P＜0.05）；S 期比例分別為（39.39±0.65）%、（25.47±0.23）%（t=34.72，P＜0.05）；G2/M期比例分別為（7.23±0.70）%、（8.91±0.18）%（t=4.03，P＜0.05）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)lncRNA-GK3P 對(duì)EC109 細(xì)胞周期分布的影響Figure 4 Effect of lncRNA-GK3P on cell cycle distribution of EC109 cells by flow cytometry

2.5 lncRNA-GK3P 對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示（圖5），si-GK3P 組與si-NC 組凋亡率分別為（10.19±0.91）%、（7.46±0.18）%（t=5.12，P＜0.05），提示lncRNA-GK3P敲低促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡。plasmid-GK3P 組與plasmid-NC 組凋亡率分別為（5.27±0.07）%、（9.71±0.19）%（t=27.71，P＜0.05），提示lncRNA-GK3P過(guò)表達(dá)抑制食管癌細(xì)胞凋亡。

圖5 lncRNA-GK3P 敲低及過(guò)表達(dá)后細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)分析Figure 5 Apoptosis after lncRNA-GK3P knockdown and overexpression

2.6 lncRNA-GK3P 敲低及過(guò)表達(dá)后Cyclin E1/Cyclin B1/Bcl2/Bax蛋白的表達(dá)情況

Western blotting結(jié)果顯示（見(jiàn)圖6），與si-NC組相比，si-GK3P 組細(xì)胞中Bax 表達(dá)上調(diào)（t=8.07，P＜0.05），Bcl2 表達(dá)下調(diào)（t=10.09，P＜0.05），Cyclin E1 表達(dá)下調(diào)（t=21.92，P＜0.05），Cyclin B1 表達(dá)下調(diào)（t=6.16，P＜0.05）。與plasmid-NC 組相比，plasmid-GK3P 組細(xì)胞中Bax表達(dá)下調(diào)（t=7.99，P＜0.05），Bcl2表達(dá)上調(diào)（t=4.74，P＜0.05），Cyclin E1 表達(dá)上調(diào)（t=8.03，P＜0.05），Cyclin B1表達(dá)上調(diào)（t=6.03，P＜0.05）。

圖6 lncRNA-GK3P 敲低及過(guò)表達(dá)后Cyclin E1/Cyclin B1/Bcl2/Bax的相對(duì)表達(dá)量Figure 6 Relative expressions of Cyclin E1,Cyclin B1,Bcl2,and Bax after lncRNA-GK3P knockdown and overexpression

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)41 例食管癌患者的癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA-GK3P的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，癌組織中l(wèi)ncRNA-GK3P表達(dá)水平顯著上調(diào)；這一結(jié)果同課題組前期生物信息分析結(jié)果一致［14］，表明高表達(dá)的lncRNA-GK3P可能通過(guò)某種調(diào)控機(jī)制影響食管癌進(jìn)程，值得深入分析和研究。根據(jù)lncRNA-GK3P的檢測(cè)結(jié)果將41 例食管癌患者分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，并分析其與食管癌患者臨床特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示lncRNA-GK3P表達(dá)的上調(diào)與性別、年齡、是否吸煙、飲酒及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)。功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，lncRNA-GK3P敲低抑制細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞周期從G0/G1 期進(jìn)入S 期和G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1 期，下調(diào)食管癌細(xì)胞Cyclin B1、Cyclin E1 蛋白表達(dá)，分裂活動(dòng)受阻，細(xì)胞增殖能力降低，Bax 表達(dá)上調(diào)、Bcl2 表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡率增加；lncRNA-GK3P過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞活性增強(qiáng)，細(xì)胞周期G0/G1 期比例減少、S 期比例增多，上調(diào)食管癌細(xì)胞Cyclin B1、Cyclin E1 蛋白表達(dá)，分裂活動(dòng)增強(qiáng)，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，Bax 表達(dá)下調(diào)、Bcl2 表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡率降低。

一些與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切的lncRNA，其表達(dá)水平往往會(huì)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和浸潤(rùn)深度等臨床特征相關(guān)［15］。而本研究結(jié)果顯示lncRNA-GK3P表達(dá)的上調(diào)與性別、年齡、是否吸煙、飲酒及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)。說(shuō)明lncRNA-GK3P的表達(dá)可能不受這些因素的影響。另外，有限的樣本量也有可能致使分析結(jié)果產(chǎn)生一定的偏差。

增殖、凋亡等生物學(xué)功能可以反映腫瘤細(xì)胞惡性程度，本研究針對(duì)lncRNA-GK3P對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響進(jìn)行了初步探索。結(jié)果顯示，lncRNA-GK3P促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡。細(xì)胞周期紊亂是腫瘤細(xì)胞異常增殖的重要前提，細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）是一類(lèi)通過(guò)周期蛋白依賴(lài)性激酶調(diào)控細(xì)胞周期，控制細(xì)胞增殖的蛋白家族［16］，其中，Cyclin E1 是參與調(diào)控細(xì)胞G1/S 期限制性檢測(cè)點(diǎn)的主要蛋白［17］。Cyclin B1是調(diào)控細(xì)胞周期由G2 期進(jìn)入M 期的關(guān)鍵因子，只有Cyclin B1 蛋白表達(dá)量足夠時(shí)才能結(jié)合并激活周期蛋白依賴(lài)性激酶1 進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控作用［18］。腫瘤的發(fā)展過(guò)程中常常出現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白的異常表達(dá)，lncRNA 亦可通過(guò)影響細(xì)胞周期蛋白表達(dá)在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮作用，如lncRNA-00312可下調(diào)Cyclin B1 的表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中G2/M 細(xì)胞周期停滯，抑制肝癌細(xì)胞增殖［19］；敲低lncRNA-00857可下調(diào)CyclinE1 的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-GK3P敲低抑制細(xì)胞周期從G0/G1 期進(jìn)入S 期和G2/M 期，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1 期，下調(diào)食管癌細(xì)胞Cyclin B1、Cyclin E1 蛋白表達(dá)，分裂活動(dòng)受阻，細(xì)胞增殖能力降低。lncRNA-GK3P過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞周期G0/G1 期比例減少，S 期比例增多，上調(diào)食管癌細(xì)胞Cyclin B1、Cyclin E1 蛋白表達(dá)，分裂活動(dòng)增強(qiáng)，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。這一結(jié)果說(shuō)明lncRNA-GK3P可能通過(guò)影響Cyclin B1、E1 蛋白表達(dá)調(diào)控細(xì)胞周期，進(jìn)而促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖。除了細(xì)胞增殖失衡外，細(xì)胞凋亡異常也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。Bcl2基因家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其中Bcl2 蛋白能抑制細(xì)胞色素C 釋放，降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，抑制細(xì)胞凋亡［21］；Bax 也是Bcl2 家族成員，通過(guò)破壞線(xiàn)粒體滲透性、激活Caspase-3 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，Bcl2與Bax 蛋白能夠形成聚合體，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用［22］。有研究表明lncRNA-SNHG5影響B(tài)ax、Bcl2表達(dá)促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡［23］，lncRNA-CCHE1通過(guò)上調(diào)Bcl2、下調(diào)Bax 表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞凋亡［24］。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-GK3P能上調(diào)Bcl2、下調(diào)Bax 表達(dá)，說(shuō)明lncRNA-GK3P調(diào)控Bax、Bcl2的表達(dá)可能是其抑制食管癌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。

綜上所述，本研究初步證實(shí)lncRNA-GK3P在食管癌中高表達(dá)。通過(guò)敲低和過(guò)表達(dá)lncRNA-GK3P證實(shí)，lncRNA-GK3P通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)促進(jìn)EC109 細(xì)胞增殖，通過(guò)調(diào)控Bax、Bcl2 蛋白抑制EC109細(xì)胞凋亡，為lncRNA-GK3P在食管癌中作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)然，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究中納入的食管癌病例數(shù)有限，得到的結(jié)論仍需在更大的樣本量中進(jìn)行驗(yàn)證；其次，本研究只采用了EC109一株食管癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，關(guān)于lncRNAGK3P對(duì)食管癌細(xì)胞功能影響的機(jī)制研究還不夠深入，需要進(jìn)一步探索。