商麗紅，楊玉娥，王 芳，王文霞，哈春芳

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是育齡期婦女常見(jiàn)的激素依賴(lài)性疾病，引起子宮內(nèi)膜異位癥的原因目前尚不清楚，月經(jīng)血回流被認(rèn)為是最有可能引起子宮內(nèi)膜異位癥的原因，其他原因包括遺傳因素、免疫紊亂、雌激素失衡和手術(shù)等[1]。蛋白激酶Cβ1(Protein Kinase Cβ1，PKCβ1)是蛋白激酶家族中的一員，腫瘤學(xué)研究顯示，PKCβ1參與了多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，并在細(xì)胞的增殖、侵襲、黏附等方面發(fā)揮重要作用[2]。絲裂原激活的蛋白激酶激酶1/2(MEK1/2)是MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞核中，級(jí)聯(lián)激活多種蛋白，包括Ras、Raf、MEK和ERK。作為MAPK/ERK信號(hào)中至關(guān)重要的蛋白，MEK1/2被其上游RAF激酶磷酸化并激活。因此，MEK1/2的激活導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路與多樣化的細(xì)胞過(guò)程有關(guān)，包括細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡[3]。本研究通過(guò)檢測(cè)PKCβ1、MEK1/2在子宮內(nèi)膜組織和原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況，分析兩者與增殖侵襲相關(guān)蛋白的關(guān)系，進(jìn)一步驗(yàn)證其在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標(biāo)本獲取：收集2019年5月-2020年9月因卵巢子宮內(nèi)膜異位癥行腹腔鏡手術(shù)，于術(shù)后或術(shù)后經(jīng)病理科證實(shí)為Ems的患者60例，EMs在位內(nèi)膜組與EMs異位內(nèi)膜組各30例，同期因良性卵巢腫瘤行手術(shù)治療的患者30例作為對(duì)照組(正常子宮內(nèi)膜組)。本研究已經(jīng)通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署治療知情同意書(shū)。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)：研究對(duì)象年齡25～35歲，手術(shù)前患者月經(jīng)周期正常，近3個(gè)月均未接受過(guò)激素類(lèi)藥物治療，無(wú)生殖道炎癥及其他婦科疾病等。

1.2 主要試劑：PKCβ1抗體、MEK1/2抗體、MMP9抗體、PCNA抗體、DAB顯色試劑盒、蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化法:組織標(biāo)本由病理科證實(shí)為EMs后于10%甲醛溶液中浸泡過(guò)夜，4%甲醛固定，脫水、石蠟包埋，3～4 μm厚度連續(xù)切片，在70 ℃烤箱過(guò)夜;經(jīng)過(guò)脫蠟，抗原修復(fù)，一抗孵育(PKCβ1、MEK1/2，4 ℃過(guò)夜)，二抗孵育2 h，DAB顯色，酒精梯度脫水，二甲苯透明后用中性樹(shù)膠封片，以PBS作為陰性對(duì)照，應(yīng)用Image pro plus進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.2 原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)：組織于手術(shù)時(shí)用刮勺刮取內(nèi)膜，置于15 mL離心管中(含有配置好的培養(yǎng)基)，再置于冰盒中迅速送往實(shí)驗(yàn)室。用PBS(磷酸鹽緩沖液)沖洗子宮內(nèi)膜組織中的血液成分，用眼科剪將內(nèi)膜剪成約1 mm3大小的組織塊，加入膠原酶Ⅳ在37 ℃溫箱中吹打消化2次，每次10 min，吸取上清液加入離心管，1∶1的比例加入含有血清的培養(yǎng)液終止消化，800 r/min離心，取上清加入60 mm培養(yǎng)皿中，顯微鏡下觀(guān)察后置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 Western-blot檢測(cè)各組蛋白表達(dá)情況：按照凱基全蛋白質(zhì)提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，于酶標(biāo)儀中進(jìn)行蛋白定量，并置于沸水中煮5～10 min至蛋白變性，室溫冷卻后，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?0%SDS分離膠及5%濃縮膠，插入相應(yīng)大小的梳子，加入蛋白樣品及蛋白marker進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，載有蛋白的PVDF膜經(jīng)5%脫脂牛奶封閉90min后，加入PKCβ1、MEK1/2，MMP9，PCNA，β-actin一抗4℃過(guò)夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，后加二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，增強(qiáng)型ECL工作液顯影，于BIO-RAD成像中曝光成像，計(jì)算相應(yīng)的光密度比值。

2 結(jié)果

2.1 PKCβ1、MEK1/2在正常、EMs在位、EMs異位內(nèi)膜中的表達(dá)：PKCβ1、MEK1/2在間質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，見(jiàn)圖1-圖6(封三)。EMs在位內(nèi)膜組、異位組中PKCβ1、MEK1/2的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜組，且異位內(nèi)膜組的表達(dá)高于在位內(nèi)膜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 PKCβ1、MEK1/2在3組子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

2.2 PKCβ1、MEK1/2、MMP9、PCNA在子宮內(nèi)膜異位癥組及正常對(duì)照組間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)：EMs在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中PKCβ1，MEK1/2的表達(dá)高于正常對(duì)照組間質(zhì)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EMs在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中MMP9、PCNA的表達(dá)高于正常對(duì)照組間質(zhì)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示EMs在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的侵襲和增殖性高于正常對(duì)照組間質(zhì)細(xì)胞，見(jiàn)圖7(封三)。

2.3 Pearson相關(guān)性分析：子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞中PKCβ1和MEK1/2的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.84，P<0.05)，PKCβ1和MMP9的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.77，P<0.05)，PKCβ1和PCNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.81，P<0.05)。MEK1/2和MMP9的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.82，P<0.05)，MEK1/2和PCNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.70，P<0.05)，提示PKCβ1和MEK1/2與間質(zhì)細(xì)胞的侵襲和增殖性相關(guān)。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期婦女常見(jiàn)的雌激素依賴(lài)性疾病，其特征是子宮內(nèi)膜樣組織腺體或間質(zhì)出現(xiàn)在子宮腔以外的部位，常伴有瘢痕形成和粘連。但其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。

蛋白激酶C(Protein kinase C)由11個(gè)酯類(lèi)依賴(lài)的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族組成，它們影響多種細(xì)胞功能，包括增殖、分化和凋亡。PKC同工酶在多種癌癥中有表達(dá)變化，參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[4]，PKCβ1參與了細(xì)胞分化增殖凋亡和血管生成等生物學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)激活PKC信號(hào)通路可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。Meola[6]等通過(guò)基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PKCβ1在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中表達(dá)增高。本研究中PKCβ1在子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)高于正常對(duì)照組，且異位內(nèi)膜中的表達(dá)高于在位內(nèi)膜，驗(yàn)證了PKCβ1與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系。進(jìn)一步分離培養(yǎng)原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)Western-blot檢測(cè)了間質(zhì)細(xì)胞中PKCβ1的表達(dá)，結(jié)果表明子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞中PKCβ1的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組間質(zhì)細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

MAPK信號(hào)通路通常由RAS、RAF、MEK、ERK組成，引發(fā)涉及MEK的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而激活ERK，在調(diào)節(jié)真核細(xì)胞的基因表達(dá)中起重要作用，該信號(hào)通路控制著細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和遷移等細(xì)胞過(guò)程[7]。MAPK參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在卵巢癌[8]中MAPK被異常激活，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的異常增殖、侵襲和黏附。多項(xiàng)研究表明，MAPK在子宮內(nèi)膜異位癥中被激活，參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制，子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和存活與MAPK信號(hào)通路的異常激活有關(guān)[9]。在子宮內(nèi)膜異位癥中MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的調(diào)節(jié)中起著重要作用，可能通過(guò)增強(qiáng)子宮內(nèi)膜異位間質(zhì)細(xì)胞在體外纖維化微環(huán)境中的增殖和存活來(lái)支持子宮內(nèi)膜異位病變的生長(zhǎng)[10]。因此MAPK信號(hào)通路的組成性激活參與多種癌癥的發(fā)生，而MEK1/2是MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要組成部分，在MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[11]，主要功能是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化。在本研究中發(fā)現(xiàn)MEK1/2在子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)高于正常對(duì)照組，且異位內(nèi)膜中的表達(dá)高于在位內(nèi)膜，子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞中MEK1/2的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組間質(zhì)細(xì)胞。

基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)是介導(dǎo)細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵酶，子宮內(nèi)膜組織和外周血中MMP9水平的改變是EMs發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素[12]。研究發(fā)現(xiàn)MMP9在EMs始終高表達(dá)[13]，與沒(méi)有子宮內(nèi)膜異位癥的婦女子宮內(nèi)膜相比，MMP9的含量更高，具有更強(qiáng)的侵襲性[14]。多項(xiàng)研究已經(jīng)檢測(cè)到與健康對(duì)照組相比，子宮內(nèi)膜異位癥婦女腹水、血液、血漿、腹腔液、血清和尿液中MMP9蛋白水平顯著升高[15]。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是細(xì)胞核中的一種酸性蛋白，是合成所必需的輔酶，PCNA水平代表細(xì)胞的增殖活性。本研究也發(fā)現(xiàn)MMP9、PCNA在子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞中存在高表達(dá)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MMP9、PCNA與PKCβ1，MEK1/2存在正相關(guān)關(guān)系，但其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。