王 玥，李 強，任欣欣，孫玉華，劉國權(quán)

（蚌埠醫(yī)學(xué)院 1.檢驗系生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，2.安徽省癌癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，3.生命科學(xué)院細胞生物學(xué)系，安徽 蚌埠 2 33030）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，占全世界所有癌癥2.1%，其中女性患者占大多數(shù)［1］。甲狀腺癌中最常見的組織類型是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC），其總體預(yù)后最好，最常見的轉(zhuǎn)移部位是頸部淋巴結(jié)［2］。甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展相對緩慢，外科手術(shù)為預(yù)后較好的治療手段，但由于患者早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時大多已經(jīng)發(fā)生遠處器官或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且術(shù)后極易復(fù)發(fā)［3］。因此篩選新的診斷標(biāo)記物對于甲狀腺乳頭狀癌的早期診斷和治療至關(guān)重要。

硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1）是催化飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）向單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）轉(zhuǎn) 化 的 關(guān) 鍵 酶［4］。研 究 表 明，SCD1在多種惡性腫瘤中高表達，并且參與腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程，如乳腺癌、腎癌、卵巢癌和非小細胞肺癌等［5-8］。有報道顯示，SCD1在甲狀腺乳頭狀癌組織中同樣呈高表達［9］，然而SCD1對于甲狀腺癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制尚未得到充分研究。因此，本研究探討了SCD1對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）的影響，為甲狀腺乳頭狀癌的靶向治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人甲狀腺濾泡上皮正常細胞Nthy-ori 3-1和甲狀腺乳頭狀癌細胞株TPC1、BCPAP、K 1均購自合肥維三生物科技有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，si-NC和si-SCD1購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗、極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、CCK-8溶液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Lipo8000以及cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，實時熒光定量PCR試劑2×Real Star Green Fast Mixture（with ROXⅡ）購自GenStar康潤生物有限公司，一抗（SCD1，N-cadherin，Snail，vimentin，E-cadherin，β-actin）購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司，Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠購自Conring公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Nthy-ori 3-1細胞和TPC1細胞，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BCPAP細胞和K1細胞，于37℃、5%CO2濃度條件的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，所有實驗細胞處于對數(shù)生長期。待細胞融合度達到70%～80%時，采用Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑對細胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染說明書進行，24 h后收集細胞進行相應(yīng)檢測。細胞分為3組，分別是空白對照組（Control）、對照干擾組（si-NC）和干擾SCD1組（si-SCD1），三組分別設(shè)置3個復(fù)孔，重復(fù)3次試驗。

1.3 qRT-PCR實驗檢測SCD1、N-cadherin、Snail、vimentin和E-cadherin mRNA表達水平

分別收集轉(zhuǎn)染后各組TPC1細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，并用紫外分光光度計檢測其濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并調(diào)整cDNA濃度，以此cDNA為模板進行PCR擴增。擴增條件為：95℃2 min，95℃15 s，60℃30 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，最終Ct值采用2-ΔΔCt方法進行分析，引物序列見表1。所有實驗均進行3次。

表1 PCR擴增引物序列Tab 1 PCR amplification primer sequences

1.4 Western blot實 驗 檢 測SCD1、N-cadherin、Snail、vimentin和E-cadherin蛋白表達水平

收集轉(zhuǎn)染24 h后的各組細胞，向細胞中加入RIPA裂解液，4℃放置30 min后提取細胞總蛋白，BCA法測定濃度，平衡每孔的上樣量為20μg/孔，于10%的SDS-PAGE上進行電泳分離，使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一 抗（SCD1、N-cadherin、Snail、vimentin、E-cadherin、β-actin按1∶1 000稀釋），于4℃孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次，加入二抗（1∶4 000），室溫避光孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次。采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影拍照。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力

將處于對數(shù)生長期的細胞消化計數(shù)，調(diào)整細胞密度為6 000個/孔的細胞懸液，取100μL接種至96孔板。待細胞密度達到50%時進行轉(zhuǎn)染，分別在轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h時，向每孔中加入10μL CCK-8溶液，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，最后使用酶標(biāo)儀檢測450 nm時的OD值，繪制生長曲線。每次實驗重復(fù)3次，每組設(shè)定3個復(fù)孔。

1.6 Transwell小室法檢測細胞遷移能力

將轉(zhuǎn)染后的各組細胞分別消化計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基重懸成單細胞，以6×104個/小室的細胞密度接種于Transwell上室，下室加入含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用棉簽擦去未穿過底膜的細胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.25%結(jié)晶紫染色30 min，洗凈晾干，在倒置顯微鏡下觀察拍照，統(tǒng)計跨膜細胞數(shù)并計算平均值。遷移抑制率（%）=（1?處理組遷移細胞個數(shù)/對照組遷移細胞個數(shù)）×100%。

1.7 Transwell小室法檢測細胞侵襲能力

將Materigel膠與無血清1640培養(yǎng)基按1∶8的比例稀釋，在Transwell小室中包被Materigel基質(zhì)膠，于37℃、1 h凝固后風(fēng)干，后續(xù)步驟同遷移實驗。侵襲抑制率（%）=（1?處理組侵襲細胞個數(shù)/對照組侵襲細胞個數(shù)）×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCD1在不同甲狀腺癌細胞系中的表達水平

Western blot實驗結(jié)果表明，與人甲狀腺濾泡上皮正常細胞Nthy-ori 3-1相比，甲狀腺乳頭狀癌BCPAP、K1和TPC1細胞中的SCD1表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2、圖1）。由于TPC1細胞中SCD1表達量最高，因此選擇TPC1細胞進行后續(xù)研究。

表2 SCD1在不同甲狀腺癌細胞系中的表達水平（n=3，±s）Tab 2 Expression of SCD1 in different thyroid cancer cell lines（n=3，±s）

表2 SCD1在不同甲狀腺癌細胞系中的表達水平（n=3，±s）Tab 2 Expression of SCD1 in different thyroid cancer cell lines（n=3，±s）

注：與Nthy-ori3-1細胞相比，*P＜0.05。

組別Nthy?ori3?1 BCPAP K1 TPC1 FP SCD1 0.55±0.30 0.65±0.28*0.84±0.39*1.22±0.32*218.184 0.000

圖1 SCD1在不同甲狀腺癌細胞系中的表達水平Fig 1 Expression of SCD1 in different thyroid cancer cell lines

2.2 qRT-PCR和Western blot實驗檢測細胞中SCD1的表達

采用qRT-PCR和Western blot實驗對SCD1的干擾效率進行驗證。結(jié)果顯示，與Control組（空白對照組）和si-NC組（對照干擾組）比較，si-SCD1組細胞中SCD1 mRNA和蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3、圖2）。表明siRNA可以有效干擾SCD1的表達。

表3 TPC1細胞中SCD1 mRNA及蛋白表達水平（n=3，±s）Tab 3 Expression level of SCD1 m RNA and protein in TPC1 cells（n=3，±s）

表3 TPC1細胞中SCD1 mRNA及蛋白表達水平（n=3，±s）Tab 3 Expression level of SCD1 m RNA and protein in TPC1 cells（n=3，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與對照干擾組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組對照干擾組干擾SCD1組FP SCD1 mRNA 1.01±0.03 0.94±0.07 0.26±0.06*#156.850 0.000 SCD1蛋白0.96±0.11 0.92±0.13 0.43±0.04*#26.168 0.001

圖2 TPC1細胞中SCD1 mRNA及蛋白表達水平Fig 2 Expression level of SCD1 mRNA and protein in TPC1 cells

2.3 干擾SCD1對TPC1細胞增殖能力的影響

CCK-8法檢測細胞增殖的結(jié)果顯示，與Control組和si-NC組比較，si-SCD1組TPC1細胞在24、48、72 h時OD值明顯減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表4）。表明干擾SCD1能夠抑制TPC1細胞的增殖。

表4 干擾SCD1對TPC1細胞增殖能力的影響（n=3，±s）Tab 4 The influence of disturbing SCD1 on proliferation of TPC1 cells（n=3，±s）

表4 干擾SCD1對TPC1細胞增殖能力的影響（n=3，±s）Tab 4 The influence of disturbing SCD1 on proliferation of TPC1 cells（n=3，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與對照干擾組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組對照干擾組干擾SCD1組FP 0 h 0.07±0.05 0.07±0.05 0.10±0.01 0.500 0.630 24 h 0.37±0.01 0.37±0.04 0.13±0.01*#96.957 0.000 48 h 0.67±0.24 0.61±0.74 0.24±0.41*#63.993 0.000 72 h 1.03±0.65 1.15±0.17 0.41±0.06*#161.719 0.000

2.4 干擾SCD1對TPC1細胞遷移及侵襲能力的影響

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，與Control組和si-NC組比較，si-SCD1組TPC1細胞的遷移能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表5、圖3A）。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，與Control組和si-NC組比較，si-SCD1組細胞的侵襲能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表5、圖3B）。說明干擾SCD1能夠抑制TPC1細胞的遷移和侵襲。

圖3 Transwell實驗檢測干擾SCD1后對T PC1細胞遷移及侵襲能力的影響Fig 3 The migration and invasion of TPC1 cells after interfering SCD1 by Transwell assay

2.5 干擾SCD1對TPC1細胞EMT的影響

表5干擾SCD1對TPC1細胞遷移及侵襲能力影響（n=3，±s）Tab 5 Effects of interfering SCD1 on migration and invasion of TPC1 cells（n=3，±s）

表5干擾SCD1對TPC1細胞遷移及侵襲能力影響（n=3，±s）Tab 5 Effects of interfering SCD1 on migration and invasion of TPC1 cells（n=3，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與對照干擾組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組對照干擾組干擾SCD1組FP細胞遷移率99.67±7.57 83.33±11.68 22.33±4.04*#71.202 0.000細胞侵襲率98.67±4.93 83.67±8.50 31.33±7.23*#75.479 0.000

采用qRT-PCR和Western blot法檢測EMT標(biāo)志蛋白的表達情況。qRT-PCR結(jié)果顯示，干擾SCD1后TPC1細胞N-cadherin、vimentin和Snail的表達明顯降低，顯著低于空白對照組和對照干擾組，而上皮細胞的標(biāo)志物E-cadherin的表達明顯升高，差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（P＜0.05，表6、圖4A）。Western blot結(jié)果同樣證明了，干擾SCD1在TPC1細胞中能下調(diào)N-cadherin、vimentin和Snail的表達，且上調(diào)E-cadherin的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表7、圖4B）。結(jié)果表明SCD1通過調(diào)控EMT途徑進而促進了TPC1細胞的增殖、遷移和侵襲。

表6 干擾SCD1后對N-cadherin、vimentin、Snail和E-cad?herin m RNA的影響（n=3，±s）Tab 6 Influence on N-cadherin，vimentin，Snail and E-cad?herin mRNA after interfering with SCD1（n=3，±s）

表6 干擾SCD1后對N-cadherin、vimentin、Snail和E-cad?herin m RNA的影響（n=3，±s）Tab 6 Influence on N-cadherin，vimentin，Snail and E-cad?herin mRNA after interfering with SCD1（n=3，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與對照干擾組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組對照干擾組干擾SCD1組FP N?cadherin 0.97±0.02 0.97±0.09 0.55±0.05*#45.847 0.000 Snail 0.99±0.48 0.98±0.15 0.450.78*#28.282 0.001 Vimentin 0.94±0.08 0.88±0.03 0.67±0.09*#12.239 0.008 E?cadherin 1.02±0.09 1.05±0.06 1.70±0.17*#33.814 0.001

表7 干擾SCD1后對N-cadherin、vimentin、Snail和E-cadherin蛋白的影響（n=3，±s）Tab 7 Effects of interfering with SCD1 on N-cadherin，vimentin，Snail and E-cadherin proteins（n=3，±s）

表7 干擾SCD1后對N-cadherin、vimentin、Snail和E-cadherin蛋白的影響（n=3，±s）Tab 7 Effects of interfering with SCD1 on N-cadherin，vimentin，Snail and E-cadherin proteins（n=3，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與對照干擾組比較，#P＜0.05。

E?cadherin 0.63±0.13 0.60±0.13 1.12±0.09*#17.663 0.003組別空白對照組對照干擾組干擾SCD1組FP N?cadherin 1.08±0.16 0.10±0.13 0.47±0.10*#18.87 0.003 Snail 0.97±0.02 0.89±0.05 0.51±0.02*#189.97 0.000 Vimentin 0.94±0.23 0.940.24 0.39±0.12*#7.403 0.024

圖4 qRT-PCR和Western blot實驗檢測干擾SCD1后EMT相關(guān)蛋白表達情況Fig 4 q RT-PCR and Wester n blot for detecting expr essions of EMT-related pr oteins after inter fer ing SCD 1

3 討論

乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌和未分化癌是甲狀腺癌的4種病理類型，其中甲狀腺乳頭狀癌最常見［10］。盡管乳頭狀癌預(yù)后較佳，但容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而嚴(yán)重影響預(yù)后［11］。因此，探究甲狀腺癌乳頭狀癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找治療甲狀腺癌乳頭狀癌的分子診斷靶點具有重要意義。

越來越多的研究表明，SCD1與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［12］。有研究發(fā)現(xiàn)，SCD1在胃癌組織中表達上調(diào)，并且能夠促進胃癌細胞的增殖和侵襲能力以及EMT過程［13］。黃光明等［14］研究證實，SCD1可以通過下調(diào)AMPK途徑負(fù)性調(diào)節(jié)自噬，從而減少肝癌細胞的凋亡率，促進其轉(zhuǎn)移。Li［15］等研究顯示，SCD1在子宮內(nèi)膜癌中高表達，靶向敲除SCD1和使用SCD1抑制劑均能抑制子宮內(nèi)膜癌細胞系A(chǔ)N 3CA的增殖，促進其凋亡。然而關(guān)于SCD1對甲狀腺癌細胞的具體生物學(xué)影響和作用機制尚未見有關(guān)報道。因此，本研究利用siRNA技術(shù)干擾甲狀腺乳頭狀癌TPC1細胞中SCD1的表達，并通過CCK-8法和Transwell小室實驗證實，干擾SCD1后TPC1細胞的增殖、遷移及侵襲能力明顯降低。表明SCD1與甲狀腺乳頭狀癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，SCD1可能是甲狀腺乳頭狀癌潛在的診斷標(biāo)記物和治療靶點。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細胞通過一定的程序向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過程，其與腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［16］。EMT的生物學(xué)特性主要表現(xiàn)在細胞極性的喪失和間質(zhì)性質(zhì)的獲得，腫瘤細胞能夠使上皮標(biāo)記物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）失去其功能而表達下調(diào)，使間質(zhì)標(biāo)記物波形蛋白（Vimentin）和N-鈣粘蛋白（N-cadherin）等表達上調(diào)，導(dǎo)致上皮細胞極性喪失，細胞黏附能力下降，進而增強腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［17，18］。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail能夠抑制E-cadherin基因的表達并且誘導(dǎo)EMT的發(fā)生［19］。有研究表明，EMT參與了多種腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，如膀胱癌、肺癌和結(jié)腸癌等［20-22］。然而，關(guān)于甲狀腺乳頭狀癌上皮細胞間質(zhì)化的研究還不夠深入。為了探究SCD1是否通過促進EMT途徑進而促進了甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，本研究將si-SCD1轉(zhuǎn)染TPC1細胞，采用qRT-PCR和Western blot方法檢測細胞EMT標(biāo)志 物E-cadherin、Vimentin、Snail和N-cadherin的mRNA和蛋白表達水平，結(jié)果顯示干擾SCD1能明顯上調(diào)E-cadherin的表達，而降低Vimentin、Snail和N-cadherin的表達，這一結(jié)果證實干擾SCD1能夠抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的EMT過程，從而抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示干擾SCD1能通過抑制EMT信號通路進而抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、遷移及侵襲。本研究提示SCD1可能是甲狀腺乳頭狀癌診斷和治療的新靶點，為尋找甲狀腺乳頭狀癌的靶向藥物提供了實驗依據(jù)。

作者貢獻度說明：

劉國權(quán)：設(shè)計實驗；王玥：完成實驗、處理數(shù)據(jù)和撰寫論文；李強：修改論文；任欣欣、孫玉華：完成部分實驗。