周 婧，丁 麗，鄧 坤，章 燕，李廣兵，朱 濤，周 巧，王 堃，張 宸

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥，230061；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 2 30038；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 2 30038）

心肌缺血是指心肌因灌注的血液減少，供氧降低，導(dǎo)致心臟的供血供氧減少進(jìn)而使心肌不能正常進(jìn)行能量代謝，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)。其中，冠狀動(dòng)脈的阻塞造成心肌的缺血缺氧是心肌缺血疾病的主要原因。改善缺血心肌的能量代謝是治療心肌缺血的重要作用靶點(diǎn)［1］。作為葡萄糖酵解的產(chǎn)物之一的游離脂肪FFA是心肌能量代謝標(biāo)記物，心肌缺血時(shí)，其在心肌細(xì)胞內(nèi)過(guò)度堆積，進(jìn)而引起細(xì)胞能量代謝的紊亂、細(xì)胞的凋亡［2］。心肌能量代謝過(guò)程中的包括FFA在內(nèi)的各種底物經(jīng)氧化磷酸化形成ATP，為心肌細(xì)胞代謝提供能量［3］。Na+-K+-ATP酶廣泛存在于各器官以及組織細(xì)胞膜表面的酶蛋白，通過(guò)水解ATP時(shí)所釋放的能量，參與心肌能量代謝，與心肌細(xì)胞能量代謝的過(guò)程密切相關(guān)［4］。相關(guān)臨床及循證研究表明，針灸可改善缺血心肌，對(duì)缺血心肌產(chǎn)生保護(hù)作用，改善能量代謝［5-7］，但對(duì)于手厥陰心包經(jīng)，尤其對(duì)于內(nèi)關(guān)及其善治急性疾病之郄穴郄門的相關(guān)研究較少，此外眾多研究大多從改善心肌缺血角度出發(fā)，進(jìn)而探討通過(guò)改善缺血而改善心肌能量代謝，本研究通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈制備急性心肌缺血大鼠模型，研究電針針刺手厥陰心包經(jīng)腧穴中的內(nèi)關(guān)及郄門穴對(duì)急性心肌缺血大鼠模型心肌能量代謝的影響，從心肌能量代謝過(guò)程中心肌能量的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化、儲(chǔ)存等角度，研究缺血心肌能量代謝過(guò)程中的相關(guān)環(huán)節(jié)指標(biāo)，探討針刺治療在缺血心肌能量代謝中的重要作用，為針灸臨床治療心肌缺血、改善心肌能量代謝提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

標(biāo)準(zhǔn)Spargue-Ddwely（SD）雄性大鼠40只；由安徽醫(yī)科大學(xué)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）提供，生產(chǎn)許可證為：SCXK（皖）2011-002，按照標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一喂養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房?jī)?nèi)，適應(yīng)性飼養(yǎng)前大鼠體重約為190～250 g，光照大約14 h/d，溫度控制于20℃～26℃，相對(duì)濕度達(dá)40%～70%。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 儀器與試劑

XD7100型心電圖記錄儀（上海醫(yī)用電子儀器）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Heal Forc）；切片機(jī)（Leica RM 2135德國(guó)）；酶標(biāo)儀（BioTeK）；移液器（Thermo Finnpipette美國(guó)）。

全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科技）；切片漂烘儀（科力飛QP-B合肥電子研究所）；石蠟包埋機(jī)（亞光YB-7B湖北 孝感）等；FFA、ATP酶、Na+-K+-ATP酶（南京建成生物工程研究所）；蘇木素，伊紅（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法與分組

1.3.1 動(dòng)物分組 40只標(biāo)準(zhǔn)SD大鼠于實(shí)驗(yàn)前統(tǒng)一適應(yīng)性喂養(yǎng)，1周后將其隨機(jī)分為4組，每組均10只，稱重并進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)記，即假手術(shù)組、模型組、內(nèi)關(guān)組、郄門組。

1.3.2 造模及模型鑒定 采用冠脈結(jié)扎的方法制備急性心肌缺血大鼠模型［8］。造模開(kāi)始前禁食不禁水12 h，各組大鼠稱重，記錄，大鼠腹腔注射3.5%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉后，將大鼠以仰臥位固定于手術(shù)操作臺(tái)，密觀大鼠的生命體征，待其生命體征平穩(wěn)后，記錄下術(shù)前各組大鼠的心電圖。左胸手術(shù)區(qū)備皮、消毒后剪開(kāi)術(shù)部的皮膚，鈍性分離打開(kāi)胸腔后迅速擠壓右胸，輕壓胸壁并快速擠出心臟，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈以備制心肌急性缺血模型。監(jiān)測(cè)大鼠心電圖的動(dòng)態(tài)變化，記錄心電圖，觀察Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以ST段持續(xù)性抬高作為模型成功的標(biāo)志。假手術(shù)組各大鼠只穿線不結(jié)扎。

1.4 穴位選取與電針針刺方法

參照人體經(jīng)脈循行路線，結(jié)合《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［9］關(guān)于大鼠針灸穴位定位標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)量后折算確定大鼠穴位定位為：內(nèi)關(guān)穴位于前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約3 mm的尺橈骨縫間；郄門：前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約6 mm的尺橈骨縫間。

造模成功后，選擇各項(xiàng)生理指標(biāo)平穩(wěn)的時(shí)間點(diǎn)作為0 min開(kāi)始標(biāo)記，分別針刺內(nèi)關(guān)組、郄門組，并接電針。取穴為雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴、雙側(cè)郄門穴。將同側(cè)電極一端接在腧穴針柄上，一端接在大鼠尾部，防止電流過(guò)心。采用0.25 mm×50 mm銀質(zhì)毫針垂直刺入斜刺2 mm，接電針儀，疏密波，頻率2～50 Hz，強(qiáng)度1～2 mA，強(qiáng)度以大鼠肢體微微顫動(dòng)為宜，留針20 min，每天一次（上午8：00～11：00）。針刺期間，模型組、假手術(shù)組不做電針處理，但每天在同一時(shí)間，使用與針刺組相同的方法進(jìn)行抓取和固定。每天1次，連續(xù)14 d。

1.5 標(biāo)本采集及檢測(cè)方法

電針治療14 d后各組大鼠開(kāi)胸截取心肌組織標(biāo)本，立即置于液氮中冷凍?80℃中保存，測(cè)定時(shí)取出。

1.5.1 心肌病理學(xué) 將取出的心臟標(biāo)本于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后制成數(shù)張4μm厚切片，HE染色，觀察心肌組織病理學(xué)改變。

1.5.2 血清FFA、ATP含量及Na+-K+-ATP酶活力測(cè)定 分別選取心肌組織200 mg，制備10%的組織勻漿，3 500 r/min，離心10 min，取上清液，測(cè)游離脂肪酸FFA、ATP含量及Na+-K+-ATP酶活力，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（±s）表示。符合正態(tài)分布、方差齊性資料使用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不符合方差齊性的資料，使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。兩組間比較用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，假手術(shù)組無(wú)大鼠死亡，10只大鼠全部存活；模型組與內(nèi)關(guān)組各死亡2只大鼠，剩余8只；郄門組1只大鼠死亡，剩余9只；造模后心電圖表現(xiàn)為ST段持續(xù)性抬高，提示急性心肌缺血模型大鼠造模成功，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠造模前后心電圖的變化Fig 1 Changes of EKG in rats before and after modeling

2.2 對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌病理學(xué)的影響

HE染色結(jié)果可見(jiàn)，假手術(shù)組大鼠心肌纖維緊湊，排列整齊，組織間隙未見(jiàn)明顯增寬等病理改變，細(xì)胞核清晰，呈圓形或橢圓形。模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，組織間隙增寬，細(xì)胞核形態(tài)顯示不清，分散，部分核減少，甚至消失，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示本實(shí)驗(yàn)冠脈結(jié)扎致心肌梗死大鼠模型建立成功；內(nèi)關(guān)組、郄門組以上形態(tài)學(xué)改變均有不同程度改善。見(jiàn)圖2。

圖2 光鏡下各組心肌組織病理學(xué)改變（HE染色，200×）Fig 2 Histopathological changes of myocardium in each group under light microscope（HE staining，200×）

2.3 對(duì)急性心肌缺血大鼠FFA的影響

與假手術(shù)組相比，模型組、郄門組、內(nèi)關(guān)組中FFA含量增多，其中模型組、郄門組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，郄門組、內(nèi)關(guān)組FFA含量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠FFA含量的比較（±s）Tab 1 Comparison of the contents of FFA in each group ofrats（±s）

表1 各組大鼠FFA含量的比較（±s）Tab 1 Comparison of the contents of FFA in each group ofrats（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

FFA（μmol/g）171.32±12.82 241.54±20.26*199.90±27.16*#184.79±16.34#20.211＜0.001 n組別假手術(shù)組模型組郄門組內(nèi)關(guān)組10 898 FP

2.4 對(duì)急性心肌缺血大鼠ATP含量的影響

與假手術(shù)組相比，模型組、郄門組、內(nèi)關(guān)組ATP含量減少，其中模型組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，郄門組、內(nèi)關(guān)組ATP含量增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠ATP含量的比較（±s）Tab 2 Comparison of the contents of ATP in each group of rats（±s）

表2 各組大鼠ATP含量的比較（±s）Tab 2 Comparison of the contents of ATP in each group of rats（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

ATP（μmol/g）217.66±49.64 163.80±15.94*202.69±33.92△201.01±33.51△3.399 0.030 n組別假手術(shù)組模型組郄門組內(nèi)關(guān)組10 898 FP

2.5 對(duì)急性心肌缺血大鼠Na+-K+-ATP酶活力的影響

與假手術(shù)組相比，模型組、郄門組、內(nèi)關(guān)組Na+-K+-ATP酶活力降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，郄門組、內(nèi)關(guān)組Na+-K+-ATP酶活力增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠Na+?K+?ATP酶活力的比較（±s）Tab 3 Comparison of NA+?K+?ATP enzyme activity in each group of rats（±s）

表3 各組大鼠Na+?K+?ATP酶活力的比較（±s）Tab 3 Comparison of NA+?K+?ATP enzyme activity in each group of rats（±s）

注：與假手術(shù)組比較，▲P＜0.05，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，#P＜0.01。

Na+-K+-ATP（μmol/mg）8.29±0.47 6.41±1.02*7.23±0.70*△7.53±0.83▲#9.174＜0.001 n組別假手術(shù)組模型組郄門組內(nèi)關(guān)組10 898 FP

3 討論

急性心肌缺血主要是因冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性的缺血缺氧進(jìn)而造成心肌壞死，具有發(fā)病急、發(fā)病快、致殘及死亡率高的特點(diǎn)，威脅人類健康［10］。急性心肌缺血后，心臟血液灌注減少，供血供氧減少，心肌組織細(xì)胞壞死，能量代謝出現(xiàn)異常，影響心臟正常工作。傳統(tǒng)西醫(yī)在治療心肌缺血，改善能量代謝方面，發(fā)揮著重要的作用，但目前臨床可用的相關(guān)針對(duì)性藥物少，作用不明顯。缺血性心臟病屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇，其病機(jī)責(zé)之為“本虛標(biāo)實(shí)”，主要以益氣溫陽(yáng)，活血化瘀，豁痰通絡(luò)為治療大法。針刺作為祖國(guó)醫(yī)學(xué)的瑰寶，在長(zhǎng)期的醫(yī)療實(shí)踐中積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，在治療心血管疾病中療效顯著。大量臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，針刺在改善缺血心肌，保護(hù)缺血心肌等方面發(fā)揮了重要作用。

正常心肌能量代謝過(guò)程主要涉及底物的利用、底物氧化磷酸化以及ATP的轉(zhuǎn)運(yùn)利用三個(gè)方面［11］。急性心肌缺血時(shí)，涉及能量代謝過(guò)程中任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題都會(huì)對(duì)心肌正常的能量代謝產(chǎn)生影響。心肌能量代謝過(guò)程中的主要底物是FFA，F(xiàn)FA和葡萄糖等其他底物一起在線粒體中合成乙酰輔酶A并進(jìn)入三羧酸循環(huán)氧化，進(jìn)行氧化磷酸化，最終釋放大量的ATP，為心肌收縮提供大量能量［12］，為維持心臟正常生理功能活動(dòng)提供直接能量來(lái)源。Na+-K+-ATP等是細(xì)胞膜的重要蛋白酶之一，與Ca2+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP酶等共同參與調(diào)節(jié)Ca2+濃度的穩(wěn)定，使心肌線粒體維持正常生理活動(dòng)［13］，常作為判斷能量代謝是否紊亂及組織損傷恢復(fù)能力的指標(biāo)之一［14］。心肌急性缺血后，作為心肌能量底物之一的FFA優(yōu)先轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)先利用葡萄糖，導(dǎo)致FFA在心肌組織和血清中大量堆積［11］，此時(shí)心肌細(xì)胞能量獲取途徑發(fā)生改變，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟菬o(wú)氧酵解，ATP含量減少［15］，進(jìn)而Na+-K+-ATP酶活性受抑制，造成鈣超載［16］，進(jìn)一步加重線粒體損傷，惡性循環(huán)造成心肌能量代謝紊亂，心肌細(xì)胞受損。

針刺作為祖國(guó)醫(yī)學(xué)重要的治療手段之一，可降低心肌耗氧，增加冠脈血流等，從而發(fā)揮保護(hù)缺血心肌的作用，治療心肌缺血性心臟疾?。?7，18］?！鹅`樞·經(jīng)脈》記載：“心主手厥陰心包絡(luò)之脈，起于胸中，出屬心包絡(luò)，下膈而歷絡(luò)三焦……是主脈所生病者，煩心、心痛......”?！鹅`樞·邪客》中記載：“諸邪之在于心者，皆在于心之包絡(luò)，包絡(luò)者，心主之脈也”，提出“心包代心受邪”的觀點(diǎn)。根據(jù)“經(jīng)脈所過(guò)，主治所及”的理論，心包經(jīng)腧穴可治療心的疾病?！夺樉募滓医?jīng)》中記載曰：＂急則必暴痛，而虛則煩心，也惕惕不能動(dòng)、失智者，內(nèi)關(guān)主之也……”?！靶男貎?nèi)關(guān)謀”，內(nèi)關(guān)為手厥陰經(jīng)絡(luò)穴、八脈交會(huì)穴之一，通于陰維脈，是治療心胸疾病的首選要穴，也是治療缺血性心臟病的常用腧穴［19，21］，可是目前治療缺血性心臟病常用腧穴中使用頻率最高的心包經(jīng)腧穴［22］。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究顯示，針刺內(nèi)關(guān)穴，可調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注大鼠的糖代謝及能量代謝［23］，逆轉(zhuǎn)缺血心肌的ATP敏感型鉀通道以及其結(jié)合蛋白與蛋白激酶［24］，保護(hù)缺血心肌。郄門穴是手厥陰心包經(jīng)的郄穴，“郄主急”，具有緩急止痛和急救的作用?！夺樉募滓医?jīng)》記載：“郄門，手心主郄……治心痛”。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，心肌缺血時(shí)，通過(guò)針刺郄門穴可支配心臟的傳出神經(jīng)，可影響心肌細(xì)胞電活動(dòng)、心肌收縮、抑制心肌細(xì)胞凋亡、減輕Ca2+超載以上調(diào)鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)，從而改善缺血心肌，保護(hù)心肌細(xì)胞［25，26］。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，電針針刺手厥陰心包經(jīng)之腧穴內(nèi)關(guān)、郄門，可改善缺血心肌的細(xì)胞損傷。內(nèi)關(guān)組、郄門組經(jīng)電針針刺干預(yù)后，與模型組內(nèi)大鼠體內(nèi)FFA含量增多，ATP含量降低，Na+-K+-ATP酶活性降低相比，內(nèi)關(guān)組、郄門組其FFA含量減少，ATP含量增多，Na+-K+-ATP酶活性增高。綜上，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：電針針刺手厥陰心包經(jīng)之內(nèi)關(guān)、郄門穴可以不同程度地改善心肌缺血狀態(tài)，減輕急性心肌缺血后梗死心肌的損傷，保護(hù)缺血的心肌，同時(shí)改善缺血心肌能量代謝。本實(shí)驗(yàn)從代謝組學(xué)角度觀察了電針針刺對(duì)缺血心肌及其心肌能量代謝的影響，但由于實(shí)驗(yàn)樣本量少、針刺干預(yù)機(jī)制復(fù)雜多樣，非單一因素決定等相關(guān)因素的限制或影響，電針針刺內(nèi)關(guān)及郄門穴對(duì)于缺血心肌能量代謝的影響機(jī)制仍有待做進(jìn)一步研究，今后需在此基礎(chǔ)上不斷深化研究，進(jìn)行更深層次的相關(guān)機(jī)制探索，為針刺改善心肌能量代謝方面的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)資料。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

周婧：項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，實(shí)驗(yàn)開(kāi)展，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析，文章撰寫等；丁麗：實(shí)驗(yàn)研究方案及設(shè)計(jì)指導(dǎo)；鄧?yán)?、章燕、李廣兵、朱濤：指導(dǎo)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；周巧：采購(gòu)、動(dòng)物及設(shè)備準(zhǔn)備及開(kāi)展實(shí)驗(yàn)；王堃：開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，模型制備等；張宸：協(xié)助開(kāi)展實(shí)驗(yàn)及研究檔案管理。