孫 磊， 吳娟娟， 王歡歡， 陳寶江，2*， 吳 迪*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071000；2.河北省牛羊胚胎技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定071000；3.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北邯鄲056000）

畜牧業(yè)的健康發(fā)展對(duì)保證中國(guó)農(nóng)業(yè)健康發(fā)展和提高人民生活水平十分重要，在飼料中添加抗生素有改善動(dòng)物機(jī)體機(jī)能和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收的作用。但近年來(lái)越來(lái)越多研究表明，抗生素的使用會(huì)加速畜禽耐藥性的出現(xiàn)，同時(shí)還會(huì)造成畜產(chǎn)品中抗生素殘留，進(jìn)而會(huì)影響食品安全和公共衛(wèi)生安全。因此，尋求抗生素替代成為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。

動(dòng)物由于飼料、環(huán)境等多種原因，腸道中經(jīng)常感染有害細(xì)菌，常見(jiàn)的有大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形菌等（史同瑞等，2013），這類有害菌寄生在腸道內(nèi)，可引起腹瀉，危害動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能，甚至引發(fā)畜禽死亡（季秋晴等，2018）。同時(shí)，由于飼料中長(zhǎng)期添加抗生素，已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性（孫和濤，2013）。因此，篩選合適的抑菌產(chǎn)品意義重大；另外，集約化飼養(yǎng)管理、飼養(yǎng)環(huán)境、運(yùn)輸?shù)榷喾N因素，又會(huì)使動(dòng)物處于長(zhǎng)期應(yīng)激狀態(tài)，體內(nèi)自由基超量產(chǎn)生，健康受損。

研究表明，植物中的黃酮類物質(zhì)，不僅有一定抑菌消毒能力，還具有抗氧化、抗輻射等良好作用（Manjinder等，2014）。飼糧中添加黃酮類化合物可有效提高機(jī)體抗氧化能力，從而有效增強(qiáng)機(jī)體抵抗力（徐國(guó)銀，2007）；日糧中添加某種黃酮類化合物可起到清除自由基，增強(qiáng)仔豬抗病和抗腫瘤性，減少腹瀉率的作用（趙萌等，2016）。此外，黃酮類還具有幫助改善家畜的胃腸道血管黏膜濕潤(rùn)狀態(tài)、調(diào)節(jié)家畜腸道益生菌群以及幫助緩解熱應(yīng)激等特殊營(yíng)養(yǎng)功效。

六羥基黃酮主要存在于黃芩的根、莖皮等部位，也可以通過(guò)化學(xué)方法合成（喬宇和石波，2019），有保肝、抗癌、抗炎等多種藥物治療以及保健作用（王放等，2016）。但對(duì)其抑菌效果及抗氧化性能的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以六羥基黃酮為對(duì)象，研究其對(duì)畜禽腸道常見(jiàn)有害菌的抑菌效果及抗氧化能力，為其在飼料上的使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種 有害菌：凍干菌粉金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、腸沙門氏菌腸亞種（ATCC13076）、奇異變形桿菌（CMCCB 49005）、大腸埃希氏菌（CICC 10899），購(gòu)于國(guó)家菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)試劑 六羥基黃酮：由萬(wàn)壽菊中提取，晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司提供；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、無(wú)水乙醇、水楊酸、H2O2、維生素C、Fe-SO4·7H2O、DPPH等，均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備DSHG-300A型水浴恒溫振蕩器；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱；SW-CJ-1B型潔凈工作臺(tái)；QL-861型螺旋振蕩器；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器；ELx800型酶標(biāo)儀；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)；96孔板（Costar公司）。

1.4 抑菌活性測(cè)定 本試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)的牛津杯法，通過(guò)測(cè)定抑菌圈大小來(lái)檢測(cè)六羥基黃酮對(duì)4種菌的抗菌作用。抑制細(xì)菌圈小于10 mm，為低程度敏感；10～15 mm，為中等程度敏感；15～20 mm，為高度敏感；20 mm以上，為極度敏感。

1.5 最小抑菌濃度測(cè)定 本試驗(yàn)最小抑菌濃度（MIC）采用二倍稀釋法檢測(cè)。

細(xì)菌百分抑制率/%=1-細(xì)菌生長(zhǎng)百分比（%）。

1.6 抗氧化性測(cè)定 取1 g六羥基黃酮于250 mL錐形瓶中，按1:50比例加入六羥基黃酮和提取液，60%的酒精溶液提取，60℃下水浴振蕩30 min。過(guò)濾，100 mL容量瓶收集濾出液體至容量瓶的刻度線。

1.6.1 水楊酸法對(duì)·OH清除能力 按照濃度順序分別添加2 mL不同體積的樣品于10 mL PC離心管中，濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 mL，再加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，隨后加入超純水使反應(yīng)體系達(dá)到10 mL。37℃靜置30 min。測(cè)定吸光度Ax。空白組以相同體積的超純水替代六羥基黃酮，其他步驟相同，記為A0。測(cè)定Ax和A0時(shí)以超純水為參比溶液?！H清除率的計(jì)算公式為:

式中：A0為空白的吸光度值；Ax為加樣品的吸光度值。

1.6.2 DPPH法測(cè)定清除能力DPPH溶液配制：0.0197 g DPPH溶解于250 mL無(wú)水乙醇。依次分別 加 入 樣 品 液0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、6.0 mL于10 mL離心管中，再加入0.2 mmol/L DPPH 2 mL，添加酒精溶液使反應(yīng)體系達(dá)到8 mL，避光30 min后517 nm測(cè)吸光度Ax，此為試驗(yàn)組。空白組用一樣體積的乙醇代替樣品液，測(cè)得吸光度A0。對(duì)照組用乙醇代替DPPH溶液，測(cè)得吸光度Aj。測(cè)定Ax、Aj和A0時(shí)以無(wú)水乙醇為參比溶液。DPPH清除率計(jì)算公式為：

式中：Ax為加樣品的吸光度值；Aj為對(duì)照的吸光度值；A0為空白的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 六羥基黃酮對(duì)4種有害菌的抑制效果 由表1可以看出，六羥基黃酮對(duì)4種有害菌均有抑制作用。當(dāng)其濃度為5 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌抑制均達(dá)到中等敏感程度，奇異變形菌達(dá)到高程度敏感；20 mg/mL以后，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、奇異變形菌均達(dá)到高程度敏感。在本試驗(yàn)范圍內(nèi)，抑菌圈能力隨六羥基黃酮濃度增高而變大。

表1 六羥基黃酮對(duì)4種有害菌的抑菌效果mm

2.2 六羥基黃酮對(duì)4種有害菌的最小抑菌濃度由表2可以看出，六羥基黃酮對(duì)奇異變形菌MIC最小，為0.125 mg/mL；其次為金黃色葡萄球菌與大腸桿菌；對(duì)腸沙門氏菌MIC最大。

表2 六羥基黃銅對(duì)4種有害菌最小抑制濃m度g/mL

2.3 六羥基黃酮對(duì)·OH的清除率 由表3可知，在樣品量為2.00～4.50 mL（濃度梯度0.03～0.26 mg/mL），六羥基黃酮對(duì)·OH的清除能力隨濃度增大逐漸增長(zhǎng)，在樣品量4.50～6.50 mL（濃度梯度0.26～0.37 mg/mL），清除率趨于平緩，在樣品量6.50 mL（0.15 mg/mL濃度）清除率最高，為86.67%。在相同梯度下，六羥基黃酮對(duì)·OH的清除能力略低于維生素C。

表3 六羥基黃酮對(duì)·OH的清除效果%

2.4 六羥基黃酮對(duì)DPPH的清除率 由表4可知，DPPH的清除能力隨著六羥基黃酮濃度的增大逐漸加強(qiáng)。在樣品量0.6～4.8 mL（濃度梯度0.01～0.11 mg/mL），DPPH清除率穩(wěn)步增加，在樣品量4.8 mL（濃度梯度0.11 mg/mL）時(shí)，清除率到最高，為96.69%，在樣品量4.8 mL（0.11 mg/mL濃度）之后清除率逐漸平緩。并且在此梯度以上，六羥基黃酮的最大清除比率明顯高于維生素C。

表4 六羥基黃酮對(duì)DPPH的清除效果%

3 討論

3.1 六羥基黃酮抑菌分析 六羥基黃酮的抑菌能力主要由其化學(xué)結(jié)構(gòu)決定，黃酮芳環(huán)上羥基的化學(xué)結(jié)構(gòu)位置和其個(gè)數(shù)直接影響其抑菌活性。黃酮類化合物的抗菌活性主要體現(xiàn)在破壞細(xì)菌細(xì)胞膜、減緩菌體能量代謝及降低細(xì)菌的致病性等（柯春林等，2015；楊彩霞，2014）。它的抑制菌能力與其膜交互作用有緊密的聯(lián)系（吳婷，2014）。黃酮可以通過(guò)羥基破環(huán)細(xì)菌的細(xì)胞膜，使其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失（侯媛媛，2015）。同時(shí)，還可以抑制細(xì)菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，導(dǎo)致其體內(nèi)某些蛋白和酶表達(dá)量的下降，引起菌體多種生物學(xué)功能的喪失，從而抑制菌體的生長(zhǎng)和繁殖（陳禹先等，2013）。

研究證實(shí)，某些黃酮抑制細(xì)菌效果良好。張洺嘉等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，黃酮能阻礙細(xì)菌細(xì)胞膜的形成；Basile等（1999）研究結(jié)果顯示，黃酮類化合物對(duì)奇異變形菌MIC為0.016 mg/mL；趙香汝等（2010）采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定了多種中藥對(duì)奇異變形菌及其他細(xì)菌的抑制效果，其中黃芩對(duì)奇異變形菌的抑菌圈為8 mm，MIC為7.8 mg/mL。而本研究的數(shù)據(jù)顯示，六羥基黃酮濃度為0.1 mg/mL時(shí)有抑制細(xì)菌效果，抑制細(xì)菌圈的直徑為13.36 mm，MIC為0.125 mg/mL，與上述研究結(jié)果相似。付璟等（2014）采用濾紙片法得出，六羥基黃酮對(duì)大腸桿菌的MIC為0.3125 mg/mL。本試驗(yàn)得出的結(jié)果顯示，對(duì)大腸桿菌的抑制效果在濃度為100 mg/mL時(shí)最佳，抑制菌圈直徑為19.80 mm，MIC為0.625 mg/mL。這與上述結(jié)果存在一定差異，可能是由于本試驗(yàn)所采用的六羥基黃酮純度與其他試驗(yàn)不一致，同時(shí)，牛津杯法與濾紙片法存在一定差異。

云寶儀等（2013）用牛津杯法探究黃芩素對(duì)MRSA的抑制能力，其抑菌圈直徑達(dá)到16 mm，MIC為0.04 mg/mL。張有志等（2014）采用牛津杯法研究黃芩醇提取物對(duì)金黃葡萄球菌的抑制活性發(fā)現(xiàn)，150、200、250、300 μg/μL時(shí)抑菌圈直徑分別為17、18、18、18 mm。而本試驗(yàn)結(jié)果是在濃度為100 mg/mL時(shí)，抑制效果最佳，抑制細(xì)菌圈約為16.64 mm，不論是濃度增大還是濃度降低，抑菌效果都會(huì)變?nèi)酢１驹囼?yàn)結(jié)果與上述結(jié)果大體相似。但達(dá)到同樣的抑菌效果，本試驗(yàn)的供試藥液需要更高的濃度，這可能是因?yàn)樗褂玫木N型號(hào)和所用的供試藥液的純度不同而導(dǎo)致的差異。

張霖等（2011）采用了體外藥敏試驗(yàn)，得出黃酮對(duì)于鼠傷寒沙門菌的抑制細(xì)菌圈直徑為11 mm。侯媛媛等（2015）研究表明，黃芩素在10 mg/mL時(shí)，對(duì)沙門氏菌的抑制細(xì)菌圈直徑為14.6 mm左右，MIC為1 mg/mL。本試驗(yàn)中，六羥基黃酮MIC為2.5 mg/mL。與上述結(jié)論相似，但同樣濃度的抑制效果有所差異，這可能是六羥基黃酮的抗菌成分提取方式不同導(dǎo)致抗菌成分含量不一致，從而導(dǎo)致抑菌效果有所差異。

3.2 六羥基黃酮抗氧化分析 六羥基黃酮抗氧化的內(nèi)在機(jī)理是提供一個(gè)或多個(gè)氫原子，與脂類有機(jī)化合物的自由基相結(jié)合，轉(zhuǎn)變成酚基自由基，從而降低了氧化速度（岳慶磊等，2003）。李志等（2019）研究結(jié)果表明，薏苡仁總黃酮與DPPH清除率之間呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。本試驗(yàn)中，六羥基黃酮對(duì)·OH和DPPH有較強(qiáng)的清除作用。在2.00～4.50 mL（濃度梯度0.03～0.26 mg/mL）時(shí)，六羥基黃酮對(duì)·OH的清除效果隨含量升高而變強(qiáng)，最后逐漸穩(wěn)定；六羥基黃酮對(duì)·OH的清除作用雖略小于VC，但差值在10%之內(nèi)。六羥基黃酮對(duì)DPPH的清除能力也隨含量升高而變大，與上述結(jié)果相似。六羥基黃酮雖略比VC的清除率低，但在樣品量為4.8～6.0 mL（濃度梯度0.11～0.14 mg/mL）時(shí)，六羥基黃酮抗氧化性略強(qiáng)于VC。可以認(rèn)為六羥基黃酮具有非常強(qiáng)的抗氧化效果。

4 結(jié)論

六羥基黃酮對(duì)4種有害菌均有較強(qiáng)的抑菌能力，濃度為100 mg/mL時(shí)效果最好。六羥基黃酮對(duì)·OH、DPPH的最大清除率分別為86.67%、96.69%，總體抗氧化性水平與維生素C接近。