高素芹， 王曉偉，2*， 趙孟孟， 荊學金， 荊忠平， 張明俊，2， 趙志強，2， 武傳菊

（1.山東益昊生物科技有限公司，山東濰坊262400；2.青島諾森生物技術有限責任公司，山東青島266706；3.平度市同和動物衛(wèi)生與產品質量監(jiān)督站，山東青島266706）

當前我國酒精發(fā)酵生產主要以玉米、稻谷、小麥等糧食作物為原料，但糧食作物原料價格較高，會造成酒精發(fā)酵成本增加，限制酒精發(fā)酵行業(yè)的發(fā)展。而我國南方盛產木薯，其淀粉含量高，且易種植、耐干旱貧瘠，不與糧食作物爭耕地，價格相對便宜，因此可作為生產生物酒精的首選原料之一（劉振等，2005）。

酒糟是酒精發(fā)酵生產主要的副產物，其含有豐富的粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維、礦物質、粗淀粉和維生素等營養(yǎng)物質，生產1 t酒精類產品的同時會產生數噸的酒糟，但酒糟中營養(yǎng)物質未被利用，不僅會造成資源的嚴重浪費，而且長時間堆積不處理，還會造成環(huán)境污染，因此，如何充分利用酒糟的營養(yǎng)價值對提高釀酒工業(yè)循環(huán)經濟效益具有關鍵性的作用（張銀等，2019）。

酒糟傳統(tǒng)的處理方式主要是先沉降，然后離心脫水，最后直接用作飼料，而酒糟上清液大多直接排放，但其化學需氧量（COD）很高，會造成環(huán)境污染。針對上述問題，本研究旨在降低酒糟上清液的COD含量，并得到單細胞蛋白，提高固體酒糟的蛋白含量，變廢為寶，既能減少環(huán)境污染，又能緩解蛋白飼料的短缺現狀（蔡俊，2001），降低飼料成本，提高飼料營養(yǎng)物質含量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 從大曲酒醅等發(fā)酵基質中采集樣品，置于無菌封口袋中，用于菌種的分離和篩選。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑D-果糖、L-山梨糖、D（+)木糖、纖維二糖、D-半乳糖、D-海藻糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、菊糖、D-阿拉伯糖、棉籽糖、葡萄糖、蔗糖，購自上海國藥集團化學試劑有限公司；提取酵母菌基因組試劑盒和Taq酶，購自大連寶生物工程有限公司。

1.2.2 試驗儀器 電子顯微鏡（日本NIKON公司）、恒溫水浴鍋（武漢市琴臺醫(yī)療器械廠）、恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備廠）、超凈工作臺（上海智成分析儀器制造有限公司）、恒溫振蕩器（上海智成分析儀器制造有限公司）、全自動滅菌鍋（上海博訊有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基 酵母膏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（GYP培養(yǎng)基）：酵母粉5 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，水1000 mL，酸堿度自然；酒醅汁培養(yǎng)基：酒醅50 g，加入250 mL水，煮沸20 min，紗布過濾，調pH到7.0，定容至250 mL，加5 g瓊脂；酒精耐受培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，調pH至7.0，滅菌后冷卻至50℃加入10%的乙醇；單糖發(fā)酵培養(yǎng)基：將D-果糖、L-山梨糖、D（+)木糖、纖維二糖、D-半乳糖、D-海藻糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、菊糖、D-阿拉伯糖、棉籽糖、葡萄糖、蔗糖按2%加入無碳源的基礎培養(yǎng)基中；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基。

1.4 木薯酒糟的制備

1.4.1 釀酒酵母的活化 取100 mL純凈水，加入250 mL三角瓶中，煮沸后冷卻，加入1.6 g釀酒酵母，2.0 g蔗糖，混勻，38℃水浴鍋中保溫15 min，之后33℃水浴鍋中保溫2 h。

1.4.2 培養(yǎng)基的制備 稱取91.36 g木薯粉放入500 mL三角瓶中，量取208.64 mL水注入，混勻。放入90～95℃水浴鍋中保溫，加液化酶0.045 mL，作用90 min，然后用稀硫酸調pH至4.0～4.5，放入65℃水浴鍋中保溫，加液化酶0.09 mL，作用30 min，加（NH4）2SO40.6 g，90℃巴氏消毒20 min。

1.4.3 接種 將活化的釀酒酵母按5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，33℃溫箱中培養(yǎng)3 d。

1.4.4 蒸餾酒精 根據處理酒糟上清液的需要，加入100 mL水，在不少于半個小時的時間內蒸出100 mL液體，剩余的固液混合物即木薯酒糟。

1.4.5 離心 將酒糟經過4000 r/min離心，取上清，即酒糟上清液。

1.5 黑曲霉發(fā)酵制備

1.5.1 黑曲霉液態(tài)發(fā)酵 將配制好的PDA液體培養(yǎng)基100 mL加入250 mL三角瓶中，115℃滅菌30 min。冷卻后接入已活化的黑曲霉，于32℃，180 r/min培養(yǎng)3 d，4000 r/min離心10 min，得到黑曲霉上清液。

1.5.2 黑曲霉固體發(fā)酵 將含水量約60%的麩皮培養(yǎng)基100 g裝入250 mL三角瓶中，121℃滅菌30 min，冷卻后接入已活化的黑曲霉，于32℃溫箱中培養(yǎng)3 d。

1.6 菌株的分離純化 稱取10 g酒醅加入到90 mL無菌水中，分別于牛肉膏培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基，GYP培養(yǎng)基，酒醅汁培養(yǎng)基，酒精耐受培養(yǎng)基上稀釋平板分離。挑取平板上具有典型酵母形態(tài)的單菌落進行劃線分離純化，獲得的單菌株分別編號保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 菌株的發(fā)酵與篩選

1.7.1 單菌木薯酒糟上清液液體發(fā)酵 將分離純化得到的菌株分別接種到100 mL木薯酒糟上清液中，35℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 d，上清液中補加（NH4）2SO40.2 g，KH2PO40.1 g，CaCl20.2 g，Mg-SO40.05 g，最后取樣測菌量、COD值。

1.7.2 復合菌木薯酒糟上清液液體發(fā)酵 將篩選到的菌株分別與黑曲霉、10%黑曲霉上清液分成三個組別處理，處理組一：將篩選到的菌株直接接入100 mL木薯酒糟上清液中；處理組二：在100 mL木薯酒糟上清液中先接入10%的黑曲霉上清液，再接入篩選到的菌株；處理組三：將黑曲霉與篩選到的菌株混合后一起接入100 mL木薯酒糟上清液中，在相同條件下，35℃、180 r/min搖床發(fā)酵2 d，最后取樣測菌量、COD值。

1.7.3 單菌木薯酒糟固體發(fā)酵 稱取木薯酒糟85 g，糖蜜15 g，尿素2 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.1 g，加入60%的水混合均勻，常壓蒸煮30 min，冷卻后將篩選到的菌株按5%的接種量接入，37℃恒溫箱內培養(yǎng)40 h，最后取樣測菌量、粗蛋白質、真蛋白含量。

1.7.4 復合菌木薯酒糟固體發(fā)酵

1.7.4.1 黑曲霉糖化木薯酒糟 將木薯酒糟100 g加水調至含水量65%，常壓蒸煮10 min，降溫至65℃，拌入10%黑曲霉發(fā)酵料塊，55℃恒溫培養(yǎng)30 h，取樣檢測還原糖含量。

1.7.4.2 復合菌木薯酒糟固體發(fā)酵 在經過黑曲霉 處 理 后 的 木 薯 酒 糟 中 添 加 （NH4）2SO42 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.1 g，尿素1 g，將篩選到的菌株按5%的接種量接入，37℃恒溫培養(yǎng)40 h，最后取樣測菌量、粗蛋白質含量。

1.8 檢測方法 粗蛋白質測定：凱氏定氮法（馬丹，2008）；真蛋白測定（胡艷麗等，2007）；水分測定：恒重法（天津輕工業(yè)學院，1980）；還原糖測定：斐林試劑法（李正智，1965）；活菌菌量的測定：稀釋平板計數法（趙斌等，2002）；COD的測定：微波消解法（劉華，2009）。

1.9 菌株鑒定

1.9.1 生理生化試驗 酵母的糖同化試驗按照《酵母菌的特征與鑒定手冊》（巴尼特，1991）中生長圖譜法鑒定。

1.9.2 18S rRNA序列擴增及分析 提取待測菌株總DNA作為模板，采用通用引物（正向引物NS1：5/-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3/；反向引物NS4：5/-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3/）進 行18S rRNA的PCR擴增，PCR擴增條件為：預變性（94℃1 min）、變性（94℃1 min）、復性（50℃1 min）、延伸（72℃1 min），30個 循 環(huán)；最 后 延 長（72℃5 min），保存（4℃）。

由測序公司完成測定18S rRNA全長約1000 bp DNA序列，將所測得的序列提交到GenBank，應用Blast程序與數據庫中已有的酵母18S rRNA序列進行相似性比較分析，序列的比較分析及系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA 3.1軟件進行。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離 采用稀釋平板涂布分離法，從酒醅中共分離得4株典型酵母形態(tài)的菌株。其中，從酒醅汁培養(yǎng)基中分離出兩株菌株，分別編號為JP-1，JP-2，從酒精耐受培養(yǎng)基中分離出兩株菌株，分別編號為JJ-1，JJ-2。

2.2 菌株的發(fā)酵與篩選

2.2.1 單菌木薯酒糟上清液液體發(fā)酵 如表1所示，相同條件下，JJ-2在木薯酒糟發(fā)酵上清液發(fā)酵后菌量增加了36.5倍，而JJ-1、JP-1和JP-2發(fā)酵后菌量分別增加1.25倍、4倍、2.75倍，且JJ-2可將酒糟上清液的COD值降低17.17%，而JJ-1，JP-1，JP-2分別只能將COD值降低7.15%、8.58%、7.71%，說明這四株菌株中，JJ-2在木薯酒糟上清液中生長繁殖最好，降低木薯酒糟上清液的COD值幅度最大，且該菌篩選自酒精耐受培養(yǎng)基，具有酒精耐受性，因此，選取該菌株進行后續(xù)試驗。

表1 單菌木薯酒糟上清液液體發(fā)酵

2.2.2 復合菌木薯酒糟上清液液體發(fā)酵 如表2所示，在三組處理中，處理組二發(fā)酵后菌量增加121.5倍，木薯酒糟上清液COD值降低33.91%，均優(yōu)于其他兩個組別。

表2 復合菌木薯酒糟上清液液體發(fā)酵

2.2.3 單菌木薯酒糟固體發(fā)酵 如表3所示，菌株JJ-2在木薯固體酒糟中發(fā)酵后菌量達到3.20×109cfu/g，菌量增加約3200倍，粗蛋白質含量增長9.29個百分點，真蛋白含量增加6.83個百分點。

表3 單菌木薯酒糟固體發(fā)酵

2.2.4 黑曲霉糖化木薯酒糟 如表4所示，經過黑曲霉處理后木薯酒糟的還原糖含量可達8.2%，達到了添加糖蜜后木薯酒糟中還原糖含量，因此，可以直接添加菌株進行固體發(fā)酵。

表4 黑曲霉糖化固體酒糟不同時間段還原糖含量%

2.2.5復合菌木薯酒糟固體發(fā)酵 如表5所示，JJ-2可以在經過黑曲霉處理且未添加糖蜜作為碳源的木薯酒糟上較好的發(fā)酵生長，經過發(fā)酵活菌數可達2.61×109cfu/g，粗蛋白質含量增至22.69%，表明能較好的改善木薯酒糟品質。

表5 復合菌木薯酒糟固體發(fā)酵

2.3 生理生化特征 生理生化特征鑒定結果見表6。

表6 生理生化特征鑒定結果

2.4 分子生物學鑒定 由圖1可知，JJ-2的18S rRNA基因核酸序列，與GenBank中Pichia kudriavzevii的核苷酸序列同源性達到100%。因此，確定JJ-2菌株為Pichia kudriavzevii。

圖1 基于JJ-2的18S rRNA序列同源性構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論

本研究從酒醅中有針對性的篩選到耐酒精且在木薯酒糟中發(fā)酵良好的酵母菌株JJ-2，經過生理生化研究和分子生物學鑒定，確定為庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

酵母菌株JJ-2在木薯酒糟上清液液體發(fā)酵過程中可以有效降低上清液的COD值，在經過10%黑曲霉上清液處理后的木薯酒糟上清液中也可以得到良好的發(fā)酵，并且COD值得到了更大程度的降低（COD含量降低了33.91%），說明木薯酒糟經過10%黑曲霉上清液處理后，有利于木薯酒糟上清液的液體發(fā)酵。

酵母菌株JJ-2在木薯酒糟固體發(fā)酵過程中，可以良好的生長發(fā)酵，粗蛋白質含量提高9.29個百分點，真蛋白含量提高6.83個百分點。在實際生產過程木薯酒糟通常需要添加糖蜜作為碳源進行固體發(fā)酵生產，未能充分利用木薯酒糟中碳源，本試驗通過添加黑曲霉對木薯酒糟進行糖化處理，可達到添加糖蜜后還原糖的含量水平，并且酵母菌株JJ-2在經黑曲霉糖化后的木薯酒糟發(fā)酵過程中，也可以良好的生長發(fā)酵，并且粗蛋白質含量也得到了很大程度的提高（增長7.89個百分點）。

綜上可知，本研究篩選的酵母菌株JJ-2可適用于木薯酒糟的工業(yè)發(fā)酵生產，在降低木薯酒糟上清液COD、提高木薯酒糟蛋白含量方面有著很大改善作用，不僅緩解了木薯酒糟上清液排放對環(huán)境造成的污染壓力，而且還提升了木薯酒糟的飼料應用營養(yǎng)價值和飼料蛋白品質，增大了木薯酒糟的應用領域。