李莎，斯那永宗，徐若，字淑慧，范林元，劉濤*

叢枝菌絲網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)苜蓿植株間機(jī)械損傷信號的傳遞

李莎1，斯那永宗2，徐若1，字淑慧1，范林元3*，劉濤1*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南與生物技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201；2. 德欽縣升平鎮(zhèn)人民政府農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心, 云南 迪慶 674599；3. 云南省林木種苗站, 昆明 650201)

為了解植株間的菌絲網(wǎng)絡(luò)(common mycorrhizal networks, CMNs)的功能，對叢枝菌根菌絲網(wǎng)絡(luò)在紫花苜蓿()機(jī)械損傷信號傳遞中的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，與經(jīng)機(jī)械損傷處理的供體植株有CMNs連接的受體植株葉片中揮發(fā)物的數(shù)量和種類都顯著高于無CMNs連接的植株；供體植株經(jīng)機(jī)械損傷處理后，有CMNs連接的受體植株的超氧化物歧化酶(SOD)等抗逆酶活性都顯著升高。這表明機(jī)械損傷誘導(dǎo)的防御信號可通過地下菌絲網(wǎng)絡(luò)傳遞給鄰近植株，激活鄰近植株防御系統(tǒng)，使鄰近未受機(jī)械損傷的苜蓿植株改變揮發(fā)性氣體，并改變其防御酶活性，用以修復(fù)損傷帶來的傷害。

紫花苜蓿；菌絲網(wǎng)絡(luò)；防御信號；防御酶

植物的固著性使其必須時(shí)常能感知、處理和響應(yīng)各種不同的環(huán)境刺激，包括各種生物脅迫和非生物脅迫。在長期進(jìn)化過程中，植物已經(jīng)進(jìn)化出非常敏感的響應(yīng)機(jī)制，能夠感知這些信號并做出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)[1]。在非生物脅迫中, 機(jī)械損傷最為常見，植物損傷后識別損傷信號，并啟動(dòng)適當(dāng)?shù)姆烙磻?yīng)[2], 上調(diào)表達(dá)抗病相關(guān)和防御食草動(dòng)物的基因。擬南芥()在機(jī)械損傷幾分鐘內(nèi)，其防御相關(guān)酶活性迅速提高，并釋放出大量信號物質(zhì)[3], 如揮發(fā)物，此變化持續(xù)時(shí)間可達(dá)數(shù)小時(shí)[4]。另有研究表明，未受損的植株若暴露于受損傷植物釋放的揮發(fā)物(volatile organic compounds, VOCS)中，也會表現(xiàn)出明顯的防御反應(yīng)[5]，這種通過感受受傷植株釋放的VOCS，提高自身防御基因表達(dá)水平的方式，有利于提前讓鄰近植物做好防御，提高對不利環(huán)境的適應(yīng)能力。有研究表明，受傷紅薯()釋放的VOCs可以被鄰近正常植株感知，從而激活其體內(nèi)防御相關(guān)酶或啟動(dòng)防御系統(tǒng)[6]。目前, 關(guān)于植物地上部分氣體交流的研究已有較多報(bào)道,但關(guān)于植株間地下部分防御信號交流的報(bào)道極少。

菌根菌絲網(wǎng)絡(luò)(common mycorrhizal networks, CMNs)是同一物種的不同植株間，以及不同物種的植株間形成的菌絲橋，可構(gòu)成植物間在地下進(jìn)行物質(zhì)交流的通道，進(jìn)行無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)和有機(jī)光合產(chǎn)物的傳遞，菌絲網(wǎng)絡(luò)相當(dāng)于“超級公路”，可將化感物質(zhì)、信號傳導(dǎo)物質(zhì)作為早期防御信號傳遞給鄰近植株[7–8]。有研究表明，CMNs可以介導(dǎo)番茄()植株間抗病抗蟲防御信號的通訊，由CMNs介導(dǎo)的鄰近植株會“竊聽”到這種防御信號,促進(jìn)鄰近植株提前做好防御準(zhǔn)備[8]。近年來對CMNs介導(dǎo)的抗病抗蟲信號傳遞研究取得了一定進(jìn)展，但關(guān)于菌絲網(wǎng)絡(luò)能否在苜蓿()間傳遞機(jī)械信號還未見報(bào)道。

因此為了解機(jī)械損傷信號能否通過地下菌絲網(wǎng)絡(luò)傳遞給鄰近植株，本文通過隔絕地上部分的交流，采用紫花苜蓿構(gòu)建地下菌絲網(wǎng)絡(luò)，通過分析鄰近苜蓿植株揮發(fā)性物質(zhì)和相關(guān)防御酶活性的變化, 探討受體苜蓿植株能否通過CMNs感知到機(jī)械損傷植株傳遞的防御信號，并啟動(dòng)抗性防御反應(yīng)，為菌絲網(wǎng)絡(luò)傳遞機(jī)械損傷信號的機(jī)理研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以模式植物紫花苜蓿()為材料,種子由中國科學(xué)院昆明植物所提供。播種前，將種子在70%乙醛中浸泡3 min，無菌水沖洗2 min后備用。苜蓿播種3周后，選擇健康、長勢一致的植株移栽入17 cm×17 cm×21 cm的塑料盆中，每盆8株小苗，放入溫度為20℃～25℃、相對濕度為(60± 10)%的大棚中，日常管理用無菌水進(jìn)行澆水。移栽50 d后移入西南生物多樣性實(shí)驗(yàn)室，機(jī)械損傷處理前將整個(gè)盆栽用透明的玻璃箱罩住。

試驗(yàn)菌種 AMF單孢球囊霉()購買于中國叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫。栽培基質(zhì)為腐殖土和黃土的混合物(2∶1), 121℃高壓蒸汽濕熱滅菌2 h，以消除土壤中的真菌孢子，冷卻后裝入裝置盆，約為3/4盆高，澆水濕潤，加入20 g菌劑(孢子、菌絲、定殖根段和沙子的混合物)，再覆蓋1.5 cm的土壤。

試驗(yàn)裝置 試驗(yàn)裝置(圖1)連接處用30m的尼龍網(wǎng)和疏水膜間隔，避免兩盆植物的根系和水分接觸。用玻璃箱隔絕后進(jìn)行機(jī)械損傷。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，T1：接種AM菌且輕度機(jī)械損傷的主體植株(CMNW)；T2：接種AM菌但無機(jī)械損傷的鄰近植株(CMN)，T3：未接菌且輕度機(jī)械損傷的主體植株(NCMNW), T4：未接菌無機(jī)械損傷的鄰近植株(NCMN)。每個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)裝置分別有1個(gè)“機(jī)械損傷植株”和1個(gè)“鄰近植株”組成。機(jī)械損傷是用滅菌的直徑為0.5 cm的打孔器, 在苜蓿成熟葉片主脈兩側(cè)打孔，每盆每天打孔20個(gè)[8]，連續(xù)損傷6 d，第

圖1 試驗(yàn)裝置示意圖

1.2 菌根侵染率的測定

采用盛萍萍等[9]的方法。取若干1 cm長的根段洗凈放入FAA固定液固定12 h，清洗5次后加入適量的20% KOH，在90℃下水浴30 min，然后用流水沖洗5次，在5%冰醋酸中浸泡5 min，用5%醋酸墨水染色，60℃水浴30 min，在清水中浸泡2 h, 再用Sudan染色液60℃水浴60 min，清水沖洗3 min, 70%乙醛脫色5 min，然后制片并觀察。

1.3 酶活性的測定

稱取0.1 g苜蓿葉片，加入1 mL的提取液，冰浴磨漿。在4℃下21.43×離心10 min，上清液為粗酶液。

超氧化物歧化酶(SOD) 粗酶液加入反應(yīng)試劑充分混勻，25℃避光靜置30 min。采用可見分光光度計(jì)在波長450 nm下測吸光值[10]。抑制百分比=[(A空白管1-A空白管2)-(A樣本管-A樣本對照管)]/(A空白管1-A空白管2)× 100%, SOD (U/g)=[抑制百分比/(1-抑制百分比)/樣本質(zhì)量]。

抗壞血酸過氧化物酶(APX) 粗酶液加入反應(yīng)試劑充分混勻，25℃避光靜置30 min。采用分光光度計(jì)在波長290 nm下分別測定30和300 s的吸光值，分別記為A1和A2，最終酶活性的吸光值為A=A1-A2，APX (mol/g)=(A×粗酶液體積/測定液體積×鮮質(zhì)量)。

脂氧合酶(LOX) 粗酶液加入反應(yīng)試劑充分混勻，25℃靜置5 min。采用分光光度計(jì)在波長234 nm下測吸光值，LOX (U/g)=(10000/吸光值/葉片質(zhì)量)。

植物絲裂原活化蛋白激酶(MKK1)和鈣依賴性蛋白激酶(CPK11) 稱取1 g苜蓿葉片，加入9 mL pH為7.2～7.4的PBS冰浴磨漿，在5.36×下離心20 min，收集上清液。酶標(biāo)板上設(shè)置空白孔(空白孔不加樣品及酶標(biāo)試劑)、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，樣品孔底部加入樣品，輕輕混勻；用封板膜封板，于37℃溫浴30 min，濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄廢液，重復(fù)4～5次；除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑50 mL；重復(fù)溫浴和洗滌步驟；加入顯色劑A 50 mL和顯色劑B 50 mL, 輕輕混勻，37℃避光顯色10 min, 加入終止液50 mL終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450 nm波長下測量吸光值。

1.4 揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS分析

采集的葉子用液氮研磨成細(xì)粉末, 取100 mg粉末加到1.5 mL離心管中。加入0.5 mL正己烷, 震蕩30 s，然后放在冰上10 min，渦旋重復(fù)2次以上。提取結(jié)束后，從冰中取出離心管，在21.43×下離心1 min。取0.2 mL的有機(jī)層等份加入最終濃度為0.002%的內(nèi)標(biāo)物[11]。

采用氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測。氣相條件：氣相色譜柱HP-5MS (安杰龍5910), 進(jìn)樣口溫度為230℃,檢測器溫度為180℃。以無分離模式加入1 mL加標(biāo)樣品。載氣為氦氣，流速為0.5 mL/min, 升溫程序：初始柱溫為50℃，保持3 min，然后以5℃/min升至200℃，再以10℃/min升至230℃，保持2 min。質(zhì)譜條件：電離方式EI；電子能量70eV；接口溫度280℃；閾值100；掃描/秒為2.67；掃描模式為全掃描(SCAN), 掃描范圍40～450 aum。每個(gè)樣品檢測3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Draw venn diagram和DPS軟件錄入數(shù)據(jù)和作圖，用SPSS 20軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。相關(guān)圖表制作在Excel中完成。

2 結(jié)果和分析

2.1 AM真菌定殖

結(jié)果表明，接菌處理和不接菌處理的叢枝菌根真菌侵染率存在顯著差異(圖2)，接菌處理的供體植株和受體植株的根系侵染率分別為76.3%和72.3%，說明AM真菌與苜蓿植株能建立良好的共生關(guān)系。從圖3可以明顯看出苜蓿植株根系中AM菌絲孢子結(jié)構(gòu)，供體植株與受體植株之間建立了CMNs，而不接菌的苜蓿植株不管是供體植株還是受體植株的根系都沒有發(fā)現(xiàn)菌絲侵染，其AM真菌侵染率幾乎為零(圖2)。AM真菌的定殖與CMNs的建立是本次試驗(yàn)開展的基礎(chǔ)。

2.2 揮發(fā)性物質(zhì)的測定

GC-MS分析表明，有菌絲網(wǎng)絡(luò)(CMN)的鄰近損傷受體苜蓿植株釋放的揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs)與對照(NCMN)的差異明顯，供體紫花苜蓿植株連續(xù)機(jī)械損傷6 d后，鄰近受體植株6和100 min的VOCs種類比NCMN增加近2倍，VOCs數(shù)量分別比NCMN增加了31%和24% (圖4)。從表1可見，供體苜蓿植株機(jī)械損傷后，有CMNs連接的鄰近健康受體苜蓿葉片揮發(fā)性氣體的數(shù)量和種類都顯著高于沒有菌絲連接的對照，CMN 6 min和100 min分別檢測出92和81種，NCMN 6 min和100 min分別檢測出83和64種(圖4)。CMN比NCMN增加了2-己烯醛、亞油酸、3,6-二甲基-癸烷、庚烷、亞油酸辛酯、2,4-二丁基苯酚、新戊二烯、亞油酸、正十四烷基、正十六酸、十六酸乙酯、亞油酸乙酯、角鯊烯等化合物。

圖2 苜蓿植株根部AM真菌的侵染率。CMNW: 接種AM菌且輕度機(jī)械損傷的供體植株; CMN: 接種AM菌無機(jī)械損傷的鄰近植株; NCMNW: 未接菌且輕度機(jī)械損傷的主體植株; NCMN: 未接菌無機(jī)械損傷的鄰近植株。以下圖表同。

圖3 醋酸墨水染色的苜蓿叢枝菌根

圖4 不同處理間的揮發(fā)性物質(zhì)

2.3 防御酶活性

從圖5可見，未接菌供體植株機(jī)械損傷(NCMN)后，臨近受體植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性未表現(xiàn)升高的趨勢；而接菌供體植株在機(jī)械損傷(CMN)后，臨近受體植株的SOD活性顯著升高, 100 min的SOD活性比6 min時(shí)升高了近2倍。NCMN臨近受體植株的抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性也未受影響，而CMN臨近受體植株的則表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢。NCMN臨近受體植株的脂氧合酶(LOX)活性也不受影響，而CMN臨近受體植株的則急劇升高。NCMN和CMN臨近受體植株的鈣依賴性蛋白激酶(CPK11)和植物絲裂原活化蛋白激酶(MKK1)活性隨時(shí)間延長而增加，6 min和100 min的活性差異顯著。

3 結(jié)論和討論

菌絲網(wǎng)絡(luò)在參與植物地下資源的調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。有研究表明，CMNs會依據(jù)不同植物對養(yǎng)分的需求程度來進(jìn)行分配[12]，在植株間雙向傳遞磷[13]和氮[14]。同時(shí)，CMNs還可以對水分[15]和化感物質(zhì)[16]等進(jìn)行傳輸，從而調(diào)節(jié)宿主植物間的競爭[17]，增加群落和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和多樣性[18]。

在抗病蟲害信號傳遞方面，菌絲網(wǎng)絡(luò)同樣扮演著重要角色。有研究表明其可在相同或不同植物間進(jìn)行抗病信號的傳遞。謝麗君等[19]和郭濤等[20]報(bào)道番茄和煙草()供體植物在受到病原菌侵染后，CMNs可將脅迫信號傳遞給受體植株，進(jìn)而增強(qiáng)受體植株的抗病性。同樣的，Song等[7]和Babikova等[15]報(bào)道了番茄和蠶豆() CMNs能夠介導(dǎo)抗蟲信號的傳遞。

表1 CMN比NCMN增加的揮發(fā)性物質(zhì)

圖5 苜蓿葉片的SOD、APX、LOX、CPK11和MKK1活性

僅廉法卓等[8]報(bào)道了CMNs介導(dǎo)植物間機(jī)械損傷信號的傳導(dǎo)，供體番茄葉片損傷后，通過分析受體番茄抗逆酶活性的改變及抗逆基因的表達(dá)情況，證明機(jī)械損傷信號確實(shí)可以通過CMNs傳遞給鄰近植物，從而使得周圍健康植物提前做好防御準(zhǔn)備。但對于這種傳遞信號是否會影響受體植株揮發(fā)性氣體的改變以及是否在除番茄以外的植株上也具有此現(xiàn)象仍未知。

前人研究表明，醛類、酚類、烯類等物質(zhì)能增加植物的抗蟲性，減少蚜蟲的取食[4]。本研究結(jié)果表明，對紫花苜蓿植株進(jìn)行機(jī)械損傷后，防御信號物質(zhì)可通過CMNs將防御信號快速的傳遞給鄰近未機(jī)械損傷的植株。

另外，有CMNs連接的受體紫花苜蓿的SOD、LOX活性顯著升高，而APX活性先急劇升高后下降；這種現(xiàn)象沒有出現(xiàn)在有機(jī)械損傷但無CMNs連接的受體紫花苜蓿中；而CPK11、MKK1在不同處理間的差異并不顯著。SOD是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶和活性氧清除劑，參與植物的防御反應(yīng)過程中。劉萌萌等[21]的研究表明隨機(jī)械損傷強(qiáng)度的增加，冷蒿()植株的抗氧化酶活性逐漸增強(qiáng)。脂氧合酶(LOX)是昆蟲取食誘導(dǎo)的植物防御反應(yīng)中的關(guān)鍵酶。已經(jīng)證實(shí)各種脅迫因子包括機(jī)械損傷、昆蟲取食和病原菌侵染都能誘導(dǎo)植物基因的表達(dá)[22]。利馬豆()受到螨()取食危害后,和其他5種防衛(wèi)基因的mRNA表達(dá)量增加, 從而使LOX活性增加; 當(dāng)用被取食植株所產(chǎn)生的化合物處理未受侵襲的利馬豆葉片時(shí)，同樣能增加LOX活性及其基因的mRNA水平[23]。本研究中，有CMNs連接的受體紫花苜蓿的SOD、LOX活性顯著升高，說明菌絲網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)傳遞了損傷信號到受體植株，引起防御酶活性的升高。APX主要存在于質(zhì)體，尤其是葉綠體中[24]，其可將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O。本研究中APX活性先急劇升高后下降，推測受體苜蓿在接受損傷信號后100 min可能處于損傷修復(fù)階段。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)級聯(lián)途徑作為最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，能將細(xì)胞膜表面受體感知到的信號通過磷酸化和去磷酸化作用逐級放大并傳遞到細(xì)胞內(nèi)，靶向激活胞質(zhì)或核內(nèi)的其他激酶、酶或轉(zhuǎn)錄因子等效應(yīng)蛋白，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，從而促使細(xì)胞、組織、器官、整個(gè)生物體做出相應(yīng)的生理生化反應(yīng)，進(jìn)而適應(yīng)環(huán)境和抵御逆境脅迫[25]；鈣依賴蛋白激酶是植物中研究較多的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 分布于植物和一些原生生物中[26]，可以通過對鈣的調(diào)節(jié)來穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu), 維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu), 對植物代謝中產(chǎn)生的酸進(jìn)行中和，消除過量有機(jī)酸對細(xì)胞的毒害, 提高植物的抗病害能力。本試驗(yàn)中這兩種酶在NCMN處理中隨著取樣時(shí)間變化并未發(fā)生改變，而CMN處理中，兩種酶活性隨著時(shí)間延長逐漸升高，表明損傷信號在苜蓿植株間發(fā)生傳遞，說明菌絲網(wǎng)絡(luò)可以介導(dǎo)機(jī)械損傷信號在植株間的傳遞。

本研究排除了苜蓿根系分泌物、地上部揮發(fā)物的影響，結(jié)果表明有菌絲連接的受體苜蓿植株的防御反應(yīng)最強(qiáng)烈，證明了CMNs可介導(dǎo)苜蓿植物間機(jī)械損傷信號的通訊。由此可見，在接種菌根建立CMNs后，當(dāng)供體紫花苜蓿植物受到機(jī)械損傷，其可將這種損傷信號通過CMNs傳遞給受體，并激活受體植株防御反應(yīng)。CMNs在生態(tài)系統(tǒng)中起重要作用，CMNs可作為苜蓿植株間機(jī)械損傷信號傳遞的通道，豐富了我們對植物通過CMNs進(jìn)行地下信號傳遞的認(rèn)知，對菌根微生物學(xué)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐都具有重要的意義。

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Defense Signal Transmission between Alfalfa Plants through Underground Mycorrhizal Network

LI Sha1, SINA Yong-zong2, XU Ruo1, ZI Shu-hui1, FAN Lin-yuan3*, LIU Tao1*

(1. College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Agricultural Comprehensive Service Center of Shengping Town People’s Government of Deqin County, Diqin 674599, Yunnan, China; 3. Yunnan Forest Seedling Station, Kunming 650201, China)

In order to understand the function of common mycorrhizal networks (CMNs) among plants, its role in mechanical damage signal transduction ofwas studied. The results showed that analyzed whether the damage signal of donor plants could be transmitted to the neighboring recipient plants through CMNs. The number and kinds of volatile compounds in leaves of recipient plants connected with CMNs were significantly higher than those connected without CMNs. The activities of defense enzyme also increased significantly in recipient plants connected with CMNs. Therefore, it was suggested that the defense signals induced by mechanical damage could be transmitted to neighboring plants through CMNs, which activates the defense system of neighboring plants, so that the nearby alfalfa plants without mechanical damage changed the volatile gas and the defense enzyme activity, so as to repair the damage caused by the damage.

; Mycorrhizal network; Defense signal; Defense enzyme

10.11926/jtsb.4308

2020–09–10

2020–11–18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473310)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81473310).

李莎(1995～ )，女，在讀碩士研究生，主要從事土壤微生物與滇重樓共生及促生長的機(jī)理研究。E-mail: 1786508690@qq.com

E-mail:52133490@qq.com