王文杰，焦士蓉，孫博瑞，包善思

(西華大學 食品與生物工程學院，成都 610039)

花椒是我們常見的調(diào)味品, 放在食物中不僅有特殊的芳香氣，花椒還具有抗菌、溫中散寒、除濕、止痛、殺蟲、解魚腥毒的功效，治積食停飲、心腹冷痛、嘔吐、齒痛、蛔蟲病、蟯蟲病、陰癢、瘡疥，在食品和藥品領(lǐng)域具有很大潛力[1]。利用植物中活性物質(zhì)制備農(nóng)藥是當今熱點之一，對食品安全方面跨出了重要的一步，而花椒中總多酚物質(zhì)具有不錯的殺菌效果[2-3]，抑菌作用是花椒的重要功能活性之一[4]。天然防腐領(lǐng)域具有廣闊的應用前景[5-6]。近年來對花椒的研究主要集中在其精油和生物堿的提取利用[7]，花椒多酚類物質(zhì)研究相對較少，本文主要以花椒為原料，優(yōu)化多酚提取工藝并對其抑制病原真菌的能力做出了探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)：市售；福林-酚試劑(AR)：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；硫酸鏈霉素原藥(Amresco-0382)；90%多菌靈原藥(Carbendazim)：陜西先農(nóng)生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

供試菌株：玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydisbio-12080)、小麥赤霉菌(GibberellazeaeACCC 39334)、番茄灰霉菌(灰葡萄孢菌BotrytiscinereaPers. ACCC 36034)、葡萄白腐菌(白腐盾殼霉菌ConielladiplodiellaPetrak et Sydow ACCC 36140)、油菜菌核病菌(核盤菌Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary ACCC 36083)、柑橘綠霉菌(Penicilliumdigitatum(Pers.)Sacc ACCC 30389)、馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans(Mont.) de Bary)均購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PDA培養(yǎng)基[8]。

DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；MP17C-KE美的家用微波爐 佛山市順德區(qū)北滘鎮(zhèn)三洪奇工業(yè)區(qū)；UV-2600型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

稱取0.1 g沒食子酸，放入100 mL容量瓶中，加入100 mL蒸餾水定容。取不同體積的母液定容至50 mL，加入2 mL的福林-酚搖至均勻，靜置5 min，滴入4 mL 10%的碳酸鈉溶液，放入25 ℃恒溫水浴中，2 h后進行吸光度測定[9-10]。于760 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，見圖1。

圖1 多酚標準曲線圖Fig.1 The standard curve of polyphenols

由圖1可知，其相關(guān)系數(shù)為R2=0.9998，說明此回歸方程的擬合度高，可準確計算出多酚的質(zhì)量濃度。

1.2.2 多酚的提取實驗

稱取10 g花椒于燒瓶中，倒入60%乙醇浸泡10 min，之后定容至100 mL，在恒溫水浴中回流提取，取樣100 μL，計算其中多酚的質(zhì)量濃度。

1.2.3 多酚含量的測定

花椒的干燥環(huán)境設(shè)置為50 ℃，干燥后進行粉碎，稱取1 g粉碎后的花椒粉末，放入50 mL溶劑中進行提取，抽濾并收集提取液。準確吸取0.1 mL提取液進行反應，根據(jù)標準曲線計算多酚質(zhì)量濃度，并按照公式(1)計算多酚收率。

(1)

式中：P為總多酚收率，mg/g；C為多酚的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為花椒提取液的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；W為花椒質(zhì)量，g。

1.2.4 單因子實驗

參照李利華[11]的方法，對目數(shù)、乙醇濃度、料液比、微波功率和提取時間進行單因素實驗：準確稱取相同批次的備用花椒粉1.0 g，設(shè)置不同目數(shù)(<40，40～60，60～80，80～100，>100)、提取液乙醇濃度(0%、20%、40%、60%、80%)、不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)、微波功率(136，264，440，616，800 W)、提取時間(20，40，60，80，100 s)。根據(jù)單因素水平實驗結(jié)果進行極差分析，最終選出3個最主要的影響因素，通過設(shè)計響應曲面進行優(yōu)化實驗。

1.2.5 響應曲面優(yōu)化實驗設(shè)計

通過對單因素實驗進行極差分析后，響應值選用多酚含量，選取對收率影響最大的料液比、乙醇濃度、微波時間這3個提取參數(shù)為研究對象，設(shè)計響應面Box-Behnken實驗[12]。采用Design Expert 8.05b軟件輔助實驗，實驗因素水平及編碼值見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計實驗因素水平及編碼Table 1 The factors and levels of Box-Behnken design experiment

1.2.6 花椒總多酚物質(zhì)抑菌活性的初篩

參考朱奇奇等[13]的平板生長速率法，并做適當修改。通過下式計算其相對抑菌率：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 目數(shù)對花椒多酚收率的影響

由圖2可知，花椒多酚的提取量隨著目數(shù)的增加先提高后下降，當目數(shù)為80～100目時，多酚收率達到最高。

圖2 目數(shù)對花椒多酚收率的影響Fig.2 The effect of mesh number on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum Maxim.

2.1.2 乙醇濃度對花椒多酚收率的影響

由圖3可知，花椒的多酚收率呈先上升后下降的趨勢，當乙醇濃度達到60%時有較高的收率65.36 mg/g。這可能是60%乙醇的極性使糖類等水溶性物質(zhì)浸出量不大，且達到斷裂化學鍵的濃度。乙醇液價格低廉、安全性高且有利于清潔生產(chǎn)[14]，所以將乙醇作為提取的溶劑選擇。

圖3 乙醇濃度對花椒多酚收率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum Maxim.

2.1.3 料液比對花椒多酚收率的影響

適當?shù)牧弦罕仁沟梦锪吓c溶劑間有好的濃度差，有利于提高多酚的提取速率，能夠降低成本。由圖4可知，花椒的多酚收率隨著溶劑用量的增加先增大后降低，其下降的原因可能是其中的多酚物質(zhì)已經(jīng)大部分溶出，溶劑用量已經(jīng)不會對收率有促進作用，繼續(xù)增加溶劑用量干擾多酚測量。

圖4 料液比對花椒多酚收率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum Maxim.

2.1.4 微波功率對花椒多酚收率的影響

微波產(chǎn)生的電磁場加速了被萃取成分由物料內(nèi)部向萃取溶劑界面的擴散速率，從而縮短了萃取時間[15]。由圖5可知，隨著微波功率提高，花椒多酚收率不斷增高，當功率達到600 W之后，多酚收率開始下降，這是由于微波功率過高導致不均勻或急速受熱，使花椒多酚發(fā)生分解，導致收率下降。

圖5 微波功率對花椒多酚收率的影響Fig.5 Effect of microwave power on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum Maxim.

2.1.5 微波提取時間對花椒多酚收率的影響

不同的提取時間同樣也影響著多酚收率。由圖6可知，在60 s內(nèi)多酚收率不斷上升，之后開始下降，可能是由于在60 s內(nèi)多酚已經(jīng)提取完成，隨著時間的延長，溶出的多酚物質(zhì)變少。

圖6 微波提取時間對花椒多酚收率的影響Fig.6 Effect of microwave extraction time on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum Maxim.

2.2 響應面實驗結(jié)果及分析

通過單因素實驗，選取對多酚收率影響較大的料液比(B)、乙醇濃度(A)、微波提取時間(C)這3個因素做Box-Behnken設(shè)計，并且以花椒多酚收率(R)作為響應值，設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken響應面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken response surface design and results

利用Design Expert 8.05b軟件對表2的結(jié)果進行分析，得到回歸模型方差，見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression model

經(jīng)過Design Expert回歸擬合分析，得到多酚收率(R)對乙醇濃度(A)、料液比(B)和微波時間(C)的二次多項回歸方程為：R=77.72+0.11A+0.42B+0.67C-4.32AB-2.86AC—5.52BC-5.68A2-6.42B2-4.11C2。

由表3可知，回歸模型P=0.0292<0.05，即具有一定的顯著性。失擬項P=0.9451>0.05，不顯著，說明方程對實驗的擬合程度很高。R2=0.9179，表明實際值與采用該方法的預測值有著很高的相關(guān)性。說明該方法具有可靠性，選用該方法對不同條件下的多酚收率進行預測是有效的。回歸方程各項方差分析表明，3個影響因素對花椒總多酚提取率的影響依次是：C(提取時間)>B(料液比)>A(乙醇濃度)。因素AB、BC、A2、B2對花椒總多酚的提取有顯著影響(P<0.05)。

2.3 因子間交互作用分析

由圖7可知，在微波時間水平為0，即微波時間為60 s時，料液比與微波提取時間對花椒多酚收率的交互效應。響應面曲線平滑，即乙醇濃度對花椒總多酚的提取率影響較小，而料液比的影響則較大，表現(xiàn)為曲線較為陡峭。由等高線圖可知，當料液比為1∶40(g/mL)時，等高線明顯呈橢圓形，說明料液比與乙醇濃度對花椒總多酚含量的交互效應比較顯著。

圖7 料液比和乙醇濃度交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of the interaction between solid-liquid ratio and ethanol concentration

由圖8可知，在乙醇濃度水平為0，即乙醇濃度為60%時，料液比與乙醇濃度對花椒多酚收率的交互影響。由響應面圖可知，微波時間對花椒總多酚提取影響較大，表現(xiàn)為曲線較陡峭，而料液比影響相對較小。等高線圖表現(xiàn)為明顯的橢圓形，可以得到總多酚的提取率受料液比和微波時間交互作用的影響較為顯著。

圖8 料液比和微波時間交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of the interaction between solid-liquid ratio and microwave time

由圖9可知，在料液比水平為0的情況下，即料液比為1∶40時，乙醇濃度與微波時間對花椒多酚收率的交互影響。由響應面圖可知，圖像呈現(xiàn)馬鞍形，說明乙醇濃度與微波時間對多酚提取的影響較接近。乙醇濃度與微波時間對花椒總多酚提取的影響比較，乙醇濃度的影響較為顯著，等高線更接近乙醇濃度。

圖9 乙醇濃度與微波時間交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots of the interaction between ethanol concentration and microwave time

2.4 驗證實驗

通過實驗輔助軟件Design Expert優(yōu)化提取條件得到理論的最佳提取條件和響應值：料液比為1∶ 37.3 (g/mL)，乙醇濃度為67.3%，微波提取時間為67.3 s，花椒總多酚含量為63.95 mg/g。

模型的驗證：綜合考慮和分析實驗的好操作性，以及溶劑濃度高對多酚測量帶來的干擾，選取料液比為1∶40(g/mL)，乙醇濃度為60%，微波提取時間為60 s，微波功率為616 W的條件下進行實驗結(jié)果為63.11 mg/g；通過理論方程計算花椒總多酚含量為64.27 mg/g，相對誤差為1.84%，小于10%，證明響應面優(yōu)化花椒總多酚提取工藝是可行的，該模型有效。

2.5 花椒總多酚提取物抑菌活性的初篩結(jié)果

將從花椒提取中的總多酚物質(zhì)配制成濃度為100 mg/mL的培養(yǎng)基，按照上述的實驗方法，用花椒提取物對7種植物病原真菌進行抑菌活性的初篩，初篩的結(jié)果見表4。

表4 花椒總多酚提取物對7種植物病原真菌的抑菌率Table 4 The antibacterial rates of total polyphenol extracts from Zanthoxylum bungeanum Maxim. against seven plant pathogenic fungi

由表4可知，花椒總多酚對7種植物病原菌抑制率相對較小，對番茄灰霉菌的抑菌率相對較高，達到73.81%。

2.6 不同濃度花椒總多酚提取物對番茄灰霉菌的抑菌結(jié)果

表5 不同濃度總多酚對番茄灰霉素的抑菌率Table 5 The antibacterial rates of total polyphenols with different content against Botrytis cinerea

圖10 不同濃度總多酚對番茄灰霉菌的抑菌效果Fig.10 The antibacterial effect of total polyphenols with different content against Botrytis cinerea

采用不同濃度的花椒總多酚對番茄灰霉菌進行抑菌實驗，實驗結(jié)果表明花椒總多酚濃度與對番茄灰霉菌的抑菌率呈線性相關(guān)，可以得到線性回歸方程Y=1.1920X+3.2072，相關(guān)系數(shù)r=0.9539，EC50=31.91 mg/L，經(jīng)卡方檢驗，卡方值X2=0.294，其結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

通過Box-Behnken響應曲面法實驗，確定了花椒總多酚提取的最佳實驗條件：料液比為1∶40 (g/mL)，提取劑乙醇濃度為60%，所用的微波提取時間為60 s。在該優(yōu)化條件下進行實驗，80～100目花椒粉末，在微波功率為616 W時提取的多酚含量能夠達到63.11 mg/g。

通過活性初篩和穩(wěn)定性的實驗分析，得出花椒總多酚物質(zhì)對7種病原真菌的抑制率相對較小，其中花椒總多酚提取物對番茄灰霉菌的抑制率最高，為73.81%，達到50%以上。分析花椒總多酚對番茄灰霉菌穩(wěn)定性實驗結(jié)果，得到回歸方程是Y=1.1920X+3.2072，相關(guān)系數(shù)為0.9539，EC50=31.91 mg/L，經(jīng)卡方檢驗(X2=0.294，df=3，P>0.05)，其結(jié)果可靠。