王常高，杜馨，林建國，趙澤鑫，蔡俊

(湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068)

小龍蝦，又稱克氏原鰲蝦或淡水小龍蝦，不僅營養(yǎng)價值高，而且肉質鮮美、食用方式多樣，深受廣大消費者喜愛。近年來，小龍蝦的養(yǎng)殖和消費量都呈現(xiàn)不斷增長的趨勢，使得小龍蝦已經成為我國重要的經濟養(yǎng)殖品種[1-3]。然而，目前小龍蝦的可食用部分——蝦尾蛋白仁僅占整個蝦體重量的1/3，每食用或生產1噸的蝦仁將產生2～3噸的蝦頭蝦殼副產物。蝦頭蝦殼副產物以前直接扔掉，不僅浪費資源，且造成環(huán)境的污染，之后逐漸開始加以利用，早期只是將其簡單干燥粉碎后添加到各種飼料中，附加值不高[4]。后來利用酸堿等化學法從中提取甲殼素使其利用價值得到提升，但因新的環(huán)境污染而被限制使用[5]。

近年來，研究人員不斷嘗試利用各種發(fā)酵法、酶法、萃取法等生化方法來開發(fā)利用蝦頭蝦殼中的各種有效成分，既可減少環(huán)境污染，又可使資源得到充分利用[6]。蝦仁加工廠產生的蝦頭蝦殼等副產物中含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸、磷脂、蝦青素、甲殼素、礦物質等多種營養(yǎng)性和功能性有效成份[7-11]。將蝦仁加工廠余留的新鮮蝦頭蝦殼作為原材料，利用酶解或微生物發(fā)酵作用，可用來制備各種新型調味料，不僅具有良好的營養(yǎng)和增鮮調味作用，而且具有一定的功能性作用[12-15]。為提高蝦頭蝦殼中有效成分的利用率，本研究對蝦頭蝦殼功能性醬油釀造用菌種——米曲霉(滬釀3.042)進行了多次誘變選育，以提高其在以蝦頭蝦殼為主料的基質中的生長適應性和產酶水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

米曲霉(滬釀3.042)：本實驗室保藏菌種。

1.1.2 蝦頭蝦殼原料

潛江市熟制冷藏蝦仁加工廠提供的烘干蝦頭蝦殼粉碎產品(顆粒大小2～3 mm)，先用有機酸進行浸泡脫鈣處理，洗滌抽濾后于冰箱中保藏備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基：察氏酵母膏瓊脂(CYA)。

初篩用酪素平板培養(yǎng)基：A：Na2HPO4·7H2O 1.1 g，干酪素4 g，KH2PO40.36 g，MgSO40.05 g，酪素水解液0.3 mL，水1000 mL，瓊脂粉20 g；B：稱取 BaCl25 g用牛皮紙包好。將A與B分開滅菌后，在無菌條件下趁熱混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿內制成平板，于121 ℃滅菌 20 min。

復篩用固體培養(yǎng)基：脫鈣后的濕蝦頭蝦殼粉90 g，麩皮10 g，水50 mL，于121 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液制備

取保藏菌株接種于新鮮的斜面種子培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d，取兩環(huán)活化孢子于盛有玻璃珠和pH 7.0無菌磷酸緩沖液的三角瓶中，振蕩20 min，得單孢子懸液。懸液用血球計數(shù)板計數(shù)，調整孢子懸液濃度為106個/mL左右。

1.2.2 誘變處理方法

紫外線(UV)誘變：各取孢子懸液15 mL放入5個90 mm無菌玻璃平皿中，在磁力攪拌作用下，用紫外燈(30 W，40 cm)取不同時間分別進行照射處理，繪制UV的致死曲線。選取75%左右致死率的時間再進行孢子懸液誘變處理，適當稀釋后涂酪素平板。

硫酸二乙酯(DES)誘變處理：取經UV誘變篩選后所得變異菌株，用不同劑量的DES誘變處理，測定DES對變異菌株的誘變致死率，根據(jù)致死率選擇合適的DES誘變劑量處理變異菌株的孢子懸液，加25% Na2S2O3溶液中止誘變反應，將處理后的懸液適當稀釋后涂酪素平板。

1.2.3 變異菌株的篩選

酪素平板水解透明圈初篩法：將經過誘變處理后的孢子懸液進行不同程度稀釋后涂布于酪素平板，30 ℃培養(yǎng)3 d，從中選取分離好、透明圈大且清晰、孢子致密的菌落，用無菌牙簽取少量孢子再點種于酪素平板，30 ℃培養(yǎng)3 d，分別測定各個單菌落透明圈直徑和菌落直徑，計算 HC值。HC值=透明圈直徑/菌落直徑。選取HC值較大的菌株進行復篩。

固態(tài)發(fā)酵復篩法：將經過初篩后所得菌株的孢子懸浮液，分別接種于復篩固體培養(yǎng)基，攤開成1 cm的薄層在雙層紗布上，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中28 ℃、100%相對濕度(RH)條件下培養(yǎng)72 h，測定蛋白酶活力。選取蛋白酶活最高的菌株作為下一步誘變的出發(fā)菌株或作為生產菌株。

1.2.4 蛋白酶活力測定方法

采用Folin-酚法測定蛋白酶活力。

準確稱取鮮曲5 g加50 mL pH 7.2、0.2 mol/L磷酸緩沖液，將曲充分打散，于40 ℃水浴中恒溫浸提1 h，用定性濾紙過濾，得酶液。酶液用磷酸緩沖液進行適當稀釋后用Folin-酚法測其蛋白酶活，同時測定鮮曲水分含量。

蛋白酶活力單位定義：在40 ℃、pH 7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸的酶量為一個酶活力單位(U)。

2 結果與分析

2.1 UV誘變結果

2.1.1 UV誘變致死曲線

將經過不同時間UV誘變處理后的孢子懸浮液適當稀釋后涂布在CYA平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，根據(jù)平板上長出的菌落數(shù)與未經處理的平板上菌落數(shù)進行比較，計算各照射時間下的致死率，結果見圖1。

圖1 UV誘變致死曲線Fig.1 The lethality curve of UV mutation

一般認為，UV誘變在75%致死率時正突變率比較高。由圖1可知，照射時間為120 s時，該菌株的UV誘變致死率(76%)在75%左右，所以后面的誘變時間采用120 s。

2.1.2 UV誘變初篩結果

將米曲霉孢子懸液用紫外線照射120 s后，涂布于酪素平板上，選取15株單菌落分離好、透明圈大且清晰的菌落再點種在酪素平板，培養(yǎng)后測得各菌落的HC值為：原種1.32、U-11.37、U-21.45、U-31.36、U-41.62、U-51.73、U-61.71、U-71.56、U-81.33、U-91.67、U-101.78、U-111.43、U-121.82、U-131.72、U-141.58、U-151.69。

由實驗結果可知，挑選出的15株突變菌株的HC值都比出發(fā)菌株要大一些。為進一步驗證其產酶水平，從中挑選HC值最大的U-5、U-10、U-12和U-13進行固態(tài)發(fā)酵產酶。

2.1.3 UV誘變復篩結果

將經過UV誘變初篩挑選出的4株突變菌株和原種分別接種到復篩固體培養(yǎng)基進行發(fā)酵產酶，用Folin-酚法檢測其蛋白酶活，結果為：原種3128 U/g(干曲)、U-54836 U/g(干曲)、U-105261 U/g(干曲)、U-126749 U/g(干曲)、U-134904 U/g(干曲)。

由實驗結果可知，蛋白酶活最高的是U-12，這與初篩的結果基本是一致的。選取U-12作為出發(fā)菌株進行后面的DES誘變處理。

2.2 DES誘變結果

2.2.1 DES誘變致死率

取U-12孢子懸液各10 mL，分別加入不同劑量的DES醇溶液，以配制成0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%不同的終濃度，充分振蕩分散，于30 ℃振蕩處理2 h，分別加入5 mL 25% Na2S2O3溶液中止誘變反應。將處理后的懸液適當稀釋后涂CYA平板。與未經處理的U-12進行比較，根據(jù)平板上長出的菌落數(shù)計算出不同濃度下的致死率。結果為：0%的致死率0%，0.2%的致死率21%，0.4%的致死率58%，0.6%的致死率79%，0.8%的致死率93%，1.0%的致死率100%。

為防止U-12回復突變，同時為進一步提高其產酶水平，后面的誘變采用0.8%的高致死率劑量進行誘變處理。

2.2.2 DES誘變初篩結果

取U-12孢子懸液用0.8%的DES處理，適當稀釋后涂布于酪素平板，培養(yǎng)后選取12株單菌落分離好、透明圈大且清晰的菌落再點種于酪素平板，培養(yǎng)后分別測得各菌落的HC值為：U-121.80、UD-11.88、UD-21.86、UD-31.94、UD-41.85、UD-52.54、UD-62.23、UD-72.76、UD-81.90、UD-91.97、UD-101.88、UD-112.48、UD-12。

根據(jù)實驗結果，從中選取HC值最大的4株突變菌株UD-5、UD-6、UD-7、UD-11進行后面的固態(tài)發(fā)酵產酶復篩。

2.2.3 DES誘變復篩結果

將DES誘變初篩的4株突變菌株和U-12及原種的孢子懸液分別接種到復篩固體培養(yǎng)基進行發(fā)酵產酶，用Folin-酚法分別檢測其蛋白酶活，結果為：原種3436 U/g(干曲)、U-126693 U/g(干曲)、UD-59752 U/g(干曲)、UD-68920 U/g(干曲)、UD-711059 U/g(干曲)、UD-119327 U/g(干曲)。

由實驗結果可知，UD-7的蛋白酶活最高，干基酶活達到11059 U/g，比U-12和原種的蛋白酶活都有顯著提高。故后面選取UD-7突變菌株進行制曲及釀造工藝條件的優(yōu)化實驗研究。

2.3 UD-7遺傳穩(wěn)定性實驗

將UD-7共進行7次試管斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)，每傳代一次，將其孢子懸液接種至復篩固體培養(yǎng)基進行固態(tài)發(fā)酵產酶，用Folin-酚法分別檢測其蛋白酶活，結果為：第Ⅰ代11210 U/g(干曲)、第Ⅱ代11078 U/g(干曲)、第Ⅲ代11432 U/g(干曲)、第Ⅳ代10986 U/g(干曲)、第Ⅴ代11105 U/g(干曲)、第Ⅵ代11350 U/g(干曲)、第Ⅶ代11097 U/g(干曲)。

由實驗結果可知，經過7次傳代培養(yǎng)，UD-7的蛋白酶活水平都能保持在11000 U/g左右，沒有太大的變化，說明UD-7具有較好的遺傳穩(wěn)定性，這為后面的進一步研究及今后的工業(yè)化生產打下了良好的基礎。

3 結論

米曲霉(滬釀3.042)是我國醬油生產中廣泛應用的最經典生產菌種，在以豆粕、花生粕、麩皮等植物性蛋白為主要原料的基質上生長良好，產蛋白酶活水平高，生產轉化率高，醬油產品鮮香味濃郁[16-18]。本項目研究發(fā)現(xiàn)，米曲霉在以蝦頭蝦殼粉等動物性蛋白為主要原料的基質上長勢不太好，產蛋白酶活水平也不太高。為使該菌株適應蝦頭蝦殼粉等動物性蛋白生長環(huán)境，提高其產蛋白酶活水平，從而提高原料中蛋白質等有效成分的轉化利用率，先對米曲霉菌種進行了多輪的誘變選育。

通過UV誘變，得到了一株蛋白酶活較高的突變菌株U-12，其在以蝦頭蝦殼粉為主要原料的固體培養(yǎng)基上的蛋白酶產酶水平達到了6749 U/g(干曲)，比出發(fā)菌株滬釀3.042(3128 U/g)提高了116%。在U-12的基礎上再通過DES誘變，得到了一株蛋白酶活最高的突變菌株UD-7，其在以蝦頭蝦殼粉為主要原料的固體培養(yǎng)基上的蛋白酶產酶水平達到11059 U/g(干曲)，比U-12(6693 U/g)提高了65%，比出發(fā)菌株滬釀3.042(3436 U/g)提高了222%。通過7次傳代培養(yǎng)和固態(tài)發(fā)酵產酶，其產蛋白酶活水平變化幅度不大，說明其具有較好的遺傳穩(wěn)定性，這為后面的制曲和釀造研究過程打下了良好的基礎。